Article de méthode

Un modèle de souris pour évaluer réponse immunitaire innée à l’infection par Staphylococcus aureus

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DOI :

10.3791/59015

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28 février 2019

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1Department of Biomedical Engineering, University of California Davis, 2Department of Dermatology, Johns Hopkins University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Il est décrit une approche pour la détection en temps réel de la réponse immunitaire innée de blessures cutanées et Staphylococcus aureus infection des souris. Par comparaison LysM-EGFP souris (qui possèdent des neutrophiles fluorescents) avec un LysM-EGFP croisés souche de souris immunodéficientes, nous faire avancer notre compréhension de l’infection et l’élaboration d’approches pour lutter contre l’infection.

Résumé

Staphylococcus aureus Les infections (Staphylococcus aureus), y compris les taches résistantes à la méthicilline, sont un énorme fardeau sur le système de santé. Taux d’incidence de l’infection à Staphylococcus aureus grimper chaque année, il y a une demande de recherche supplémentaire dans son pouvoir pathogène. Modèles animaux de maladies infectieuses progresser notre compréhension de la réponse de l’hôte-pathogène et conduisent au développement d’agents thérapeutiques efficaces. Neutrophiles jouent un rôle primordial dans la réponse immunitaire innée qui contrôle les infections à S. aureus en formant un abcès pour mur au large de l’infection et faciliter la clairance bactérienne ; le nombre de neutrophiles qui infiltrent une infection de la peau de S. aureus souvent est corrélée avec le résultat de la maladie. Souris LysM-EGFP, qui possèdent la protéine fluorescente verte (EGFP) renforcée insérée dans la région promotrice de Lysozyme M (LysM) (exprimée principalement par les neutrophiles), lorsqu’il est utilisé en conjonction avec imagerie de fluorescence animaux in vivo (FLI) fournissent une moyens de quantifier émigration neutrophile non invasive et longitudinalement dans la peau blessée. Lorsqu’il est combiné avec un bioluminescentes S. aureus souche et séquentielle imagerie in vivo d’animaux bioluminescent (BLI), il est possible de surveiller longitudinalement la dynamique du recrutement neutrophiles et une charge bactérienne in vivo sur le site de infection chez la souris anesthésiés depuis le début de l’infection à la résolution ou la mort. Les souris sont plus résistants à un certain nombre de facteurs de virulence produites par Staphylococcus aureus qui facilitent la colonisation efficace et infection chez l’homme. Des souris immunodéficientes fournissent un modèle animal plus sensible afin d’examiner les persistants de S. aureus infections et la capacité d’agents thérapeutiques pour stimuler les réponses immunitaires innées. Dans les présentes, nous caractérisons les réponses chez les souris LysM-EGFP ont été élevées à des souris déficientes MyD88 (LysM-EGFP × MyD88-- souris/ ) ainsi que des souris de type sauvage LysM-EGFP pour enquêter sur S. aureus infection de plaie cutanée. Détection simultanée multispectrale activé étude de neutrophiles recrutement dynamique à l’aide de FLI in vivo, charge bactérienne à l’aide de BLI in vivo et la cicatrisation longitudinalement et non invasive au fil du temps.

Introduction

Staphylococcus aureus (S. aureus) représente la majorité des infections cutanées et des tissus mous (SSTIs) dans les États-Unis1. L’incidence méthicilline-résistant Staphylococcus aureus (MRSA), les infections a augmenté régulièrement pendant les dernières deux décennies2, motiver l’étude des mécanismes de persistance et de la découverte de nouvelles stratégies de traitement. La norme de soins pour les infections à SARM est une antibiothérapie systémique, mais SARM est devenu plus en plus résistante aux antibiotiques au fil du temps3 et ces médicaments peuvent diminuer le microbiome bénéfique de l’hôte, causant des effets négatifs sur la santé, surtout dans enfants4. Les études précliniques ont examiné des stratégies alternatives pour le traitement d’infections SARM5, mais traduire ces approches à la clinique s’est avérée difficile en raison de l’émergence de facteurs de virulence qui contrecarrent l’hôte des réponses immunitaires6. Pour disséquer la dynamique de l’hôte-pathogène qui animent SSTIs de S. aureus , nous combinons non invasive et afficheurs longitudinales du nombre de neutrophiles recrutement pour le lit de la plaie avec des mesures cinétiques d’abondance bactérienne et plaie zone.

Les neutrophiles sont les leucocytes circulant plus abondant chez les humains et les premiers intervenants à une infection bactérienne7. Les neutrophiles sont une composante nécessaire pour une réponse de l’hôte efficace contre le Staphylococcus aureus infections en raison de leurs mécanismes bactéricides, y compris la production d’espèces réactives de l’oxygène, des protéases, des peptides antimicrobiens et des réponses fonctionnelles y compris la phagocytose et neutrophiles piège extracellulaire production8,9. Les patients humains avec des défauts génétiques en fonction de neutrophile, comme maladie granulomateuse chronique et le syndrome de Chediak-Higashi, montrent une sensibilité accrue aux infections de S. aureus . En outre, les patients avec génétiques (par exemple, neutropénie congénitale) et acquises (par exemple de neutropénie chez les patients de chimiothérapie) défauts en nombre de neutrophiles sont également très sensibles à S. aureus infection10. Compte tenu de l’importance des neutrophiles dans la guérison d’infections à S. aureus , renforçant leurs capacités immunitaires ou réglage leur nombre au sein d’une lésion de S. aureus peut s’avérer une stratégie efficace dans la résolution de l’infection.

Au cours de la dernière décennie, les souris transgéniques avec des journalistes de neutrophiles fluorescence ont été développés pour étudier leur trafic de11,12. Combinant souris journaliste neutrophiles animaux techniques d’imagerie permet l’analyse spatio-temporelle des neutrophiles dans les tissus et organes. Lorsqu’il est combiné avec des souches bioluminescentes de S. aureus, il est possible de suivre l’accumulation de polynucléaires neutrophiles en réponse à l’abondance de S. aureus et de persistance dans le contexte de la virulence bactérienne des facteurs qui directement et indirectement perturber le nombre de neutrophil dans tissu atteint13,14,15,16.

Les souris sont moins sensibles aux mécanismes de S. aureus virulence et immunitaire d’évasion que les humains. Ainsi, souris de type sauvage peuvent ne pas être un modèle animal idéal pour étudier l’efficacité d’une donnée thérapeutique pour traiter les chroniques de S. aureus infection. MyD88-deficient mice (c.-à-d. MyD88- / - souris), une souche de souris immunodéprimées qui n’a pas de récepteurs fonctionnels interleukine 1 (IL-1R) et récepteur Toll-like (TLR) de signalisation, voir la plus grande susceptibilité à l’infection par Staphylococcus aureus , par rapport à souris de type sauvage17 et une altération dans le trafic de neutrophiles vers un site d’infection à S. aureus dans la peau de18. Développement d’une souche de souris qui possède un journaliste neutrophil fluorescent MyD88- / - souris a fourni un modèle alternatif pour enquêter sur l’efficacité des thérapies pour traiter l’infection de S. aureus par rapport à l’actuel neutrophile souris de journaliste.

Dans ce protocole, nous caractériser infection à Staphylococcus aureus dans les LysM-EGFP × MyD88- / - des souris immunodéprimées et comparer l’évolution temporelle et la résolution de l’infection par les souris LysM-EGFP. LysM-EGFP × MyD88- / - souris développent une infection chronique qui ne se résout pas, et 75 % succombent à une infection après 8 jours. Un défaut important de recrutement initial de neutrophil produit sur une période de 72 h de la phase inflammatoire de l’infection, et moins de 50 % de polynucléaires neutrophiles recruter au cours de la dernière étape de l’infection. La sensibilité accrue du × LysM-EGFP MyD88 souris- / - cela rend notamment la souche un modèle préclinique rigoureux pour évaluer l’efficacité des nouvelles techniques thérapeutiques ciblant les S. aureus infection par rapport à l’actualité des modèles utiliser la souris de type sauvage, en particulier les techniques visant à stimuler la réponse immunitaire innée contre l’infection.

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Protocole

Toutes les études sur les souris ont été examinés et approuvés par le Comité de l’urbanisme à UC Davis et d’institutionnels animalier et ont été effectuées conformément aux directives de la loi sur la protection des animaux et de la santé recherche Extension Act. N’oubliez pas d’utiliser des gants stériles lorsque vous travaillez avec des animaux.

1. la souris Source et logement

  1. LysM-eGFP souris sur un fond génétique C57BL/6J de dériver comme décrit plus haut12. Dériver de LysM-EGFP × MyD88- / - souris en traversant des souris LysM-EGFP MyD88- / - souris sur un fond de C57BL/6J.
  2. Souris domestiques dans un vivarium. Pour ces études, les animaux était logés à l’Université de Californie, Davis dans les groupes avant la chirurgie et unique logée après une chirurgie. Utilisez la souris âgés de 10 à 16 semaines.

2. quantification et préparation bactérienne

  1. Supprimer la bioluminescence souche de Staphylococcus aureus d’intérêt de stockage de-80 ° C à fondre sur la glace. Rayure sur une plaque de gélose au sang bovin de 5 %. Incuber la plaque striée dans un incubateur humidifié à 37 ° C pendant la nuit (16 h).
    Remarque : Dans le présent protocole, la souche ALC2906 SH1000 a été utilisée. Cette souche contient le pSK236 de plasmide de navette avec le promoteur de la protéine se liant à la pénicilline 2 fusionné à la cassette de journaliste luxABCDE de luminescens Photohabdus18.
  2. Préparer bouillon trypticase soja (TSB) en mélangeant 0,03 g de poudre de BST par mL d’eau pure et autoclave BST pour stériliser. Lorsque refroidi, ajouter des antibiotiques nécessaires en utilisant une technique stérile. Dans ce protocole, ajouter 10 µg/mL de chloramphénicol18 au BST pour sélectionner pour l’expression du plasmide pSK236 navette, qui contient la cassette de luxABCDE de bioluminescence.
  3. Choisir 3-4 colonies distinctes de la plaque de S. aureus dans BST avec du chloramphenicol 10 µg/mL pour commencer une culture au jour le jour. Incuber les bactéries dans un agitateur en incubation à 37 ° C pendant la nuit (16 h).
  4. Démarrez une nouvelle culture bactérienne de la culture au jour le jour par dilution d’un échantillon 01:50 dans BST avec du chloramphenicol 10 µg/mL. Culture dans un shaker en incubation à 200 tr/min et 37 ° C.
  5. Deux heures après le fractionnement du S. aureus, surveiller la densité optique à 600 nm (OD600) sur un spectrophotomètre. Observer l' OD600 vs temps de trouver le milieu-logarithmique phase de croissance. Pour la souche ALC2906 SH1000, une OD600 de 0,5 est mi-logarithmique et correspond à une concentration de 1 x 108 UFC/mL (Figure 1).
  6. Quand OD600 est de 0,5, laver les bactéries 1:1 avec SPD glacée. Centrifuger les bactéries pendant 10 min à 3 000 x g et 4 ° C. Soigneusement, éliminer le surnageant et ajouter supplémentaires SPD réfrigérés et vortex soigneusement. Centrifuger à nouveau pour 10 min à 3 000 x g et 4 ° C.
  7. Éliminer délicatement le surnageant. Resuspendre le culot bactérien à la concentration désirée. Pour ces études, recueillir 3 mL de ALC2906 SH1000 et resuspendre dans 1,5 mL de PBS, corrélées à une concentration de bactéries d’environ 2 x 108 UFC/mL. Conservez les bactéries sur la glace jusqu'à utilisation.
  8. Pour vérifier la concentration de bactéries, diluer 100 µL de l’échantillon bactérienne 1/10 000 et 1/100 000 dans du PBS. Plaque de 20 µL d’extraits sur une gélose. Incuber à 37 ° C dans un incubateur humidifié pendant 16 h. comte UFC par examen brut et calculer une concentration bactérienne le lendemain.

3. Wounding excision de peau et de l’Inoculation par S. aureus

  1. Administrer 100 µL de chlorhydrate de buprénorphine 0,03 mg/mL (~0.2 mg/kg) pour chaque souris par injection intrapéritonéale.
  2. Vingt minutes après l’injection, place 2-4 souris dans une chambre avec l’oxygène de 2 à 3 l/min à l’isoflurane 2 à 4 %. Une fois que les souris sont complètement anesthésiés, transférer les souris un à la fois à un cône de nez relié à l’oxygène de 2 à 3 l/min à l’isoflurane 2 à 4 %. Vérifiez la souris sont complètement anesthésiés en pinçant fermement chaque patte arrière entre un pouce et l’index. Passez à l’étape suivante si l’animal ne répond pas à la pincée.
  3. Raser un 1 pouce par section de 2 pouces à l’arrière de la souris avec une tondeuse électrique et nettoyer la zone des coupures de fourrure à l’aide d’un chiffon propre ou une gaze. Évitez d’utiliser la lotion dépilatoire car il peut provoquer une inflammation excessive.
  4. Nettoyer l’arrière de la souris tout d’abord avec de la gaze 10 % povidone-iode imbibé, puis avec un éthanol à 70 % trempé gaze. Nettoyez la zone en forme de spirale, se déplaçant vers l’extérieur du centre de la zone chirurgicale. Attendre environ 1 minute pour la zone chirurgicale à sécher avant la chirurgie.
  5. Tenez le rasé l’arrière de la souris sans serrer entre deux doigts et presser fermement une biopsie à l’emporte-pièce stérile 6 mm au centre de la zone chirurgicale préparée. Ne pas tirer la peau tendue.
    1. Tordre la biopsie à l’emporte-pièce pour créer un contour circulaire sur la peau qui traverse entièrement la peau au moins une section de l’esquisse. Veillez à ne pas découper le carénage ou le tissu sous-jacent.
    2. Utilisez des ciseaux stériles et pinces pour couper à travers l’épiderme et du derme, suivant le modèle circulaire apposé par la biopsie à l’emporte-pièce.

4. S. aureus Inoculation

  1. Remplissez une seringue à insuline 28 G avec l’inoculant bactérie bioluminescente désirée. Dans cette étude, administrer une concentration de 1 x 108 UFC/mL (50 µL). Ne pas administrer plus de 100 µL de volume.
  2. Injecter 50 µL d’inoculant entre le fascia et les tissus dans le centre de la plaie à l’arrière de la souris. Veiller à ce que l’inoculant forme une bulle au centre de la plaie avec minimiser les fuites ou dispersion.
    1. Tirer le derme vers le côté, tenez la seringue presque parallèle au tissu et pousser lentement la seringue dans le tissu jusqu'à ce qu’une diminution brusque de résistance se fait sentir, ce qui indique le piercing du fascia. Attentivement conduire la seringue dans le centre de la plaie et distribuer l’inoculant lentement. Retirer la seringue lentement de l’animal.
  3. Injecter le même volume de PBS stérile dans la plaie des animaux infectés, comme décrit ci-dessus.
  4. Retourner l’animal de sa cage. Placez la cage sous une lampe de chaleur ou sur un coussin chauffant et surveiller l’animal jusqu'à la guérison de l’anesthésie.

5. en Vivo BLI et FLI

  1. Initialiser l’imageur animaux via le logiciel de l’instrument. Anesthésier la souris dans une chambre, réception d’oxygène de 2 à 3 l/min à l’isoflurane 2 à 4 %. Livrer l’anesthésie à le nosecones à l’intérieur de l’imageur.
  2. Placez la souris blessée et infectée dans l’imageur. Positionnez la souris tels que la plaie est aussi plate que possible. Utiliser les réglages de séquence suivant à l’image des souris.
    1. Sélectionnez la Luminescence et photographier comme mode d’imagerie. Le temps d’exposition est de 1 min à petite binning et F/stop 1 (luminescence) et arrêt de F/8 (photo). Le filtre d’émission est ouvert. Cliquez sur le bouton acquérir pour enregistrer l’image.
    2. Sélectionnez la Fluorescence et la photographie comme mode d’imagerie. Le temps d’exposition est de 1 s à petit binning et F/stop 1 (Fluorescence) et arrêt de F/8 (photo) avec une longueur d’onde d’excitation de 465/30 nm et une émission de longueur d’onde 520/20 nm avec une intensité haute lampe. Cliquez sur le bouton acquérir pour enregistrer l’image.
  3. Retour l’animal dans sa cage et le moniteur jusqu'à de l’anesthésie.
  4. Image des souris tous les jours tel que décrit ci-dessus.

6. image Analysis

  1. Ouvrir les images à quantifier.
  2. Placer une grande région circulaire d’intérêt (ROI) sur la zone de toute plaie, y compris la peau de chaque souris dans l’image environnante. Les signaux BLI S. aureus in vivo et des neutrophiles in vivo que FLI EGFP signaux dépassent le bord de la plaie après plusieurs jours et ont été inclus dans ces études (Figure 2 a et 2 b). Cliquez sur le ROI de la mesure et des valeurs Records pour un flux moyen pour chaque souris. Tracer le flux moyen de chaque signal (p/s) par rapport à la durée.
  3. Si vous désirez un nombre absolu de neutrophiles ou S. aureus dans la plaie, réaliser les expériences suivantes.
    1. Pour établir une corrélation entre le nombre de neutrophiles aux signaux FLI EGFP in vivo, plaie de souris C57BL/6J comme décrit ci-dessus et transférer une gamme des dérivés de la moelle osseuse des neutrophiles (5 x 105 à 1 x 10-7) de LysM-EGFP ou LysM-EGFPxMyD88- / - donateurs directement sur le dessus de différentes blessures. Image telle que décrite ci-dessus et de corréler l’EGFP FLI in vivo des signaux à la quantité connue des neutrophiles.
    2. Pour mettre en corrélation s.doré UFC pour les signaux BLI in vivo, enroulé et infecter des souris comme décrit ci-dessus. Le 1er jour après l’infection record in vivo BLI signaux provenant des souris et immédiatement euthanasier et refroidir les carcasses. La plaie de l’accise, homogénéiser le tissu et plaque bactériennes dilutions sur gélose pour l’incubation durant la nuit. Le lendemain, compter les colonies afin de déterminer l’UFC par blessure.
  4. Pour mesurer la plaie guérison fit un retour sur investissement circulaire sur le bord de la plaie et mesure la zone de la plaie (cm2) et tracer le changement fractionnaire de base en fonction du temps (Figure 2).

7. les statistiques

Remarque : Toutes les données sont présentées en moyenne ±ét. p < 0,05 étaient considérés comme statistiquement significatifs

  1. Déterminer les différences entre les deux groupes en un seul jour à l’aide de la méthode Holm-Sidak, avec alpha = 0,05 et analyser chaque instant individuellement, sans pour autant assumer une SD compatible
  2. Comparer les différences entre plusieurs groupes le même jour par ANOVA à avec le post-test de comparaisons multiples Tukey. La survie entre les groupes expérimentaux a été analysée par la méthode de Mantel-Cox.

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Résultats

LysM-EGFP × MyD88- / - souris sont plus sensibles à l’infection par Staphylococcus aureus que souris LysM-EGFP

La souche Staphylococcus aureus utilisée dans cette étude, ALC290618, a été construit avec un plasmide contenant la construction lux qui produit des signaux bioluminescentes de bactéries vivantes et activement métabolisants. Lorsqu’il est inoculé à des ...

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Discussion

Modèles d’infection de S. aureus qui utilisent la bioluminescence S. aureus infection chez une souris journaliste neutrophiles fluorescent en conjonction avec des techniques avancées d’imagerie optique in vivo animaux ont fait progresser notre connaissance de l’inné réponse immunitaire à l’infection. Des études antérieures à l’aide de la souris LysM-EGFP ont montré que vers le haut à 1 x 107 neutrophiles recrue d’une plaie infectée de Staphylococcus aureus dans les premières 24 heure...

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Déclarations de divulgation

Lloyd S. Miller bénéficie du soutien de la subvention de MedImmune, Pfizer, Regeneron et le Chan Soon-Gilles Nanthealth Foundation et frais de consultation de Noveome Biotherapeutics et la fondation de Nanthealth Chan Soon-Gilles qui ne sont pas liés aux travaux déclaré dans cet article. Les autres auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la National instituts de santé subventions R01 AI129302 (à S.I.S.) et le programme de formation en pharmacologie : du laboratoire au patient à UC Davis (NIH T32 GM099608 à la plaque). Le moléculaire et imagerie génomique (CMGI) à l’Université de Californie à Davis fourni un appui technologique superbe.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
14 mL Tube à fond rond en polypropylèneFalcon352059
Poinçon de biopsie jetable de 6 mmIntegra Miltex33-36
Bioluminescent S. aureusLloydMiller, Johns Hopkins  ;ALC 2906 SH1000
Gélose au sang bovin, 5 %, Hardy DiagnosticsVWR10118-938
Chlorhydrate de buprénoprhine injectableWestern Medical Supply72920,3 mg/mL
C57BL/6J SourisJackson Labratory000664
Chloramphénicol (poudre cristalline)Fisher BioReagentsBP904-100
DPBS (1x)Gibco  ;14190-144
Seringues à insulineBecton, Dickson and Company3294610,35 mm (28 G) x 12,7 mm (1/2'')
Système d’imagerie in vivo IVIS SpectrumPerkin Elmer124262
Living Image Software &ndash ; Série IVIS SpectrumPerkin Elmer128113
LysM-eGFP SourisThomas Graff Albert Einstein College de New York  ;
NA Spectrophotomètre microvolumeThermoFisher ScientificND-2000
MyD88 KO SourisJackson Labratory009088
Éponges non tisséesAMD- Ritmed IncA2101-CH5 cm x 5 cm
Povidone Iode 10 % SolutionAplicare697731
Prism 7.0GraphPad SoftwareLicense  ;
Bouillon de soja tryptiqueBecton, Dickson and Company211825

Références

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Mots-clés

Recrutement des neutrophilesimagerie in vivosouris LysM EGFPknockout MyD88imagerie bioluminescenteimagerie de fluorescenceanalyse de la cicatrisation des plaiesmesure de la charge bact rienne

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