Article de méthode

Une méthode axée sur la Fluorescence pour étudier la régulation des gènes bactériens dans les tissus infectés

DOI :

10.3791/59055

⸱

19 février 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Georgetown University

Dans cet article

Résumé

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Décrite ici est une méthode permettant d’analyser l’expression des gènes bactériens dans les tissus animaux au niveau cellulaire. Cette méthode fournit une ressource pour étudier la diversité phénotypique survenant dans une population bactérienne en réponse à l’environnement tissulaire lors d’une infection.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les gènes de virulence bactérienne sont souvent réglementés au niveau transcriptionnel par de multiples facteurs qui répondent aux différents signaux environnementaux. Certains facteurs agissent directement sur les gènes de virulence ; d’autres contrôlent la pathogénie en ajustant l’expression des régulateurs en aval ou l’accumulation de signaux qui affecte l’activité de l’organisme de réglementation. Alors que le règlement a été largement étudiée au cours de la croissance in vitro , on connaît relativement comment l’expression des gènes est ajustée au cours de l’infection. Ces informations sont importantes lorsque le produit d’un gène particulier est un candidat pour une intervention thérapeutique. Transcriptionnels approches comme la RT-PCR quantitative, en temps réel et RNA-Seq sont de puissants moyens pour étudier l’expression des gènes au niveau mondial, mais souffrent de nombreux défis techniques, y compris de faible abondance d’ARN bactérien par rapport à l’hôte ARN et échantillon dégradation par les RNases. Évaluation de règlement à l’aide de reporters fluorescents est relativement facile et peut être multiplexé avec des protéines fluorescentes ayant des propriétés spectrales uniques. La méthode permet une analyse unicellulaires, spatio-temporelle de l’expression génique dans les tissus qui présentent des dégradés architecture et physiochimiques tridimensionnelles complexes qui influent sur les réseaux de régulation bactériens. Ces informations sont perdues lorsque les données sont en moyenne sur la population en vrac. Ici, on décrit une méthode pour la quantification de l’expression de gène dans les bactéries pathogènes in situ. La méthode repose sur le traitement de tissus simples et l’observation directe de la fluorescence des protéines de journaliste. Nous démontrent l’utilité de ce système en examinant l’expression de Staphylococcus aureus Thermonucléase (nuc), dont le produit génique est requis pour évasion immunitaire et virulence complet ex vivo et in vivo. Nous montrons que nuc-gfp est fortement exprimé dans les abcès rénales et révéler l’expression des gènes hétérogène due en partie à apparent règlement spatiale de l’activité de promoteur nuc en abcès pleinement engagée avec la réponse immunitaire. La méthode peut être appliquée à toute bactérie avec un système génétique balayages et de n’importe quel modèle d’infection, fournir des informations précieuses pour les études précliniques et développement de médicaments.

Introduction

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Bactéries répondent à l’évolution des conditions physiologiques et les modifications de l’état nutritionnel de leur environnement de façon différentielle exprimant des gènes nécessaires à l’adaptation et la survie. Par exemple, des agents pathogènes opportunistes colonisent les corps des surfaces à relativement faible densité et sont souvent inoffensifs. Cependant, une fois que la bactérie a pénétré les barrières physiques et chimiques, il doit composer avec Counter-défenses des cellules immunitaires de l’hôte et de la disponibilité restreinte des nutriments1. À titre d’exemple, Staphylococcus aureus colonise environ le tiers de la population de façon asymptomatique, mais est également la cause de dévastateur de la peau et des tissus mous, ostéomyélite, endocardite et bactériémie2. Le succès S. aureus comme un pathogène est souvent attribué à sa flexibilité métabolique, mais aussi un arsenal de facteurs de virulence de surface associées et sécrétées qui permettent à la bactérie d’échapper à la circulation sanguine et se répliquer dans les tissus périphériques 3,4,5. Parce que l’hôte mort due à une maladie staphylococcique est une impasse évolutive et la transmission de limites aux nouveaux hôtes6, l’engagement à la production de facteur de virulence doit être soigneusement contrôlée.

Un réseau complexe de réglementation des protéines et répond d’ARN non codants à une variété de stimuli environnementaux, y compris de cellules densité, phase de croissance, facteurs associés à neutrophile et disponibilité des nutriments, pour s’assurer que les gènes de virulence sont exprimées à la heure exacte et l’emplacement au sein de l’hôte tissus7,8,9,10,11,12,13. Par exemple, le système à deux composants SaeR/S (TCS) régule l’expression de plusieurs facteurs de virulence par la kinase de capteur (SaeS) et la réponse régulateur (SaeR)14. SaeS est autophosphorylated sur un résidu histidine conservée en réponse à l’hôte des signaux (par exemple, human neutrophiles peptides [HNPs], calprotectine)8,15,16. Le groupe phosphoryle est ensuite transféré dans un résidu aspartate sur SaeR, activant ce dernier comme une protéine de liaison à l’ADN (SaeR ~ P)17. Le SDC SaeR/S réglemente plus de 20 gènes qui contribuent à la pathogénèse, y compris les protéines de liaison de la fibronectine (FnBPs), leukocidins et staphylocoques à coagulase14,18,19,20. Cibles peuvent être classées en haute affinité et de faible affinité gènes cibles, qui sont probables induit que le niveau de SaeR ~ P augmente lorsqu’ils sont exposés à ses repères21. L’activité de SaeR/S est contrôlée par les autres organismes de réglementation de l’expression des gènes tels que le système de détection de quorum Agr, répresseur de protéine de toxines (Rot) et l’autre facteur sigma B (SigB)22,23,24.

NUC est un gène de virulence de Sae-dépendante chez Staphylococcus aureus et encode la Thermonucléase (Nuc), qui est essentiel pour échapper à neutrophilic emi tpa (filets) et pour la diffusion au cours de la cours de l’infection de25,26. L’expression du nuc est également fortement indirectement réprimée par CodY en présence d’acides aminés à chaîne ramifiée et GTP27et directement réprimée par la protéine staphylococcique accessoires régulateur SarA28,29 , dont l’activité est influencée par l’oxygène (état d’oxydoréduction) et pH30. Étant donné que les mutants sae et nuc sont atténués dans les modèles de souris de l’infection, il y a intérêt à développer des interventions chimiques qui inhibent leur correspondant activités26,31. Malgré cela, il n’y a aucune information au sujet de leur règlement au cours de l’infection.

Fluorescents reporters ont été utilisés pour surveiller et quantifier l’expression des gènes au niveau de la cellule unique. Ici, nous présentons une méthode de quantification de la S. aureus l’expression des gènes au cours de l’infection qui, lorsqu’il est associé avec analyse du transcriptome in vitro et puissantes techniques d’imagerie comme l’imagerie par résonance magnétique (IRM) et la spectroscopie par résonance magnétique (SRM), peuvent révéler comment bactérienne la physiologie est réglementée in vivo et l’abondance relative des éléments nutritifs dans certains créneaux. La méthode peut être appliquée à toute bactérie pathogène avec un système génétique tractable.

Vue d’ensemble du vecteur génomique intégrative.

La génomique intégrative vecteur pRB4 contient 500 paires de bases chaque des régions en amont et en aval de la pseudogène USA300 de Staphylococcus aureus SAUSA300_0087 pour faciliter la recombinaison homologue. pRB4 est dérivé de l’épine dorsale le vecteur thermosensibles pMAD contenant la cassette de résistance à l’érythromycine (ermC) et bêta-galactosidase thermostable gène bgaB pour le dépistage de bleu/blanc de recombinants32. La journaliste ingénierie construction contient également un marqueur de résistance de chloramphénicol (cat) pour la sélection après l’intégration du génome et élimination de plasmide, ainsi que des sites EcoRI et SmaI à fusionner la région régulatrice d’intérêt au vert superfolder protéine fluorescente (sGFP) (Figure 1). On sait que le choix du site de liaison du ribosome (RBS) influe sur l’activité du reporter et exige souvent empiriques optimisation33. Ainsi, un RBS n’est pas fourni. Ici, le site de fixation du ribosome native est utilisé pour fournir un modèle plus naturel de l’expression des gènes, mais les autres sites peuvent être utilisés.

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Protocole

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Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Georgetown.

1. génération de la souche de journaliste Fluorescent

  1. Digérer le vecteur d’intégration pRB4 génome séquentiellement avec les enzymes de restriction EcoRI et SmaI. Suivant le protocole du fabricant, mis en place une digestion au jour le jour avec la SmaI à l’aide de 1 µg de pRB4 à 25 ° C et ensuite procéder à la seconde digestion pendant 1h à 37 ° C en ajoutant EcoRI au mélange réactionnel. Inactiver les enzymes en incubation à 65 ° C pendant 20 min.
  2. PCR amplifier la région régulatrice de l’intérêt de l’ADN génomique (dans ce cas, un paire de base ~ 350 fragment d’ADN contenant la région promotrice de Thermonucléase [nuc]), intégrant un 5' site de restriction EcoRI et un site de restriction de SmaI 3'. La séquence de reconnaissance SmaI doit être dans le cadre avec le codon de départ. Dans cette étude, la PCR a été réalisée en utilisant une ADN polymérase de haute fidélité selon les recommandations du fabricant avec apprêt avant oRB015 (5'-atcattgaattctccaaagtaaattataagttatac-3') et inverse (apprêt) oRB016 5'-gggcataactaacacctctttctttttag-3'). La température de recuit a 53 ° C. Purifier le fragment résultant à l’aide d’un kit de nettoyage PCR suivant les instructions du fabricant.
  3. Digérer le produit résultant de la PCR avec EcoRI et SmaI interprété à l’étape 1.1 et ligaturer le fragment d’ADN digéré pour les mêmes sites de pRB4 à l’aide de T4 DNA ligase tel que recommandé par le fabricant pour générer la construction intégrative. Introduire le mélange de ligation dans e. coli et confirmer la séquence de la construction.
  4. Electroporate la construction en souche de S. aureus RN4220 comme décrit précédemment34. En bref, utiliser 1 µg de plasmide avec 70 µL de cellules capables d’electro (Ω 100, 25 µF et 2,3 kV) dans un bouillon de B2 (hydrolysat de caséine de 1 % [p/v], extrait de levure 2,5 % [p/v], 2,5 % [p/v] NaCl, 0,1 % [p/v] K2PO4, 0,5 % [p/v] Glucose). Sélectionner pour la résistance à l’érythromycine (Emr) à la température permissive (30 ° C) sur la gélose trypticase soja (TSA) additionnée de l’érythromycine (5 µg mL-1) et 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal ; 80 µg mL-1). Les transformants qui en résultent sont bleus en raison de l’activité β-galactosidase plasmidique codée.
    Remarque : Transfert d’ADN dans des isolats cliniques est extrêmement difficile en raison d’une forte restriction-modification barrière35. Ainsi, RN4220 de S. aureus a été utilisé comme bénéficiaire intermédiaire de la construction de fusion parce qu’il y a restriction déficiente et hautement transformable.
  5. Transfert plasmidique à souche USA300 de Staphylococcus aureus d’intérêt à l’aide d’électroporation ou induite par le phage transduction36 à la température permissive. En bref, propager bactériophage de11 Φ des particules sur la souche du donneur à l’aide de plaques TSA contenant 5 mM CaCl2 à 30 ° C la nuit et puis stérilisent par filtration à travers un filtre seringue en acétate de cellulose 0,45 µM. Lysats permet de transduce souche de Staphylococcus aureus LAC Emr.
    Remarque : LAC est un isolat clinique largement utilisé qui a été précédemment effectué Em sensibles par serial passage dans le milieu du BST pour guérir la souche de la pUSA03 native plasmide qui confère Emr 37,38.
  6. Intégrer la construction par deux, événements de recombinaison homologue successives dans le chromosome comme décrit plus haut32. Les recombinants sont résistant au chloramphénicol (Cmr) sur des plaques TSA contenant 5 μg mL-1 de chloramphénicol, sensibles à l’érythromycine (Erms) et pas plu bleu.
    Remarque : Lorsque cela est possible, réintroduire la fusion marquée en USA300 via induite par le phage transduction pour éviter l’accumulation de mutations associées à in vitro de la souche passage quarts de39 et de la température.

2. animal de l’Infection : Préparation de l’Inoculum, Infection systémique et le traitement de tissus

  1. Préparation de l’inoculum bactérien
    1. Ensemencer des souches de Staphylococcus aureus d’intérêt pour l’isolement sur géloses au sang provenant d’un stock de glycérol congelés. Incuber à 37 ° C pendant 16 à 24 h confirmer des phénotypes hémolytiques basés sur leur capacité à lyser les globules rouges (hématies) et forme claire des zones transparentes.
    2. Initier les cultures une nuit ou pluss en inoculant des colonies individuelles de chaque souche jusqu'à 4 mL de bouillon trypticase soja (TSB) dans des tubes de verre stériles. Faire pivoter les tubes à 37 ° C pendant 16 à 24 h dans un rouleau tube, fixé à environ un angle de 70° et 70 tours par minute [tr/min].
    3. Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer la densité optique à 600 nm (OD600) des cultures de l’étape 2.1.2. Utilisez milieu stérile comme une référence optique (vide). Diluer ces cellules à une OD600 de 0,05 à 25 mL de stérile Trypticase soja bouillon (BST) dans séparé, 125 mL DeLong flacons (flacon de 5:1 ratio volume) et incuber les cultures dans un bain d’eau (pour le transfert de la chaleur appropriée aux cultures), secouant à 280 tr/min et réglé à 37 ° C.
      Remarque : La croissance de l’inoculum peut être effectuée de différentes façons ; une méthode pour cultiver des cellules de phase exponentielle est présentée. Malgré tout, il est important de toujours utiliser la même méthode pour la préparation des cellules pour l’inoculation.
    4. Une OD600 de ~ 1, re-diluer les cellules dans un milieu frais à un départ de l’OD600 de 0,05 à s’assurer que les cellules de réaliser la phase exponentielle et que les facteurs qui s’accumulent durant l’incubation durant la nuit ont été réduits à des niveaux de phase exponentielle.
    5. Récolter les cellules au cours de la phase exponentielle (OD600 ~0.6–0.8) par centrifugation à 3 000 x g pendant 10 min à température ambiante.
    6. Laver les granules deux fois dans un volume équivalent de stérile 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4).
    7. Suspendre les cellules dans du PBS 1 x (pH 7,4) à une concentration de 1 x 108 colonies formant des unités (UFC) mL-1 ou selon qu’il conviendra pour le souhaité expérimenter.
      Remarque : il est important de déterminer la relation entre OD600 et CFU mL-1 pour chaque souche d’intérêt parce que les altérations liées à la souche de la forme et la taille des cellules peuvent affecter les propriétés de diffusion de la lumière et au bout du compte, la dose d’infection.
  2. Préparation des animaux et des infections bactériennes
    1. Acclimater souris pendant 7 jours sur régime purifié AIN-93. La diète est formulée pour assurer une nutrition adéquate tout en réduisant le tissu auto-fluorescence associé à la consommation d’ingrédients à base de plantes utilisés en souris standard chow40.
      Remarque : Les souris C57/BL6 femelles (6-8 semaines) sont utilisés ici, mais la souche de souris et le sexe dépendra de l’étude.
    2. Avant l’infection, dilater les veines de queue de souris à l’eau tiède.
    3. Infecter les animaux par injection 100 µL de l’inoculum bactérien par queue-veines de produire une infection systémique. Enregistrer une partie aliquote de l’inoculum initial si vous effectuez la cytométrie en flux (voir la Section 4).
    4. Suivi des animaux par jour et d’évaluer leur état de santé à l’aide d’un système de contrôle révisés et approuvés par l’animalier institutionnel et Comité d’urbanisme.
    5. Permettre à l’infection au progrès, pour la durée désirée. Ici, les essais sont terminés 3 jours après l’infection.
      Remarque : Dans ces conditions, les abcès se composent d’une communauté d’abcès staphylococcique de bactéries, délimitée par des dépôts de fibrine et entouré par des couches concentriques de cellules immunitaires5,41.
  3. Récolte les organes et le traitement de tissus
    1. Euthanasier les animaux par l’inhalation de CO2 et de la dislocation cervicale comme méthode secondaire et effectuer l’autopsie.
    2. Récolter les reins (à droite) et autres organes vitaux (poumons coeur, foie, rate) et transférer dans 15 mL tubes en polypropylène contenant du formol 10 % [v/v] mis en mémoire tamponné. Aller de l’avant avec ces organes à l’étape 2.3.4 ci-dessous.
    3. Transférer le rein gauche dans un tube résistant aux chocs de stériles de 2 mL, contenant environ 500 µL de perles de silice de 2 mm et 1 mL stérile 1 x PBS (pH 7,4). Passer avec cet organe au point 4.2.
    4. Permettre aux organes de l’étape 2.3.2 de fixer dans l’obscurité à température ambiante avec agitant doucement ou de rotation au moins 24 heures, mais pas plus de 48 heures.
    5. Incorporer les organes dans le tissu clair moyen de congélation et stocker les tissus à-80 ° C.
    6. En utilisant un cryostat, tissu de section en tranches de 10 µm d’épaisseur.
    7. Les sections sur une lame de verre préalablement nettoyé, chargé pendant 20 min à sec dans l’obscurité, s’appliquent à milieu de montage difficile avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) teinté et lamelle couvre-objet. Guérir des diapositives montées à température ambiante pendant la nuit et transfert à 4 ° C pour le stockage à long terme.

3. traitement d’Image et microscopie confocale à balayage au laser

  1. Examiner des diapositives montées pour localiser les lésions à l’aide de lasers appropriés pour le journaliste fluorescente utilisée. Dans ce cas, la verte (GFP), rouge (tdTomato) et fluorescence (DAPI) bleue de signaux sont utilisés.
  2. Acquérir l’image en utilisant l’objectif pour la visualisation des cellules individuelles (par exemple, 20 x ou 40 x objectifs on utilise généralement).
  3. Mesurer les intensités de fluorescence dans les images confocales.
    1. Ouvrez l’image confocale en Image J et régler la luminosité/contraste afin de visualiser correctement le signal de fluorescence de la lésion.
    2. Définir la zone d’intérêt et en utilisant l’option de seuillage , définir les limites inférieures et supérieures de fluorescence que nécessaire.
    3. Définir le centre de gravité en sélectionnant zone → valeur de gris moyen → centroïde → limiter au seuil de sous l’onglet analyse dans Image J.
    4. Extraire la valeur d’intensité de centroïde fluorescence ou la mesure de l’intensité de fluorescence moyenne dans une lésion donnée par unité de surface (fluorescence de moyenne intensité, IFM) pour GFP et tdTomato. Ici, les zones d’un µm2 ont été utilisés.
      Remarque : Une deuxième analyse aveugle minimise la partialité lorsque l’identité de l’échantillon est connue.
    5. Tracer les données et effectuer des analyses statistiques appropriées pour chaque comparaison.

4. analyse en cytométrie en flux

  1. (Facultatif) Déterminer l’activité de fusion de l’inoculum sur le jour de l’infection (à partir de la section 2.2.3)
    1. À 899 µL de 1 x PBS stérile (pH 7,4) ajouter 100 µL de chaque inoculum et 1 µL de membrane nucléique perméants stain (voir Table des matières). Comme témoin, n’oubliez pas d’inclure un échantillon dépourvu d’acide nucléique tache.
    2. Effectuer l’écoulement cytometry sur tous les échantillons.
      Remarque : Pour la toute première expérience, il est utile d’inclure un contrôle seul vecteur pour la fusion d’intérêt pour déterminer la tension d’utilisation. Une séparation claire entre les échantillons positifs et négatifs est essentielle pour l’analyse des données, indiquant le journaliste est bien au-dessus de signal de fond.
    3. Pour identifier la population bactérienne, tracer les événements à l’aide d’acide nucléique tache (axe y) et avant la dispersion (axe x).
    4. Dessiner une grille d’inclusion autour des événements qui sont deux acides nucléiques tache positive et la taille correcte de la bactérie basée sur le forward scatter (entre 0,5 à 2,0 µm pour S. aureus).
      Remarque : Faire preuve de rigueur lorsqu’on veut identifier cette population car il est important d’inclure des événements qui sont clairement dans ces paramètres. Veillez à ce que cette porte exclut tous les événements pour les contrôles négatifs dans d’autres conditions. Dans cette étude, environ 70 % la population cellulaire satisfait ces exigences dans l’analyse.
  2. Analyse des échantillons de tissus après le sacrifice :
    1. Euthanasier les animaux, récolter les reins gauche (voir l’étape 2.3), et transfert en perle-battant tubes contenant 1 mL de 1 x PBS stérile (pH 7,4) et 250 µL de perles borosilicaté de 2 mm.
    2. Perturber les tissus pour libérer les cellules bactériennes. Pour les reins, utilisez un homogénéisateur pour perturber les cellules. Ici, trois 30 s salves à 6800 tr/min avec 1 min périodes sur glace mouillée entre les cycles de refroidissement ont été utilisées pour réduire au minimum le chauffage des échantillons.
    3. Pellet, le plus gros débris tissulaires par centrifugation à 250 x g pendant 3 min dans une micro-centrifugeuse table refroidi à 4 ° C.
      Remarque : En général, il y a un culot au fond du tube et une couche de débris flottants sur le dessus. La couche du milieu aqueuse contient les cellules bactériennes.
    4. Transférer 10 µL de la phase aqueuse dans un tube de microcentrifuge propre 1,5 mL contenant 1 µL de tache d’acide nucléique dans 989 µL de PBS (volume total 1 mL).
    5. Effectuer la cytométrie de flux en utilisant les mêmes paramètres d’acquisition de données et de processus de blocage en ce qui concerne l’inoculum initial.
      Remarque : Des numérations bactériennes sera très faibles car l’échantillon contient principalement des débris tissulaires. L’option « Live gate » peut également servir si les cellules sont tache acide nucléique positive et découpage en taille lorsque les données sont chargées dans l’application. Cela aidera aussi à analyser plusieurs des événements cible et réduire la taille du fichier. Événements presque 1 million par exemple sont comptés, mais plusieurs chefs d’accusation des événements peuvent être nécessaires en fonction de la gravité de l’infection et la taille du tissu analysé.
    6. Analyse des données : Déterminer ce que signifie intensité de fluorescence (MFI) pour chaque fluorophore dans un échantillon donné, en utilisant les portes d’inclusion déterminés au point 4.1.4. Normaliser les échantillons dans le logiciel d’analyse de flux d’événement chefs d’accusation. 10 000 chefs d’accusation sont généralement suffisants dans l’analyse.
      Remarque : Il n’est pas rare de trouver des échantillons qui contiennent moins de ce nombre d’événements puisqu’il s’agit dépend de la sévérité de la formation et l’infection abcès. En utilisant cette approche, 500-40 000 événements sont trouvent dans les tissus infectés.

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Résultats

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Nous avons développé un plasmide dérivé pMAD32 qui peut fournir n’importe quel journaliste construct de fusion dans le chromosome par recombinaison homologue double filtre (Figure 1). Cette construction permet d’analyse quantitative de toute région régulatrice qui prend en charge la production de la protéine GFP et signal fluorescent au-dessus de fond. Le plasmide confère la résistance à l’ampicilline (Apr) pour l’entretien ...

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Discussion

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Les maladies infectieuses bactériennes sont un problème croissant de santé dans le monde entier en raison de l’acquisition de la résistance aux antibiotiques déterminants46. Adaptation aux environnements hôtes étant essentielle pour la croissance et la survie au cours de l’infection, stratégies de ciblage des programmes d’expression de gènes qui augmentent l’aptitude de l’agent pathogène peuvent s’avérer utiles thérapeutiquement. Un de ces programmes est l’ensemble des gènes contrôlés par le systè...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

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Nous remercions Alexander Horswill pour le don de la PsarAP1tdTomato - fusion et Karen Creswell pour aide à l’analyse en cytométrie en flux. Nous remercions également Alyssa King pour obtenir des conseils sur l’analyse statistique. Ce travail a été financé en partie par une bourse de recherche exploratoire et le développement de NIH (fief AI123708) et les fonds de démarrage de faculté à SRB. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et interprétation ou la décision de soumettre les travaux pour publication.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
5 % de sang de moutonHardy Diagnostics (Santa Maria, CA)A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta ;-D-galactopyranoside (X-Gal)ThermoScientificR0402
AmpicillineFisher ScientificBP1760-25
C57Bl/6 SourisCharles RiverNA
ChloramphénicolSigma-AldrichC-0378
microscope confocal à balayage laserZeissNA
cryostat microtomeThermo ScientificNA
Culture, CapVWR International2005-02512
D+2:25NA Oligo IntegratedDNA Technologies (Coralville, Iowa)NA
DNA LigaseNew England BiolabsM0202S
ÉrythromycineSigma-AldrichE5389
Analyseur de débitBecton DickinsonNA
billes de verreSigmaZ273627
Miniprep, plasmidePromegaA1220
agitation orbitale bain-marieNouveau-Brunswick InnovaNA
PCR purificationQIagen28106
Tampon phosphate salin (PBS)Cellgrow46-013-CM
Lecteur de plaquesTecanNA
Precellys 24 homogénéisateurBertin LaboratoriesNA
pUC57-KanGenScript (Piscataway, NJ)NA
Q5 Taq DNA PolymeraseNew England Biolabs (Ipswich, MA)M0491S
Restriction EnzymesNouveau England Biolabs (Ipswich, MA)R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Transcriptase inverseNew England BioLabsE6300L
Séquençage de SangerGenewiz (Germantown, MD)NA
Sub Xero moyen de congélation de tissus transparentsMercedes MedicalMER5000
Superfrost Plus lames de microscopeFisher Scientific12-550-15
superloopGE Lifesciences18111382
Seringue, FiltreVWR International28145-481
Syto 40Thermo Fisher ScientificS11351Coloration d’acide nucléique perméable à membrane
TétracyclineSigma-AldrichT7660
Bouillon de soja tryptiqueVWR90000-376
Spectrophotomètre UV-visibleBeckman Coulter-DU350NA
Support de montage Vectashield Antifade avec DAPIVector LaboratoriesH-1500

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
  2. Lowy, F. Staphylococcus aureus infections. The New England Journal of Medicine. 339 (8), 520-532 (1998).
  3. Grosser, M. R., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus nitric oxide resistance and virulence. PLoS Pathogen. 14 (3), 1006907(2018).
  4. Valentino, M., et al. Genes contributing to Staphylococcus aureus fitness in abscess- and infection-related ecologies. MBio. 5 (5), 01714-01729 (2014).
  5. Cheng, A., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. FASEB Journal. 23 (10), 3393-3404 (2009).
  6. Meyers, L. A., Levin, B. R., Richardson, A. R., Stojiljkovic, I. Epidemiology, hypermutation, within-host evolution and the virulence of Neisseria meningitidis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 270 (1525), 1667-1677 (2003).
  7. Balasubramanian, D., et al. Staphylococcus aureus Coordinates Leukocidin Expression and Pathogenesis by Sensing Metabolic Fluxes via RpiRc. MBio. 7 (3), 00818(2016).
  8. Geiger, T., Goerke, C., Mainiero, M., Kraus, D., Wolz, C. The virulence regulator Sae of Staphylococcus aureus.: promoter activities and response to phagocytosis-related signals. Journal of Bacteriology. 190 (10), 3419-3428 (2008).
  9. Weiss, A., Broach, W. H., Shaw, L. N. Characterizing the transcriptional adaptation of Staphylococcus aureus. to stationary phase growth. Pathogens and Disease. 74 (5), (2016).
  10. Balaban, N., Novick, R. P. Autocrine regulation of toxin synthesis by Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (5), 1619-1623 (1995).
  11. Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: a regulatory link between metabolism and virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 191 (9), 2953-2963 (2009).
  12. Majerczyk, C. D., et al. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 190 (7), 2257-2265 (2008).
  13. McNamara, P. J., Milligan-Monroe, K. C., Khalili, S., Proctor, R. A. Identification, cloning, and initial characterization of rot, a locus encoding a regulator of virulence factor expression in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 182 (11), 3197-3203 (2000).
  14. Liu, Q., Yeo, W. S., Bae, T. The SaeRS Two-Component System of Staphylococcus aureus. Genes (Basel). 7 (10), 81(2016).
  15. Giraudo, A., Calzolari, A., Cataldi, A., Bogni, C., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus encodes a two-component regulatory system. FEMS Microbiology Letters. 177 (1), 15-22 (1999).
  16. Cho, H., et al. Calprotectin Increases the Activity of the SaeRS Two Component System and Murine Mortality during Staphylococcus aureus Infections. PLoS Pathogen. 11 (7), 1005026(2015).
  17. Sun, F., et al. In the Staphylococcus aureus two-component system sae, the response regulator SaeR binds to a direct repeat sequence and DNA binding requires phosphorylation by the sensor kinase SaeS. Journal of Bacteriology. 192 (8), 2111-2127 (2010).
  18. Liang, X., et al. Inactivation of a two-component signal transduction system, SaeRS, eliminates adherence and attenuates virulence of Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 74 (8), 4655-4665 (2006).
  19. Giraudo, A. T., Cheung, A. L., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus controls exoprotein synthesis at the transcriptional level. Archives of Microbiology. 168 (1), 53-58 (1997).
  20. Flack, C. E., et al. Differential regulation of staphylococcal virulence by the sensor kinase SaeS in response to neutrophil-derived stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (19), 2037-2045 (2014).
  21. Mainiero, M., et al. Differential target gene activation by the Staphylococcus aureus two-component system saeRS. Journal of Bacteriology. 192 (3), 613-623 (2010).
  22. Li, D., Cheung, A. Repression of hla by rot is dependent on sae in Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 76 (3), 1068-1075 (2008).
  23. Bischoff, M., et al. Microarray-based analysis of the Staphylococcus aureus sigmaB regulon. Journal of Bacteriology. 186 (13), 4085-4099 (2004).
  24. Novick, R., Jiang, D. The staphylococcal saeRS system coordinates environmental signals with agr quorum sensing. Microbiology. 149, Pt 10 2709-2717 (2003).
  25. Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  26. Berends, E., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-587 (2010).
  27. Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 101 (3), 495-514 (2016).
  28. Cassat, J., et al. Transcriptional profiling of a Staphylococcus aureus clinical isolate and its isogenic agr and sarA mutants reveals global differences in comparison to the laboratory strain RN6390. Microbiology. 152, Pt 10 3075-3090 (2006).
  29. Kiedrowski, M., et al. Nuclease modulates biofilm formation in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 6 (11), 26714(2011).
  30. Fujimoto, D. F., et al. Staphylococcus aureus SarA is a regulatory protein responsive to redox and pH that can support bacteriophage lambda integrase-mediated excision/recombination. Molecular Microbiology. 74 (6), 1445-1458 (2009).
  31. Yeo, W. S., et al. The FDA-approved anti-cancer drugs, streptozotocin and floxuridine, reduce the virulence of Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 8 (1), 2521(2018).
  32. Arnaud, M., Chastanet, A., Débarbouillé, M. New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, Gram-positive bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 70 (11), 6887-6891 (2004).
  33. Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. Journal of Microbiological Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
  34. Schenk, S., Laddaga, R. A. Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters. 73 (1-2), 133-138 (1992).
  35. Monk, I. R., Foster, T. J. Genetic manipulation of Staphylococci-breaking through the barrier. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2, 49(2012).
  36. Novick, R. P. Genetic systems in staphylococci. Methods in Enzymology. 204, 587-636 (1991).
  37. Diep, B. A., et al. Complete genome sequence of USA300, an epidemic clone of community-acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 367 (9512), 731-739 (2006).
  38. Boles, B. R., Thoendel, M., Roth, A. J., Horswill, A. R. Identification of genes involved in polysaccharide-independent Staphylococcus aureus biofilm formation. PLoS One. 5 (4), 10146(2010).
  39. Villaruz, A. E., et al. A point mutation in the agr locus rather than expression of the Panton-Valentine leukocidin caused previously reported phenotypes in Staphylococcus aureus pneumonia and gene regulation. Journal of Infect Diseases. 200 (5), 724-734 (2009).
  40. Reeves, P. G., Nielsen, F. H., Fahey, G. C. J. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. Journal of Nutrition. 123 (11), 1939-1951 (1993).
  41. Thomer, L., Schneewind, O., Missiakas, D. Pathogenesis of Staphylococcus aureus Bloodstream Infections. Annual Review of Pathology. 11, 343-364 (2016).
  42. Olson, M., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  43. Thammavongsa, V., Missiakas, D., Schneewind, O. Staphylococcus aureus degrades neutrophil extracellular traps to promote immune cell death. Science. 342 (6160), 863-866 (2013).
  44. Cheung, A. L., Nast, C. C., Bayer, A. S. Selective activation of sar promoters with the use of green fluorescent protein transcriptional fusions as the detection system in the rabbit endocarditis model. Infection and Immunity. 66 (12), 5988-5993 (1998).
  45. Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
  46. Uhlemann, A. C., Otto, M., Lowy, F. D., DeLeo, F. R. Evolution of community- and healthcare-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Infection, Genetics and Evolution. 21, 563-574 (2014).
  47. Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).
  48. Cheng, A., DeDent, A., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus. abscess formation. Trends in Microbiology. 19 (5), 225-232 (2011).
  49. Balasubramanian, D., Harper, L., Shopsin, B., Torres, V. J. Staphylococcus aureus pathogenesis in diverse host environments. Pathogens and Disease. 75 (1), (2017).
  50. Vitko, N. P., Grosser, M. R., Khatri, D., Thurlow, L. R., Richardson, A. R. Expanded Glucose Import Capability Affords Staphylococcus aureus Optimized Glycolytic Flux during Infection. MBio. 7 (3), 00296(2016).
  51. Landete, J. M., et al. Use of anaerobic green fluorescent protein versus green fluorescent protein as reporter in lactic acid bacteria. Applied Microbiology and Biotechnol. 99 (16), 6865-6877 (2015).
  52. Buckley, A. M., et al. Lighting Up Clostridium Difficile: Reporting Gene Expression Using Fluorescent Lov Domains. Scientific Reports. 6, 23463(2016).
  53. Bose, J. L. Genetic manipulation of staphylococci. Methods in Molecular Biology. 1106, 101-111 (2014).
  54. Krute, C. N., et al. Generation of a stable plasmid for in vitro and in vivo studies of Staphylococcus. Applied and Environmental Microbiology. , 02370(2016).
  55. Cassat, J. E., et al. Integrated molecular imaging reveals tissue heterogeneity driving host-pathogen interactions. Science Translational Medicine. 10 (432), 6361(2018).
  56. Handlogten, M. E., Hong, S. P., Westhoff, C. M., Weiner, I. D. Apical ammonia transport by the mouse inner medullary collecting duct cell (mIMCD-3). American Journal of Physiology-Renal Physiology. 289 (2), 347-358 (2005).
  57. Hijmans, B. S., Grefhorst, A., Oosterveer, M. H., Groen, A. K. Zonation of glucose and fatty acid metabolism in the liver: mechanism and metabolic consequences. Biochimie Journal. 96, 121-129 (2014).
  58. Davis, K. M., Mohammadi, S., Isberg, R. R. Community behavior and spatial regulation within a bacterial microcolony in deep tissue sites serves to protect against host attack. Cell Host & Microbe. 17 (1), 21-31 (2015).
  59. Stenman, J. M., et al. Canonical Wnt signaling regulates organ-specific assembly and differentiation of CNS vasculature. Science. 322 (5905), 1247-1250 (2008).

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