Article de méthode

Mesure très sensible de la perméabilité glomerulaire chez les souris avec fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

DOI :

10.3791/59064

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9 août 2019

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1Department of Nephrology, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons un protocole pour tester la perméabilité glomerulaire chez les souris à l'aide d'un traceur hautement sensible et non radioactif. Cette méthode permet des analyses d'urine répétitives avec de petits volumes d'urine.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La perte d'albumine dans l'urine (albuminurie) prédit les résultats cardiovasculaires. Dans des conditions physiologiques, de petites quantités d'albumine sont filtrées par le glomerulus et réabsorbées dans le système tubulaire jusqu'à ce que la limite d'absorption soit atteinte. Les premières augmentations de la filtration pathologique de l'albumine peuvent, par conséquent, être manquées en analysant l'albuminurie. Par conséquent, l'utilisation de traceurs pour tester la permsélectivité glomerulaire semble avantageuse. L'isothiocyanate de fluorescéine étiqueté fluorescent (FITC)-polysucrose (c.-à-d., FITC-Ficoll), peut être employé pour étudier la permselectivité glomerulaire. Les molécules de FITC-polysucrose sont librement filtrées par le glomerulus mais ne sont pas réabsorbées dans le système tubulaire. Chez la souris et le rat, fitC-polysucrose a été étudié dans des modèles de perméabilité glomerulaire en utilisant des procédures techniquement complexes (c.-à-d., mesures radioactives, chromatographie liquide haute performance [HPLC], filtration de gel). Nous avons modifié et facilité un protocole basé sur le traceur FITC-polysucrose pour tester les augmentations précoces et petites de la perméabilité glomerulaire à FITC-polysucrose 70 (taille de l'albumine) chez les souris. Cette méthode permet des analyses d'urine répétitives avec de petits volumes d'urine (5 L). Ce protocole contient des informations sur la façon dont le traceur FITC-polysucrose 70 est appliqué par voie intraveineuse et l'urine est recueillie par l'intermédiaire d'un cathéter urinaire simple. L'urine est analysée par un lecteur de plaque de fluorescence et normalisée à un marqueur de concentration d'urine (créatinine), évitant ainsi des procédures techniquement complexes.

Introduction

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Les défauts fonctionnels ou structurels dans la barrière de filtration glomerulaire augmentent la perméabilité glomerulaire à l'albumine, ayant pour résultat la détection de l'albumine dans l'urine (albuminuria). L'albuminurie prédit les résultats cardio-vasculaireset est un marqueur important pour des dommages glomerular 1. Même de faibles niveaux d'albuminurie, se trouvant dans la plage normale, sont associés à un risque cardio-vasculaire accru1.

Dans des conditions physiologiques, l'albumine est filtrée à travers le glomerulus et est presque entièrement réabsorbée dans le système tubulaire2,3. Chez la souris, la détection de l'albumine dans l'urine est habituellement effectuée par un essai immunosorbent lié à l'enzyme d'albumine (ELISA) à partir de 24 h de collecte d'urine. Si l'urine d'une collecte d'urine de 24 h ou de l'urine spot est utilisée, de petites différences dans les concentrations d'albumine peuvent être manquées en raison de problèmes de sensibilité à l'analyse. La plupart des chercheurs, par conséquent, utilisent des modèles animaux dans lesquels l'albuminurie est induite par des dommages rénaux robustes dus aux toxines, aux drogues, et à la chirurgie rénale.

Par conséquent, la découverte d'une méthode sensible pour détecter les changements petits et transitoires dans la perméabilité glomerulaire est très importante pour le domaine. Rippe et coll. ont présenté un modèle de rat pour tester la perméabilité glomerulaire en appliquant un traceur étiqueté fluorescent, à savoir FITC-polysucrose 70 (c.-à-d., FITC-Ficoll 70), à la taille de l'albumine4. L'application de traceur permet de tester les changements à court terme de la perméabilité glomerulaire (en quelques minutes) et est très sensible4. Deux études ont utilisé la méthode traceur chez les souris5,6. Malgré ses avantages, cette méthode présente malheureusement des inconvénients : elle est techniquement très complexe, radioactive et invasive. Une analyse plus approfondie de l'urine n'est effectuée qu'en utilisant la filtration de gel ou la taille-exclusion HPLC5,6.

Dans cet article, nous présentons une méthode alternative, sensible, non radioactive, et rapide pour mesurer la perméabilité glomerular chez les souris utilisant fluorescently étiqueté FITC-polysucrose 70. En introduisant un cathéter transurétral, la collecte d'urine est moins invasive que la perforation de la vessie, l'urérotomie et l'épétére suprapubienne, et permet la collecte d'urine au moins toutes les 30 min. L'analyse d'urine est effectuée à partir de petites quantités (5 l) à l'aide d'un lecteur de plaques fluorescentes. Les concentrations de traceurs dans l'urine sont normalisées aux concentrations de créatinine dans l'urine à l'aide d'un test de créatinine enzymatique.

Par conséquent, cette nouvelle méthode offre un outil sensible pour étudier les dommages glomerulaires tôt avec la perméabilité glomerular accrue.

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Protocole

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Les enquêtes ont été menées conformément aux lignes directrices décrites dans le Guide for Care and Use of Laboratory Animals (US National Institutes of Health Publication No. 85-23, révisé en 1996). Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément aux approbations institutionnelles pertinentes (gouvernement de l'État Landesamt f'r Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] numéro de référence 84-02.04.2012.A397).

1. Préparation d'instruments, de solutions et d'équipements

  1. Reconstituer FITC-polysucrose 70 avec 0,9% de chlorure de sodium stérile (NaCl) à une concentration finale de 10 mg/mL (c.-à-d., 100 mg dans 10 ml de NaCl).
  2. Dialyze FITC-polysucrose 70 solution pour enlever les molécules libres fitC pendant la nuit à 4 oC (coupure de poids moléculaire [MWCO] à 10 000). Utilisez 1 L de 0,9% de NaCl stérile par 10 ml de FITC-polysucrose 70 en mouvement constant. Protégez-vous de la lumière. Aliquot le FITC-polysucrose dialysé 70 et le stocker à -20 oC.
  3. Pour le FITC-polysucrose 70 bolus, ajouter 4 'L de 10 mg/mL FITC-polysucrose 70 solution à 996 'L de 0,9% NaCl (la concentration finale de FITC-polysucrose 70: 40 'g/mL).
  4. Pour la solution d'infusion d'équilibre, ajouter 20 oL d'une solution de 10 mg/mL FITC-polysucrose 70 à 9,98 ml de NaCl stérile de 0,9 % donnant à une concentration finale de 20 g/mL.
  5. Pour la solution expérimentale, ajouter des médicaments ou des substances à la solution d'infusion (p. ex., pour l'angiotensine II [Ang II] [100 ng/kg/min] pour une souris de 25 g, ajouter 3 oL d'Ang II d'une solution de 1 mM).
  6. Pour l'opération, préparez un rasage, deux pinces chirurgicales, une paire de ciseaux chirurgicaux, deux pinces à épiler, deux pincettes fines, une paire de ciseaux fins et des écouvillons. Préparer deux fils de soie de 10 cm (4-0 à 6-0) pour les procédures de ligature.
  7. Pour le placement d'un cathéter veineux central, préparer une seringue de 10 ml avec une aiguille de 21 G. Placez la pointe de l'aiguille dans un cathéter de 30 cm de long (avec un diamètre intérieur [ID] de 0,58 mm). Connectez le cathéter de 0,58 mm à un cathéter de 10 cm (avec un ID de 0,28 mm). Couper la pointe de la plus petite oblique cathéter pour créer une pointe pointue qui est introduit dans la veine jugulaire.
  8. Préparer l'anesthésie (c.-à-d. la kétamine d'anesthésie intrapéritone, 100 mg/kg de poids corporel, et la xylazine, 5 mg/kg de poids corporel).
  9. Préparer un angiocatheter de 22 G en jetant l'aiguille et en marquant le cathéter à 1 cm de la pointe. Préchauffer le coussin chauffant à 37 oC.
  10. Préparez un dispositif de tension artérielle et changez la membrane de mesure de la pression artérielle si nécessaire.

2. Phase de préparation

  1. Cathéter urinaire
    REMARQUE : La section 2.1 suit le protocole tel que décrit par Reis et coll.7. La figure 1 et la figure 1 supplémentaire montrent le placement d'un cathéter urinaire chez des souris femelles.
    1. Anesthésiez la souris à la kétamine/xylazine (voir l'étape 1.8). Utilisez le test de pincement des orteils pour confirmer une anesthésie appropriée. Pour maintenir l'anesthésie, répétez l'anesthésie (p. ex., avec la moitié de la dose) après 60 min. Une bonne anesthésie est confirmée si le test de pincement des orteils n'entraîne pas de retrait réflexe.
      REMARQUE : Des souris FVB femelles sont utilisées dans ce protocole.
    2. Placez la souris dans un recumbency dorsal sur un coussin chauffant de 37 oC. Resserrer le bas-ventre et trouver l'ostium urétral (p. ex., au microscope).
    3. Utilisez la partie plastique du cathéter d'un angiocathéter 22 G et lubrifiez-la avec du gel de xyloïne. Introduisez-le soigneusement 3 mm dans l'ostium urétral tout en parallèle à l'axe urétral distal (Figure 1A).
    4. Tourner le haut de l'angiocatheter à 180 degrés en gardant la pointe dans l'ostium urétral et en maintenant l'axe de l'urètre (Figure 1B).
    5. Introduire le cathéter 7 mm plus loin dans la souris afin qu'il soit placé dans la vessie (Figure 1C). Ne forcez pas le cathéter au-delà de la résistance. Corriger la position du cathéter dès le début si la résistance est ressentie. Notez que si la position du cathéter urinaire est correcte, l'urine peut déjà apparaître dans le cathéter.
    6. Placer un tube brun de 1,5 ml sur le dessus de l'angiocatheter pour recueillir l'urine. Appliquer 1 ml de 0,9 % De NaCl sous-cutanée pour améliorer la production d'urine.
  2. Cathéter veineux central
    1. Raser le cou de la souris et le placer en recumbency avec la tête vers le chirurgien. Hyperétendre la tête de la souris avec un ruban adhésif.
    2. Désinfecter le cou avec 70% d'isopropanol. Faire une petite incision cutanée (5 mm) sous la mâchoire, à l'aide d'une pince à épiler et d'une paire de ciseaux. Couper la peau d'environ 1 cm dans la direction du sternum jusqu'à ce que le milieu du sternum soit atteint.
    3. Disséquer soigneusement la peau sur le côté droit du cou, à l'aide d'une paire de ciseaux. Faire une incision rectangulaire de la peau sur le côté droit de la souris pour exposer les tissus mous du cou. Utilisez une paire de ciseaux et une pince à épiler. Fixer les rabats de la peau avec deux pinces.
      REMARQUE : La veine jugulaire court le long du côté gauche de la glande thyroïde ou est légèrement couverte par le lobe droit de la glande thyroïde. Après cette étape, utilisez un microscope pour la chirurgie.
    4. Exposer soigneusement la veine jugulaire par une préparation émoussée, à l'aide de la pointe de la pince fine. Éviter les blessures aux branches veineuses.
      REMARQUE : Il pourrait être nécessaire d'enlever le tissu avec des ciseaux fins. Soyez prudent lorsque vous utilisez des ciseaux pour enlever les tissus, car il augmente le risque de saignement.
    5. Placer et fermer une ligature avec un fil de soie (4-0 à 6-0) à la partie distale de la veine jugulaire visible (vers la tête de la souris). Mettre la tension sur la ligature en fixant le fil de soie avec un ruban adhésif pour assurer une légère tension sur la veine jugulaire. Préparer une ligature autour de la partie proximale de la veine jugulaire.
    6. Remplissez le cathéter avec la solution d'infusion d'équilibre (voir l'étape 1.4) et fixez le cathéter avec un ruban adhésif de sorte que le cathéter aligne la veine jugulaire. Contrôle des bulles pour éviter l'embolie de l'air.
    7. Soulevez la veine jugulaire avec de fines pinces à épiler sur le site de l'insertion (le site d'insertion est de 1 à 2 mm proximal de la ligature). Aligner le tube parallèle à la veine jugulaire. Perforez la veine jugulaire, en visant le lumen, et insérez pour environ 2-4 mm, en parallèle de l'axe de la veine jugulaire. Évitez tout mouvement rapide.
    8. Fermez la ligature pour fixer le cathéter. Contrôle de l'étanchéité de la ligature en regardant attentivement à travers le microscope. Placez un écouvillon humide sur le site de la chirurgie.
  3. Mesure de la pression artérielle
    1. Placez le brassard de queue au bas de la queue de la souris pendant que la souris est couchée dans la charge dorsal. Démarrez les mesures et répétez-les 10fois par point de temps. Construire une moyenne à partir des mesures.
    2. Ajustez la position de la coiffe arrière si les mesures de la tension artérielle ne semblent pas correctes et si de fausses données sont produites.

3. Phase d'équilibre

  1. Changer le tube de collecte urinaire avant le début de la phase d'équilibre et le placer sur la glace.
  2. Introduire une seringue de 10 ml remplie de solution de phase d'équilibre FITC (voir l'étape 1.4) avec une aiguille de 21 G et le cathéter plus grand (avec un ID de 0,58 mm) et la placer dans la pompe à seringues.
  3. Pliez un écouvillon et placez-le autour du cathéter à petit navire (avec un ID de 0,28 mm) qui est introduit dans la veine jugulaire. Pose le cathéter à l'intérieur de l'écouvillon. Placez une pince sur l'écouvillon pour abolir le flux sanguin rétrograde ou l'embolie de l'air. Connectez une aiguille de 27 G avec une seringue de 1 ml remplie du bolus FITC à l'extrémité du cathéter à petit navire.
  4. Ouvrez la pince et appliquez le bolus FITC (100 l). Refermez la pince à nouveau et connectez le cathéter plus grand avec le cathéter plus petit. Démarrer la pompe à seringues avec 0,008 ml/min (0,480 ml/h). Poursuivre l'infusion pendant 60 min.

4. Phase expérimentale

REMARQUE : Dans cette phase, l'effet des drogues sur la permselectivité glomerulaire peut être étudié.

  1. Changer le tube urinaire (point de temps 0 min) à un autre tube brun de 1,5 ml. Placez un écouvillon autour du cathéter de petit navire et fermez une pince comme indiqué à l'étape 3.3.
  2. Déconnectez le grand cathéter du cathéter à petit navire. Changer les seringues pour les solutions de phase expérimentale (voir l'étape 1.5). Laissez la pompe d'infusion fonctionner de sorte que le grand cathéter soit rempli de la solution d'équilibre.
  3. Reconnectez les cathéters tout en évitant l'embolie de l'air et rouvrez la pince. Démarrer la pompe à seringues à 0,008 ml/min.
  4. Continuer à faire fonctionner la pompe à seringues pendant 60 min et recueillir l'urine dans le tube urinaire par la suite (urine 60 min). Placer le tube d'urine sur la glace.
  5. Sacrifiez la souris par dislocation cervicale pendant l'anesthésie. Avant l'élimination, la souris est observée pendant 5 minutes pour s'assurer qu'elle est morte.

5. Analyse d'urine

  1. Mesure de fluorescence
    1. Décongelez la piscine urinaire et diluez-la 1:10 avec de la saline tamponnée par le phosphate (PBS).
      REMARQUE : La piscine urinaire est un pool d'urine qui a été rassemblé des souris saines dans une collection d'urine de 12-24 h dans une cage métabolique.
    2. Préparer des normes pour la mesure de la fluorescence. Prenez 10 tubes bruns de 1,5 ml et étiquetez-les pour les blancs (1:10 piscine d'urine diluée) et les concentrations de 70 FITC-polysucrose suivantes (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 et 160 g/mL).
    3. Pipet 246 'L de piscine d'urine diluée dans un tube brun de 1,5 mL et ajouter 4 'L de la concentration de stock FITC-polysucrose 70 (voir l'étape 1.1) pour obtenir une concentration finale de 160 'g/mL FITC-polysucrose 70. Pipet 100 L de la piscine d'urine diluée dans tous les autres tubes.
    4. Diluer 1:2 en piécortant 100 oL du tube 70 de 160 g/mL FITC-polysucrose dans le tube de 80 g/mL et continuez avec les autres concentrations. Assurer un bon mélange des concentrations diluées (p. ex., en faisant du vortex le tube avant de continuer).
    5. Diluer les échantillons d'urine de souris (0 min, 60 min) 1:10 avec une piscine urinaire diluée.
    6. Pipette 5 ll de chaque norme FITC-polysucrose 70 concentration et des échantillons d'urine de souris comme triplitaux dans une plaque noire de 384 puits. Centrifuger la plaque à 1000 x g pour 15 s pour éviter les bulles.
    7. Analyser la plaque de 384 puits dans un lecteur de plaque. Effectuer l'excitation à 496 nm et mesurer la fluorescence à 525 nm.
  2. Mesure de créatinine
    1. Suivez les instructions du fabricant. En bref, préparer des normes de créatinine en diluant 10 'L de la solution standard de 100 mM de créatinine avec 990 'L de tampon d'assay de créatinine pour préparer une solution standard de 1 mM.
    2. Ajouter 0, 2, 4, 6, 8 et 10 l de la solution standard de 1 mM de créatinine dans une plaque de 96 puits pour générer 0, 2, 4, 6, 8 et 10 normes nmol/puits, respectivement. Ajouter un tampon d'assay à la créatinine à chaque puits pour porter le volume à 50 l.
    3. Préparer les mélanges de réaction en ajoutant 42 à 44 l de tampon d'essai de créatinine, 2 l de créatinase, 2 l de créatininase, 2 l de mélange d'enzymes créatinines, et 2 l de sonde de créatinine. Pour le blanc, utilisez 44 l de tampon d'essai de créatinine, 2 l de créatinase, 2 l de mélange d'enzymes de créatinine, et 1/2 l de sonde de créatinine.
    4. Ajouter 50 oL du mélange de réaction approprié à chaque puits dans la plaque de 96 puits et l'incuber pendant 60 min sur un shaker horizontal à 37 oC. Protéger la plaque de la lumière pendant l'incubation. Mesurer l'absorption à 570 nm sur un lecteur de plaque.
    5. Calculez les concentrations de créatininine en soustrayant la valeur vierge de toutes les lectures. Le résultat aura l'unité nanomoles/microlitre. Multipliez la concentration de créatinine par le poids moléculaire de la créatinine (113,12 ng/nmol) pour recevoir l'unité nanogrammes/microlitre.

6. Analyse des données

  1. Calculez la concentration d'urine FITC-polysucrose 70 de la courbe standard.
  2. Référence à la FITC-polysucrose 70 concentrations d'urine aux concentrations de créatinine dans l'échantillon d'urine représentatif.
  3. Référencez les échantillons d'urine de 60 min à l'urine 0 min échantillons de témoins et de souris traitées.

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Résultats

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Comme le montre la figure 2, la méthode pour tester la perméabilité glomerulaire chez la souris est constituée en trois phases. La première phase est appelée phase de préparation, dans laquelle un cathéter urinaire et un cathéter veineux central sont placés. La deuxième phase est appelée phase d'équilibre, en commençant par une injection intraveineuse de bolus de FITC-polysucrose 70 et suivie de l'infusion continue de FITC-polysucrose 70 pendant 60 min. La de...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La méthode présentée permet à l'investigateur de tester la perméabilité glomerulaire chez la souris d'une manière très sensible à l'aide d'un traceur. Avec cette méthode, des augmentations à court terme de la perméabilité glomerulaire peuvent être diagnostiquées en utilisant seulement de petites quantités d'urine. Les étapes les plus critiques pour maîtriser avec succès cette technique sont 1) développer l'expertise manuelle dans la chirurgie de souris, particulièrement dans l'annulation d'une veine centrale, 2) placer l...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient Christina Schwandt, Blanka Duvnjak et Nicola Kuhr pour leur assistance technique exceptionnelle et le Dr Dennis Sohn pour son aide à l'analyse de la fluorescence. Cette recherche a été soutenue par une subvention de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 à L.C.R. et L.S. Le bailleur de rôle n'a joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Motic SMZ168 BLMoticSMZ168BLpour la chirurgie
KL1500LCDMicroscopie Pulch et Lorenz150500lumière pour la chirurgie de la souris
MicrofederschereBraun, AesculapFD100Rciseaux fins
Durotip Feine ScherenBraun, AesculapBC210Rpour la coupe du cou
Anatomische PinzetteBraun, AesculapBD215Rpour la chirurgie  ;
Prä ; parierklemmeAesculapBJ008Rpour la chirurgie  ;
SeraflexSerag WiessnerIC108000fil de soie
Kétamine 10 %AnesthésieMedistar
Rompun (Xylazine) 2 %BayerAnesthésie
Tube en polyéthylène à alésage fin ID 0,28 mm OD 0,61 mmPortex800/100/100Cathéter
Tube en polyéthylène à alésage fin ID 0,58 mm OD 0,96 mmCathéterPortex800/100/200
Appareil Harvard 11 PlusAppareil Harvard70-2209Pousse-seringue
BD Insyte AutoguardBD381823  ; cathéter urinaire
Détecteur multimode DTX 880Beckman Coulter lecteurde
384 puits microtitrationNunc262260384 puits platte
Kit de dosage de créatinineSigma-AldrichMAK080pour mesurer la concentration de créatinine
Plaque 96 puitsNunc260836pour dosage de la créatinine  ;
Polysuccrose marqué FITC 70TBD ConsultancyFP70FITC-ficoll
Angiotensine IISigma-AldrichA9525utilisé pour tester la perméabilité glomérulaire
BP-98ASoftronpression artérielle
OTS 40.3040Medite01-4005-00Plaque chauffante pour la chirurgie
la souris Instillagel 6mLFarco-Pharma GmbHpour sonde urinaire
ExactaAesculapGT415rasoir
Microscope de la souris plaques pour la mesure de la de

Références

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