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Article de méthode

Synthèse et bioconjugaison de Thiol-réactifs pour la création de Site-sélectivement modifiés immunoconjugués

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DOI :

10.3791/59063

⸱

6 mars 2019

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Hunter College of the City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Department of Radiology, Weill Cornell Medical College

Dans cet article

Résumé

Dans ce protocole, nous allons décrire la synthèse des GOUSSES, un réactif à base de sulfone phenyoxadiazolyl méthyl pour la fixation site sélectif de cargaisons sur les thiols de biomolécules, en particulier les anticorps. En outre, nous allons décrire la synthèse et la caractérisation d’un chélateur bifonctionnel portant des GOUSSES et sa conjugaison à un anticorps de modèle.

Résumé

Sondes bifonctionnels Maléimide-roulement ont été utilisés pendant des décennies pour la modification site sélectif des thiols dans des biomolécules, en particulier les anticorps. Axée sur le maléimide conjugués affichent in vivo de stabilité limitée parce que le lien de thioéther succinimidyl peut subir une réaction de rétro-Michael. Cela, bien sûr, peut conduire à la libération de la charge radioactive ou son échange avec des biomolécules thiol porteur en circulation. Ces deux processus peuvent produire des concentrations élevées d’activité dans les organes sains ainsi qu’une diminution des concentrations d’activité dans les tissus cibles, ce qui réduit d’imagerie de contraste et rapports thérapeutiques plus faibles. En 2018, nous avons signalé la création d’un modulaire, stable et réactif de phenyloxadiazolyl facilement accessible methyl sulfone — surnommé « PODS » — comme une plate-forme pour bioconjugations thiol-basé. Nous avons clairement démontré que bioconjugations site-sélective axée sur les GOUSSES de façon reproductible et robuste créer radioimmunoconjugates homogène, bien définis, hautement immunoréactive et très stable. En outre, les expériences précliniques dans des modèles murins de cancer colorectal ont montré que ces site sélectivement marqués radioimmunoconjugates pièce bien supérieure performance in vivo par rapport aux anticorps radiomarqués synthétisés par axée sur le maléimide conjugaisons. Dans ce protocole, nous allons décrire la synthèse de quatre étapes de GOUSSES, la création d’une variante de GOUSSES porteuses bifonctionnelle de l’omniprésent chélateur DOTA (GOUSSES-DOTA) et la conjugaison de PODS-DOTA pour le trastuzumab anticorps ciblant HER2.

Introduction

Radiopharmaceutiques chimistes ont longtemps exploité la sélectivité et la spécificité des anticorps pour les biomarqueurs de la maladie pour les deux imagerie nucléaire et ciblé de radiothérapie1. Approche et de loin la plus courante pour le radiomarquage d’anticorps se fonde sur l’attachement aveugle de radiomarquées groupes prosthétiques ou radiometal chélateurs aux acides aminés — le plus souvent les lysines — au sein de la structure de l’immunoglobuline ( Figure 1 a)2. Si cette stratégie est certainement efficace, son caractère aléatoire et non spécifique au site peut créer des problèmes. Plus précisément, des approches traditionnelles bioconjugaison produisent mal défini et immunoconjugués hétérogène composé de mélanges de milliers de régioisomères différents, chacun avec son propre ensemble de propriétés biologiques et pharmacologiques3. En outre, bioconjugaison aléatoire peut entraver l’immunoréactivité d’anticorps si la cargaison est annexée aux domaines d’antigène-liant de l’immunoglobuline.

Au cours des années, une variété de stratégies spécifiques au site et site sélectif bioconjugaison ont été développés afin de répondre à ces problèmes4,5. Le plus commun de ces approches s’appuie sur la ligature des sondes maléimide portant aux groupes sulfhydryles des cystéines (Figure 1 b). Les anticorps IgG1 contiennent naturellement des 4 ponts disulfure de chaîne inter, liens qui peuvent être réduites de manière sélective pour produire des thiols libres capables de subir des réactions d’addition de Michael avec maléimides forment des liaisons thioéther succinimidyl. L’utilisation des thiols et maléimides est certainement une amélioration par rapport aux méthodes traditionnelles et une grande variété de synthons maléimide-roulement et bifonctionnels chélateurs sont actuellement disponibles. Cependant, il est important de noter que cette méthode a des limites sérieuses aussi bien. Axée sur le Maléimide immunoconjugués présentent une stabilité limitée in vivo car le lien thioéther peut subir une réaction de rétro-Michael (Figure 2)6,7,8,9, 10. cela, bien sûr, peut conduire à la libération de la charge radioactive ou son échange avec des biomolécules thiol porteur en circulation (p. ex., glutathion ou albumine sérique). Ces deux processus peuvent augmenter les concentrations d’activité dans les organes sains ainsi que diminuer les concentrations d’activité dans les tissus cibles, ce qui réduit d’imagerie de contraste et rapports thérapeutiques plus faibles. Plusieurs réactifs thiol réactif alternatives ont été développées dans le but de contourner ces problèmes, y compris les tosylates, bromo - et iodo-acétyles et vinyle sulfones11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17. Cependant, toutes ces approches ont des limites qui ont nui à leur application généralisée.

Environ cinq ans, le laboratoire du feu Carlos Barbas III au Scripps Research Institute pionnier dans l’utilisation des sulfones méthyl phenyloxadiazolyl comme réactifs pour la formation sélective des liens extrêmement stables avec les thiols (Figure 1 et Figure 3) 18 , 19. les auteurs salariés une variante de sulfone-roulement de méthyle phenyloxadiazolyl de fluorescéine pour modifier plusieurs anticorps conçus pour contenir des résidus de cystéine libre, produisant finalement immunoconjugués ont une stabilité supérieure qu’analogue constructions créées à l’aide de sondes maléimide. En voyant ces travaux prometteur, nous étions un peu surpris que cette technologie n’avait été utilisée guère en radiochimie et qu’il n'avait pas encore été utilisée du tout dans la synthèse des chélateurs bifonctionnels ou radioimmunoconjugates20,21 . Ce manque d’applications, cependant, ne tarda pas à être plus judicieux : plusieurs tentatives de se procurer le réactif de Sigma-Aldrich a donné lieu à la réception des mélanges complexes de produits de dégradation avec < 15 % du composé désiré. En outre, synthétisant le réactif déclaré nous-mêmes n’était pas une option réaliste non plus, comme la voie de synthèse publiée est un peu encombrante et nécessite du matériel sophistiqué de chimie organique qui la plupart radiochimie et imagerie moléculaire laboratoires, y compris la nôtre — ne possèdent tout simplement pas.

En réponse à ces obstacles, nous présentons à créer facilement accessible et très stable phenyloxadiazolyl methyl sulfone réactif qui peut être obtenu via une voie de synthèse robuste et assez facile. Plus tôt cette année, nous avons signalé la création d’un modulaire, stable et réactif de phenyloxadiazolyl facilement accessible methyl sulfone — surnommé « PODS » — comme une plate-forme pour bioconjugations axée sur les thiols (Figure 1 et Figure 3)22. La différence essentielle entre les GOUSSES et le réactif rapporté par Barbas, Al est que le premier emploie un anneau aniline attaché à la portion de sulfone de méthyle phenyloxadiazolyl, alors que ce dernier dispose d’un phénol dans la même position (Figure 4). Ce changement facilite une voie de synthèse plus simple et plus accessible que — si notre expérience avec le composé disponible dans le commerce est emblématique — un réactif final plus stable. Dans ce travail, nous aussi synthétisé une paire de GOUSSES renfermant des chélateurs bifonctionnels — dosettes-MPO et GOUSSES-CHX-A''-DTPA — pour faciliter la création de 89Zr - et 177marqué Lu radioimmunoconjugates, respectivement. Comme nous allons le voir, nous avons démontré que bioconjugations site-sélective axée sur les GOUSSES de façon reproductible et robuste créer radioimmunoconjugates homogène, bien définis, hautement immunoréactive et très stable. En outre, les expériences précliniques dans des modèles murins de cancer colorectal ont montré que ces site sélectivement marqués radioimmunoconjugates pièce performance in vivo supérieure par rapport aux anticorps radiomarqués synthétisés par axée sur le maléimide conjugaisons.

L’objectif primordial de ce travail est de faciliter la création des immunoconjugués bien définis, homogène, très stable et hautement immunoréactives pour applications in vitro et in vivo. L’approche synthétique est assez simple à effectuer dans n’importe quel laboratoire, et le réactif de GOUSSES parent peut être modifié avec une pléthore de différents chélateurs, fluorophores ou des cargaisons. Dans ce protocole et la vidéo qui l’accompagne, nous allons décrire la synthèse simple, quatre étapes des GOUSSES (Figure 5) ; la création d’une variante de GOUSSES porteuses de DOTA, un chélateur largement utilisé pour la coordination des 64Cu, 68Ga, 111, 177Lu et 225Ac (Figure 6) ; et la bioconjugaison de GOUSSES-DOTA d’un anticorps de modèle, le trastuzumab IgG1 ciblant HER2 (Figure 7).

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Protocole

1. la synthèse de 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)

Remarque : En raison de la lumière-sensibilité du composé, garder toutes les réactions dans les vaisseaux recouverts de papier.

  1. Dans une 10 mL rond ballon, dissoudre 100 mg (0,517 mmol, 1 équivalent) de 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol dans 3 mL de méthanol.
  2. Ajouter à cette solution, 360 μL de diisopropyléthylamine (DIPEA ; 2,07 mmol ; 4 équivalents ; anhydre) et d’un bar de petite agitation magnétique. Couvrir le ballon avec un bouchon en caoutchouc et agiter la solution pendant 10 minutes à température ambiante.
  3. À l’aide d’une seringue de verre de 1 mL, piquez un trou dans le bouchon en caoutchouc et rapidement ajouter 32 μL (0,517 mmol, 1 équivalent) d’iodométhane à ce mélange. Laissez le mélange agir pendant 45 minutes à température ambiante.
    Remarque : En raison de la nocivité potentielle des iodométhane, cette réaction doit être faite sous une hotte chimique.
  4. La valeur de l’eau du bain d’un évaporateur rotatif à 40 ° C et réduire lentement la pression pour enlever le solvant pour s’offrir un solide blanc.
  5. Dissoudre le solide dans 3 mL d’acétate d’éthyle et laver au moins trois fois avec 5 mL de solution de carbonate de sodium 0,1 M à l’aide d’une ampoule à décanter.
    Remarque : Prendre périodiquement spot-essais de la phase aqueuse sous une lampe UV ; une fois que rien n’est vu sous la lampe, vous pouvez arrêter les lavages.
  6. Recueillir la phase organique dans une ampoule à décanter et laver à l’eau jusqu'à ce que le pH de la phase aqueuse atteint 6,8 et 7,0 (à l’aide de papier pH).
  7. Recueillir la phase organique et ajouter du sulfate de magnésium pour enlever toute trace d’eau.
    Remarque : Le sulfate de magnésium doit être ajouté avec une petite spatule, après quoi la solution devrait être tourbillonnait. Si les particules fines de l’agent de séchage sont encore visibles, la solution est sec. Si ce n’est pas le cas, ajouter de petites quantités de sulfate de magnésium jusqu'à ce que les particules fines sont visibles.
  8. Filtrer le mélange en utilisant un moyen de verre fritté ou papier filtre.
  9. Faire évaporer les volatiles à l’aide d’un évaporateur rotatif, un processus qui devrait produire le produit désiré en aiguilles blanches.

2. la synthèse de tert-butyl[18-({4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] carbamate (2)

Remarque : En raison de la lumière-sensibilité du composé, garder toutes les réactions dans les vaisseaux recouverts de papier.

  1. Dans un 25 mL rond ballon, dissoudre 387 mg (0.92 mmol, 1,0 équivalent) de NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine dans 10 mL de dichlorométhane.
  2. Pour cette solution, ajouter μL 480 (2.76 mmol, 3 équivalents) de DIPEA, 264 mg (1,38 mmol ; 1,5 équivalent) de N-éthyl - N′-[3-(diméthylamino) propyl] carbodiimide chlorhydrate (EDCI) et 200 mg (0.97 mmol, 1,1 équivalents) de 1. Sceller le réservoir avec un bouchon en verre et laisser la réaction remuez pendant 5 jours à température ambiante.
    NOTE : Soyez conscient de l’évaporation du dichlorométhane. Si nécessaire, ajouter d’autres tout au long de la semaine.
  3. Laver le mélange dans une ampoule à décanter avec une solution d’acide chlorhydrique de 1 M (3 x 5 mL).
  4. Recueillir la phase organique et continuer à le laver dans une ampoule à décanter, tout d’abord avec une solution 1 M Na2CO3 (2 x 5 mL), puis avec de l’eau (3 x 5 mL).
  5. Recueillir la phase organique et ajouter du sulfate de magnésium pour enlever toutes traces d’eau (voir étape 1.7). Filtrer le mélange en utilisant un moyen de verre fritté ou papier filtre.
  6. À l’aide d’un évaporateur rotatif, éliminer les solvants volatils sous pression réduite pour s’offrir un solide blanc cassé.
  7. Dissoudre à nouveau ce solide dans 10 mL d’acétate d’éthyle et précipiter le produit via l’addition progressive (par exemple, 2 mL à la fois) de 30 mL de cyclohexane.
  8. Filtrer la solution avec le papier filtre ou fritte de verre moyen pour obtenir le produit sous forme de poudre blanche.

3. la synthèse de tert-butyl[18-({4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] carbamate (3)

Remarque : En raison de la lumière-sensibilité du composé, garder toutes les réactions dans les vaisseaux recouverts de papier.

  1. Dans un ballon à fond rond 10 mL, dissoudre 30 mg (0,05 mmol ; 1 équivalent) de 2 à 4 mL de dichlorométhane.
  2. Lentement, 49 mg (0,2 mmol ; 4 équivalents) de 70 % d’acide m-chloroperbenzoïque ajouter à ce mélange et couvrir la cuve de réaction avec un bouchon en verre. Agiter la solution du jour au lendemain à la température ambiante, en fin de compte, ce qui donne un mélange de jaune.
  3. Laver le mélange jaune dans une ampoule à décanter, tout d’abord avec une solution 0,1 M de NaOH (3 x 5 mL), puis avec de l’eau (3 x 5 mL).
  4. Sécher la phase organique avec le sulfate de magnésium et filtrer le mélange en utilisant un moyen de verre fritté ou papier filtre.
  5. À l’aide d’un évaporateur rotatif, éliminer les solvants sous pression réduite pour obtenir le produit sous forme de solide pâle.

4. la synthèse de N1-(3-{2-[2-(3-aminopropoxy)ethoxy]-ethoxy}propyl)-N4- succinamide {4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl] phényl} (PODS)

  1. Dans un 25 mL rond ballon, dissoudre 30 mg de 3 à 2,0 mL de dichlorométhane.
  2. Ajouter 400 ml d’acide trifluoroacétique et sceller le ballon avec un bouchon en verre.
  3. Remuez le mélange réactionnel à température ambiante pendant 3 heures.
  4. À l’aide d’un évaporateur rotatif, enlever les substances volatiles sous pression réduite, à température de la pièce, laissant un résidu huileux.
  5. Dissoudre le résidu huileux dans 7 mL d’eau et, à l’aide d’une ampoule à décanter, laver avec l’acétate d’éthyle (3 x 4 mL). Garder la couche aqueuse.
  6. Lyophiliser la couche aqueuse pour s’offrir les GOUSSES sous forme de poudre blanche.
    NOTE : Les coefficients d’absorption molaire pour dosettes à 280 et 298 nm sont 9 900 et 12 400 cm-1M-1, respectivement.

5. la synthèse des GOUSSES-DOTA

  1. Dans un tube de microtubes de 1,5 mL, dissoudre 10 mg de GOUSSES dans 300 μl de diméthylsulfoxyde (0,018 mmol ; 1 équivalent) et ajouter 26 μL de N, N-diisopropyléthylamine (0,15 mmol ; 8 équivalents).
  2. Dissoudre 15,2 mg de DOTA-Bn-NCS (0,02 mmol ; 1,2 équivalents) dans 100 μl de diméthylsulfoxyde et combiner cette solution avec la solution d’étape 5.1. Sceller le tube de microcentrifuge.
  3. Permettre la réaction à incuber une nuit à température ambiante.
  4. Purifier le produit à l’aide de chromatographie HPLC en phase inverse C18 pour enlever tout DOTA-Bn-NCS n’ayant pas réagi.
    NOTE : Temps de rétention sont évidemment fortement tributaires de l’équipement CLHP chaque laboratoire (pompes, colonnes, tuyaux, etc.), et des contrôles appropriés doivent être effectués avant la purification. Toutefois, pour présenter un exemple, si une pente de 5 : 95 MeCN/H2O (tous deux avec 0,1 % TFA) à 70 : 30 MeCN/H2O (tous deux avec 0,1 % TFA) pendant 30 min, une colonne de18 semi-préparative 19 x 250 mm C et un débit de 6 mL/min sont utilisés , GOUSSES, p-SCN-Bn-DOTA et GOUSSES-DOTA aura des temps de rétention d’autour de 14,4 et 18,8 19,6 min, respectivement. Les trois composés peuvent être étudiés à 254 nm.

6. la bioconjugaison de GOUSSES-DOTA au trastuzumab

Remarque : Pour cette étape, nous avons commencé avec une solution mère de 16,4 mg/mL de trastuzumab.

  1. Dans un tube de microcentrifuge hypoprotidique liaison 1,5 mL, diluer 61 μL de la solution mère de trastuzumab (1 mg ; 6,67 nmol, 1 équivalent) avec 859 μL de solution saline tamponnée au phosphate (pH 7,4).
  2. Ajouter à ce mélange, 6,7 μL d’une solution fraîchement 10 mM de PTCE en H2O (66,7 nmol, 10 équivalents).
  3. Préparer une solution de 1 mg/mL de PODS-DOTA dans le DMSO et ajouter 73 μl de cette solution de PODS-DOTA au mélange réactionnel (66.67 nmol, 10 équivalents).
  4. Sceller le tube de microcentrifuge et incuber la solution pendant 2 heures à température ambiante.
  5. Après 2 heures, purifier l’immunoconjugué en utilisant une colonne de dessalement exclusion préemballages taille jetables.
    1. Tout d’abord, équilibrer la colonne d’exclusion de taille tel que décrit par le fournisseur à supprimer tous les préservatifs présents dans la colonne pendant le stockage. Un procédé typique implique la colonne 5 fois avec un volume de PBS qui correspond au volume de la colonne de lavage : 5 x 2,5 mL de PBS.
    2. Ensuite, ajoutez le mélange réactionnel à la colonne d’exclusion de taille notant le volume du mélange réactionnel.
    3. Une fois le mélange réactionnel est entré dans la colonne, ajouter une quantité appropriée de PBS pour porter le volume total de solution ajoutée à la colonne à 2,5 mL. Par exemple, si la réaction de conjugaison conduit à un volume total de 1,3 mL, 1,2 mL de PBS supplémentaires devraient être ajoutés à la colonne.
    4. Enfin, recueillir le produit à l’aide de 2 mL de PBS comme l’éluant.
  6. Concentrer l’immunoconjugué final avec des unités de filtration centrifuge avec un poids moléculaire de séparation de 50 kDa.

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Résultats

Les quatre premières étapes du présent protocole, la synthèse des GOUSSES — ont été conçus pour être robustes et fiables. La déprotonation et la substitution de 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol pour former le produit désiré thioéther offre les thioéthers dans > 99 % de rendement après seulement 45 minutes. Ensuite, la ligature entre 1 et N-Boc-N'-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine a été atteint par un peptide standard procédure de couplage, ayant po...

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Discussion

Dans ce rapport, nous avons choisi de ne pas faire figurer tous les protocoles d’expérimentation radiolabeling ou in vivo. Nos motifs sont simples. En ce qui concerne le premier cas, le radiomarquage d’un immunoconjugué axée sur les GOUSSES ne diffère pas du tout celle d’une immunoconjugué synthétisé à l’aide d’autres stratégies de bioconjugaison, et ces procédures ont été largement examinés ailleurs2 . Dans ce dernier domaine, les spécificités de précliniques expériences in vivo (modèles de souri...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient Dr Sai Kiran Sharma pour les conversations utiles.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
5-(4-aminophényl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiolSigma-Aldrich675024
1,5 mL Tube microcentrifuge LoBindEppendorf925000090
1,5 mL Tube microcentrifugeFisherbrand05-408-129
AcétonitrileFisher ScientificA998-4
Unité de filtre centrifuge Amicon Ultra-2EMD Millipore
CyclohexaneFisher ScientificC556-4
DichlorométhaneFisher ScientificAC383780010
DiisopropyléthylamineMP Biomedicals, LLC150915
DiméthylsulfoxydeFisher Scientific31-727-5100ML
Acétate d’éthyleFisher ScientificE145 4
Acide chlorhydriqueFisher ScientificA144-500
IodométhaneSigma-Aldrich289566-100G
Sulfatede magnésium Acros Organics413485000
Acide m-chloroperbenzoïqueSigma-Aldrich273031
MéthanolFisher ScientificA412 1
NBoc-N&prime ;- succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamineSigma-Aldrich671401Se conserve à -80 ° ; C
N-éthyl-N&prime ;- [3- (diméthylamino)propyl] chlorhydrate de carbodiimideSigma-Aldrich3450
Saline tamponnée au phosphateSigma-AldrichP5493 10× ; Concentration
p-SCN-Bn-DOTAMacrocycliquesB-205Se stocker à -80 ° ; C
Sephadex G-25 dans des colonnes de dessalage-10 GEHealthcare17085101
Carbonate de sodiumSigma-Aldrich S7795
Hydroxyde de sodiumFisher ScientificS318-1
TCEPThermoFischer Scientific20490
TriéthylamineFisher ScientificAC157911000
Acide trifluoroacétiqueFisher ScientificA116-50
EN300000141G

Références

  1. Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).
  2. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).
  3. Agarwal, P., Bertozzi, C. R. Site-specific antibody-drug conjugates: the nexus of bioorthogonal chemistry, protein engineering, and drug development. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 176-192 (2015).
  4. Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 1: Cysteine residues and glycans. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 1-17 (2016).
  5. Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 2: Peptide tags and unnatural amino acids. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 153-165 (2016).
  6. Alley, S. C., et al. Contribution of linker stability to the activities of anticancer immunoconjugates. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 759-765 (2008).
  7. Baldwin, A. D., Kiick, K. L. Tunable degradation of maleimide-thiol adducts in reducing environments. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).
  8. Shen, B. -Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nature Biotechnology. 30 (2), 184-189 (2012).
  9. Jackson, D., et al. In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated herceptin antibody-drug conjugates. Plos One. 9 (1), (2014).
  10. Ponte, J. F., et al. Understanding how the stability of the thiol-maleimide linkage impacts the pharmacokinetics of lysine-linked antibody-maytansinoid conjugates. Bioconjugate Chemistry. 27 (7), 1588-1598 (2016).
  11. Stimmel, J. B., et al. Site-specific conjugation on serine -> cysteine variant monoclonal antibodies. Journal of Biological Chemistry. 275 (39), 30445-30450 (2000).
  12. Li, L., et al. Reduction of kidney uptake in radiometal labeled peptide linkers conjugated to recombinant antibody fragments. site-specific conjugation of DOTA-peptides to a cys-diabody. Bioconjugate Chemistry. 13 (5), 985-995 (2002).
  13. Li, J., Wang, X. H., Wang, X. M., Chen, Z. L. Site-specific conjugation of bifunctional chelator BAT to mouse IgG(1) Fab' fragment. Acta Pharmacologica Sinica. 27 (2), 237-241 (2006).
  14. Tinianow, J. N., et al. Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET. Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).
  15. Li, L., et al. Site-specific conjugation of monodispersed DOTA-PEGn to a thiolated diabody reveals the effect of increasing PEG size on kidney clearance and tumor uptake with improved 64-copper PET imaging. Bioconjugate Chemistry. 22 (4), 709-716 (2011).
  16. Khalili, H., Godwin, A., Choi, J. -w, Lever, R., Brocchini, S. Comparative binding of disulfide-bridged PEG-Fabs. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2262-2277 (2012).
  17. Koniev, O., Wagner, A. Developments and recent advancements in the field of endogenous amino acid selective bond forming reactions for bioconjugation. Chemical Society Reviews. 44 (15), 5495-5551 (2015).
  18. Patterson, J. T., Asano, S., Li, X., Rader, C., Barbas, C. F. Improving the serum stability of site-specific antibody conjugates with sulfone linkers. Bioconjugate Chemistry. 25 (8), 1402-1407 (2014).
  19. Toda, N., Asano, S., Barbas, C. F. III Rapid, stable, chemoselective labeling of thiols with Julia-Kocienski-like reagents: A serum-stable alternative to maleimide-based protein conjugation. Angewandte Chemie-International Edition. 52 (48), 12592-12596 (2013).
  20. Zhang, Q., et al. Last-step enzymatic F-18-fluorination of cysteine-tethered RGD peptides using modified Barbas linkers. Chemistry-a European Journal. 22 (31), 10998-11004 (2016).
  21. Chiotellis, A., et al. Novel chemoselective F-18-radiolabeling of thiol-containing biomolecules under mild aqueous conditions. Chemical Communications. 52 (36), 6083-6086 (2016).
  22. Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reactive bifunctional chelators for the creation of site-selectively modified radioimmunoconjugates with improved stability. Bioconjugate Chemistry. 29, 1364-1372 (2018).
  23. Sakamoto, J., Kojima, H., Kato, J., Hamashima, H., Suzuki, H. Organ-specific expression of the intestinal epithelium-related antigen A33, a cell surface target for antibody-based imaging and treatment in gastrointestinal cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 46, S27-S32 (2000).
  24. Sakamoto, J., et al. A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma. Cancer Science. 97 (11), 1248-1254 (2006).
  25. Junutula, J. R., et al. Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index. Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).
  26. Pillow, T. H., et al. Site-specific trastuzumab maytansinoid antibody-drug conjugates with improved therapeutic activity through linker and antibody engineering. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (19), 7890-7899 (2014).
  27. Boswell, C. A., et al. Enhanced tumor retention of a radiohalogen label for site-specific modification of antibodies. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (23), 9418-9426 (2013).
  28. Boswell, C. A., et al. Impact of drug conjugation on pharmacokinetics and tissue distribution of anti-STEAP1 antibody-drug conjugates in rats. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1994-2004 (2011).
  29. Alvarez, V. L., et al. Site-specifically modified 111In labelled antibodies give low liver backgrounds and improved radioimmunoscintigraphy. Nuclear Medicine and Biology. 13 (4), 347-352 (1986).
  30. Strop, P., et al. Location matters: SIte of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates. Chemistry, Biology. 20 (2), 161-167 (2013).
  31. Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. Antibody conjugates with unnatural amino acids. Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).
  32. Axup, J. Y., et al. Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16101-16106 (2012).
  33. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  34. Yamasaki, R. B., Osuga, D. T., Feeney, R. E. Periodate oxidation of methionine in proteines. Analytical Biochemistry. 126 (1), 183-189 (1982).
  35. Wang, W., et al. Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies. Molecular Immunology. 48 (6-7), 860-866 (2011).
  36. O'Shannessy, D. J., Dobersen, M. J., Quarles, R. H. A novel procedure for labeling immunoglobulins by conjugation to oligosaccharide moieties. Immunology Letters. 8 (5), 273-277 (1984).
  37. Panowski, S., Bhakta, S., Raab, H., Polakis, P., Junutula, J. R. Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy. Mabs. 6 (1), 34-45 (2014).
  38. Hu, M. D., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).

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