Article de méthode

Levure comme un châssis pour le développement des essais fonctionnels pour étudier l'homme P53

DOI :

10.3791/59071

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4 août 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Mutagenesis and Cancer Prevention Unit, Ospedale Policlinico San Martino, 2Department CIBIO, University of Trento, 3LAQV/REQUIMTE, Laboratory of Microbiology, Faculty of Pharmacy, University of Porto

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Présenté ici sont quatre protocoles pour construire et exploiter la levure Saccharomyces cerevisiae reporter souches pour étudier le potentiel humain de transactivation P53, les impacts de ses diverses mutations associées au cancer, co-exprimé protéines d'interaction, et les effets de petites molécules spécifiques.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La découverte que la protéine bien connue des mammifères P53 peut agir comme facteur de transcription (TF) dans la levure S. cerevisiae a permis le développement de différentes analyses fonctionnelles pour étudier les impacts du site de liaison 1) [c.-à-d., élément de réponse (RE)] variantes de séquence sur la spécificité de transactivation de P53 ou 2) mutations de TP53, co-facteurs exprimés, ou petites molécules sur l'activité de transactivation de P53. Différentes applications de recherche de base et translationnelles ont été développées. Expérimentalement, ces approches exploitent deux avantages majeurs du modèle de levure. D'une part, la facilité d'édition du génome permet la construction rapide de systèmes de reporter qualitatifs ou quantitatifs en exploitant des souches isogéniques qui ne diffèrent qu'au niveau d'un P53-RE spécifique pour étudier la spécificité de la séquence de La transactivation. D'autre part, la disponibilité de systèmes réglementés pour l'expression ectopique P53 permet l'évaluation de la transactivation dans un large éventail d'expression protéique. Les systèmes largement utilisés qui sont basés sur les gènes des journalistes de couleur, la luciferase et la croissance de la levure pour illustrer leurs principales étapes méthodologiques et évaluer de façon critique leur pouvoir prédictif sont examinés dans ce rapport. En outre, l'extrême polyvalence de ces approches peut être facilement exploitée pour étudier différents TFs, y compris P63 et P73, qui sont d'autres membres de la famille des gènes TP53.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La transcription est un processus extrêmement complexe impliquant l'organisation dynamique, spatiale et temporelle des facteurs de transcription (TFs) et des cofacteurs pour le recrutement et la modulation des polymérases d'ARN sur des régions de chromatine en réponse aux stimulus spécifiques1 . La plupart des TF, y compris le suppresseur humain de tumeur de P53, reconnaissent les éléments cis-action spécifiques sous la forme des séquences d'ADN appelées éléments de réponse (REs), qui se composent des motifs uniques (ou multiples) uniques de 6-10 nucléotides longs. Dans ces motifs, les positions individuelles peuvent montrer divers degrés de variabilité2, généralement résumépar par matrices de poids de position (PWM) ou logos3,4.

La levure S. cerevisiae est un système modèle approprié pour étudier différents aspects des protéines humaines par des essais de complémentarité, l'expression ectopique, et les essais fonctionnels, même quand un gène de levure orthologue n'est pas présent5, 6 Annonces , 7. En raison de la conservation évolutive des composants basaux du système transcriptionnel8, de nombreux TF humains (lorsqu'ils s'expriment ectopiquement dans les cellules de levure) peuvent moduler l'expression d'un gène journaliste en agissant par l'intermédiaire de promoteurs contiennent des RE appropriés. Le système de modèle de transcription présenté ici pour l'homme P53 est caractérisé par trois variables principales dont les effets peuvent être modulés : 1) la modalité d'expression et le type de P53, 2) la séquence RE contrôlant la transcription P53-dépendante, et 3) le type de gène journaliste (Figure 1A).

En ce qui concerne la modalité de l'expression P53, S. cerevisiae permet le choix des promoteurs inductibles, répressibles ou constitutifs9,10,11. En particulier, le promoteur inductible GAL1 permet l'expression basale (en utilisant le raffinose comme source de carbone) ou variable (en changeant la quantité de galactose dans les médias) d'une TF en levure. En fait, l'expression finement réglable représente un développement critique pour l'étude non seulement P53 lui-même, mais aussi d'autres protéines de la famille P5312,13.

En ce qui concerne le type de R contrôlant l'expression P53-dépendante, S. cerevisiae permet la construction de différentes souches de reporter possédant des différences uniques dans l'ER d'intérêt dans un fond autrement isogénique. Cet objectif est atteint à l'aide d'une adaptation d'une approche d'édition du génome particulièrement polyvalente développée en S. cerevisiae, appelée delitto perfetto12,14,15,16.

En outre, différents gènes de reporter (c.-à-d., URA3, HIS3, et ADE2) peuvent être employés pour évaluer qualitativement et quantitativement des activités transcriptionnelles des TF humains dans S. cerevisiae,chacun avec des dispositifs spécifiques qui peuvent être adapté aux besoins expérimentaux17,18,19,20,21. L'expression de ces gènes de journaliste confère uracil, histidine, et prototrophy d'adénine, respectivement. Le journaliste URA3 ne permet pas la croissance des cellules en présence de 5-FOA ainsi, et donc il peut être contre-sélectionné. Le système de reporter ADE2 a l'avantage qu'en plus de la sélection nutritionnelle, il permet l'identification de cellules de levure qui expriment des cellules sauvages (c.-à-d. fonctionnelles sur l'expression ADE2) ou mutantes (c.-à-d.,non fonctionnelles sur ADE2 ) P53 de la couleur de la colonie.

Par exemple, les cellules de levure exprimant le gène ADE2 génèrent des colonies blanches de taille normale sur des plaques contenant des quantités limitantes d'adénine (2,5-5,0 mg/L), tandis que celles qui le transcrivent mal ou ne le transcrivent pas apparaissent sur la même plaque que les plus petites rouges (ou roses) Colonies. Ceci est dû à l'accumulation d'un intermédiaire dans la voie biosynthétique adénine (c.-à-d., P-ribosylamino-imidazole, qui a été précédemment appelé ribotide amino-imidazole ou AIR), qui est converti pour former un pigment rouge. Le gène de journaliste ADE2 basé sur la couleur qualitative a depuis été remplacé par le quantitatif Firefly Photinus pyralis (LUC1)12,22. Plus récemment, le journaliste de l'ADE2 a été associé au journaliste de lacZ dans un essai facile à marquer, semi-quantitatif, double reporter qui peut être exploité pour sous-classer les mutants P53 en fonction de leur niveau résiduel de fonctionnalité 23.

Des reporters fluorescents tels que l'EGFP (protéine fluorescente verte améliorée) ou DsRed (protéine fluorescente rouge de Discosoma sp. ont également été employés pour l'évaluation quantitative de l'activité de transactivation liée à toutes les mutations de mauvais sens possibles dans le TP53 séquence de codage24. Enfin, la possibilité de combiner les promoteurs réglables pour l'expression de l'allèle P53 avec des souches de levure isogéniques différentes pour le gène RE et/ou reporter a conduit au développement d'une matrice de données qui génère une classification raffinée des souches de levure sérogènes et germinales associées au cancer. mutant P53 alleles25,26,27.

Les approches décrites ci-dessus sont utilisées pour mesurer l'activité transcriptionnelle de la protéine P53. Cependant, l'expression de type sauvage P53 dans la levure S. cerevisiae28 et Schizosaccharomyces pombe29 peut causer un retard de croissance, qui a été associé à l'arrêt du cycle cellulaire28,30 ou mort cellulaire31. Dans les deux cas, l'inhibition de croissance de levure est déclenchée par l'expression élevée de P53 et a été corrélée avec la modulation transcriptionnelle potentielle des gènes endogènes de levure impliqués dans la croissance cellulaire. À l'appui de cette hypothèse, le mutant P53 R273H, qui a perdu sa fonction, n'a pas interféré avec la croissance des cellules de levure lorsqu'il est exprimé à des niveaux similaires à ceux du P5332. Inversement, l'expression dans la levure du mutant toxique P53 V122A (connu pour une activité transcriptionnelle plus élevée par rapport à la nature sauvage P53) a causé un effet inhibiteur de croissance plus fort que le type sauvage P5332.

En outre, il a été démontré que l'homme MDM2 était capable d'inhiber l'activité transcriptionnelle humaine P53 dans la levure, favorisant son ubiquitination et la dégradation subséquente33. En conséquence, la capacité de MDM2 et de MDMX humains d'inhiber l'inhibition de croissance de levure P53-induite a été démontrée32,34. Dans une étude supplémentaire, une corrélation entre l'activité transcriptionnelle P53 et les niveaux d'expression d'actine a été établie, avec l'identification d'un P53 RE putatif en amont sur le gène ACT1 dans la levure32. Constamment, l'expression d'actine a été renforcée par le type sauvage P53 et encore plus par P53 V122A, mais pas par mutant P53 R273H. Inversement, l'expression d'actine par P53 a diminué dans la co-présence des inhibiteurs de P53 MDM2, MDMX, ou pifithrin-MD (un inhibiteur de petite molécule de l'activité transcriptionnelle de P53), compatible avec des résultats basés sur l'analyse de levure-croissance. Fait important, ces résultats ont établi une corrélation entre l'inhibition de la croissance induite par P53 et le degré de son activité dans la levure, qui a également été exploitée pour identifier et étudier de petites molécules modulant les fonctions P5328,34 , 35.

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Protocole

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1. Construction de souches de levure aDE2 ou LUC1 contenant un RE spécifique (yAFM-RE ou yLFM-RE)

  1. Streak a yAFM-ICORE ou yLFM-ICORE souche12,14 (ICORE - I, ISce-I endonuclease sous GAL1 promoteur; CO et contre URA3sélectionnable ; RE - journaliste KanMX4 conférant la résistance de kanamycine ; Tableau 1) à partir d'un stock de glycérol de 15 % stocké à -80 oC sur une plaque d'agar YPDA (tableau 2). Laissez-le pousser pendant 2-3 jours à 30 oC.
  2. Prenez une colonie de levures dans l'assiette fraîche (pas plus de 3 semaines) et placez-la dans un petit flacon contenant 5 ml de YPDA (tableau 2). Incuber à 30 oC pendant la nuit, en secouant à 150-200 tr/min.
  3. Le lendemain, pour enlever toutes les traces de dextrose, pelleter les cellules pendant 2 min à 3000 x g et jeter le supernatant par inversion du tube.
    REMARQUE : Effectuez toutes les centrifugations dans ce protocole à température ambiante (RT).
  4. Resuspendre la pastille cellulaire en 30-50 ml de CM pré-chauffé (média complet) contenant du galactose (tableau 2) et incuber pendant 4 h à 30 oC, en secouant à 150-200 tr/min (nécessaire pour l'induction de l'I-SceI).
  5. Centrifuger les cellules pendant 2 min à 3 000 x g et jeter le supernatant par inversion du tube.
  6. Resuspendre la pastille cellulaire dans 30-50 ml d'eau stérile. Répétez l'étape 1.5.
  7. Resuspendre la pastille cellulaire dans 10 ml d'eau stérile. Répétez l'étape 1.5.
  8. Resuspendre la pastille cellulaire en 5 ml de LiAcTE stérile (tableau 3), une solution ionique qui favorise l'utilisation de l'ADN. Répétez l'étape 1.5.
  9. Resuspendre la pastille cellulaire dans 250 L de LiAcTE stérile et transférer les cellules dans un tube de 1,5 ml. Répétez l'étape 1.5 et suspendez à nouveau la pastille cellulaire en 300-500 l de LiAcTE stérile.
  10. Pendant les lavages, dénaturer une solution de 10 mg/mL de porteur d'ADN de sperme de saumon pendant 10 min à 100 oC et refroidir immédiatement sur la glace pour le maintenir sous forme d'ADN à brin unique.
  11. Dans un tube séparé de 1,5 ml, ajouter 500 picomoles de l'oligonucléotide désiré (tableau 3), 5 l de l'ADN du porteur de sperme de saumon bouilli, 300 l de PEG stérile liAcTE (tableau 3), et 50 l de la suspension des cellules de levure (à partir de l'étape 1.9).
  12. Vortex les tubes pour 10 s à mélanger et incuber pendant 30 min à 30 oC, en secouant à 150-200 tr/min. Placer les tubes de 1,5 ml sur le côté pour favoriser les secousses.
  13. Choc thermique des cellules de levure pendant 15 min à 42 oC dans un bloc chauffant, puis centrifugeuse les cellules pour 20 s à 10 000 x g. Retirer le supernatant et resuspendre les cellules dans 1 ml d'eau stérile.
  14. Étendre 100 lde de la suspension cellulaire sur la plaque d'agar YPDA et incuber (à l'envers) pendant 1 jour à 30 oC. Pour s'assurer que des colonies bien séparées sont obtenues, répartir également 100 L d'une dilution de 1:10.
  15. Le lendemain, réplique de plaque utilisant des velours stériles sur la plaque d'agar CM contenant du dextrose et 5-FOA (tableau 2). Considérez une deuxième plaque de réplique sur une nouvelle plaque si de nombreuses cellules sont transférées (c.-à-d., une certaine croissance des cellules URA3).
  16. Trois jours plus tard, plaque de réplique sur yPDA non sélectif et YPDA contenant G418 (un antibiotique aminoglycoside semblable à la kanamycine) plaques d'agar (tableau 2), marquant chaque plaque pour faciliter leur comparaison ultérieure. Incuber les assiettes toute la nuit à 30 oC.
  17. Le lendemain, identifiez les souches de journalistes candidats provenant de colonies sensibles au G418, mais qui poussent sur des plaques YPDA (p. ex., les colonies yLFM- ou yAFM-RE). Échelle des colonies identifiées (3-6 colonies) sur une nouvelle plaque YPDA pour obtenir des isolats de colonie unique et les laisser pousser pendant 2 jours à 30 oC.
  18. Patchdes colonies de levure sinueux sur une plaque YPDA pour isoler les colonies pour d'autres analyses. Après 24 h à 30 oC, testez-les en reproduisant le placage sur une plaque d'agar DE l'YPGA (tableau 2) qui empêche la croissance des petits mutants (c.-à-d. mutants déficients respiratoires). Dans le même temps, réplique plaque sur une nouvelle plaque d'agar YPDA.
  19. Testez les correctifs corrects (c.-à-d. la croissance sur les plaques d'agar YPDA et YPGA; 1-3 colonies) à partir de l'étape 1.18 pour la présence d'une intégration correcte d'oligonucléotide par la colonie PCR. Assembler un mélange de réaction en ajoutant 5 'L de 10x PCR buffer (1,5 mM MgCl2), 2 'L de 10 picomoles/L amorces (tableau 3), 4 'L de 2,5 mM dNTP, 0,25 'L de 5 U/L Taq polymérase, et de l'eau à un volume final de 50 'L. Multipliez le mélange de réaction pour le nombre de colonies de levures qui doivent être examinées et aliquot 50 L dans chaque tube PCR. À l'aide d'une pipette, ajouter une très petite quantité de cellules de levure de la plaque d'agar YPDA dans un seul mélange de réaction PCR.
  20. Effectuer la réaction PCR avec le programme suivant : 94 oC pendant 8 min suivi de 35 cycles de dénaturation pendant 1 min à 94 oC, des amorces annealing pendant 1 min à 55 oC, et une extension de 2 min à 72 oC.
  21. Une fois la réaction terminée, chargez un aliquot de la réaction PCR (environ un dixième du volume) sur un gel d'agarose pour vérifier la bonne taille (500 pb).
  22. Séquencer le produit PCR après purification avec un kit commercial pour confirmer l'intégration de la séquence RE souhaitée à l'aide des mêmes amorces de l'étape 1.19.
  23. Après la validation de la séquence correcte, faire un stock de glycérol de 15% de la culture de souche yAFM-RE ou yLFM-RE (dans YPDA) et le stocker à -80 oC.

2. Évaluation de la capacité de transactivation des protéines P53 à l'aide de l'analyse qualitative de levure ADE2 à base de couleur

  1. Répéter les étapes 1.1 et 1.2 à l'aide de la souche yAFM-RE (tableau 1).
  2. Le lendemain, diluer la culture cellulaire (1:10) dans 30-50 ml de YPDA pré-chauffé et continuer à incuber à 30 oC en secouant jusqu'à ce que l'OD600nm atteigne 0,8-1.0 (2 h).
  3. Répétez les étapes 1.5-1.10.
  4. Dans un tube séparé de 1,5 mL, ajouter 300 à 500 ng de vecteur d'expression de levure P53 (ou contrôle) (tableau 4), 5 l du porteur d'ADN de sperme de saumon bouilli, 300 'L de PEG stérile de LiAcTE, et 50 'L de suspension de cellules de levure.
  5. Répétez les étapes 1.12 et 1.13 mais resuspendre le granule de cellules dans 300 'L d'eau stérile.
  6. Étendre 100 l l de la suspension cellulaire sur des plaques synthétiques sélectives (pour l'expression ou le vecteur de contrôle P53) contenant du dextrose comme source de carbone et une grande quantité d'adénine (tableau 2), puis incuber (à l'envers) à 30 oC pendant 2 à 3 jours.
  7. Sillonnez les colonies de levureunique unique (2-6 stries par assiette) sur une nouvelle plaque sélective et laissez-les pousser pendant la nuit à 30 oC.
  8. Le lendemain, en utilisant des velours stériles réplique plaque sur de nouvelles plaques sélectives qui permettent l'évaluation du phénotype de couleur (c.-à-d., plaques contenant du dextrose comme source de carbone, mais limitant la quantité d'adénine; Tableau 2). Incuber les assiettes à l'envers à 30 oC pendant 3 jours. Optionnellement, pour évaluer la sensibilité à la température de la protéine P53, incuber à trois températures différentes pendant 3 jours : 24 oC, 30 oC et 37 oC.
    REMARQUE: La même strie peut être réplique plaqué plusieurs fois.
  9. Pour évaluer la capacité de transactivation des protéines P53, vérifiez le phénotype à base de couleur des colonies de levures et comparez le phénotype de protéine P53 par rapport aux phénotypes vecteurs de type sauvage et vide P53.

3. Évaluation de la capacité de transactivation des protéines P53 à l'aide de l'analyse quantitative de levure LUC1 à base de luminescence

  1. Transformez les cellules de levure avec des vecteurs d'expression P53 (ou contrôle) (tableau 4) en utilisant la méthode basée sur LiAc décrite dans le protocole 2. Utilisez la souche yLFM-RE (tableau 1).
  2. Patch unique transformants sur une nouvelle plaque sélective avec la grande quantité d'adénine contenant du glucose comme source de carbone et les laisser croître à 30 oC pendant la nuit. Pour chaque type de transformation, faire 5-7 correctifs différents.
  3. Après la croissance du jour au lendemain, resuspendre une petite quantité de cellules de levure à l'aide d'un cure-dent stérile ou d'une pointe de pipette de la plaque dans un milieu sélectif synthétique contenant du dextrose ou du raffinose comme source de carbone (volume final de 200 L dans une plaque de puits transparente de 96, avec une plaque ronde ou le fond plat). Si l'expérience nécessite une expression Inductible P53, ajouter galactose au milieu du raffinose pour moduler le niveau d'induction (tableau 2).
    REMARQUE: Ces suspensions cellulaires doivent avoir un OD600nm d'environ 0,4 et pas plus élevé que 1.
  4. Mesurer l'absorption de chaque puits à OD600nm après l'expression inductible P53 (4-8 h à 30 oC avec 150-200 tr/min secouant) à l'aide d'un lecteur de plaque multilabel. Assurez-vous que les suspensions cellulaires sont homogènes en mélangeant chaque puits avec une pipette multicanal.
  5. Transférer 10-20 l de suspension cellulaire de la plaque de puits transparente 96 dans une plaque blanche de puits 384 (ou 96) et mélanger avec un volume égal (10-20 l) de tampon de lyse. Incuber de 10 à 15 min à RT sur un shaker (150-200 tr/min) pour obtenir la perméabilisation de la cellule au substrat de luciferase.
  6. Ajouter 10 à 20 l de substrat de luciferase Firefly et mesurer les unités lumineuses (LU) par un lecteur de plaques multi-étiquettes.
  7. Pour déterminer la capacité de transactivation des protéines P53, normalisez les LUs de chaque puits à l'OD600nm correspondant (unité de lumière relative, RLU). Calculer la moyenne RLU et l'écart standard de 3-4 parcelles de colonies de transformateur de levure.
  8. Comparez les données de transactivation des protéines P53 en ce qui concerne le vecteur de type sauvage et vide P53, soit en soustrayant les valeurs obtenues avec le vecteur vide, soit en divisant par les valeurs obtenues avec le vecteur vide (c.-à-d. le pli d'induction de calcul).
    REMARQUE : L'activité de transactivation P53 peut également être évaluée à l'aide de la même configuration expérimentale en présence de protéines à interaction P53 (c.-à-d. MDM2 et MDMX) et/ou y compris le traitement médicamenteux.

4. Évaluation de l'inhibition de la croissance des protéines P53 à l'aide de l'assay phénotypique de levure

  1. Transformez les cellules de levure avec des vecteurs d'expression P53/MDM2/MDMX (ou contrôle) (tableau 4) en utilisant la méthode à base de LiAc décrite à la section 2. Utiliser la souche CG379 (tableau 1) et étendre les transformateurs de levures sur des plaques sélectives minimales (tableau 2).
  2. Cultivez des cellules transformées dans un milieu sélectif minimal (tableau 2) à environ 1 OD600nm.
  3. Diluer les cellules de levure à 0,05 OD600nm dans le milieu d'induction sélective (tableau 2), et en option, ajouter une petite molécule choisie à la concentration appropriée (ou solvant seulement) pour tester son efficacité dans la réactivation mutante P53 ou dans l'inhibition mDM2- /MDMX-P53 interactions.
  4. Incuber les cellules à 30 oC sous secousses orbitales continues (200 tr/min) pendant environ 42 h (temps requis par la levure de contrôle négative pour atteindre la phase médiane du journal, environ 0,45 OD600nm).
  5. Spot 100 Aliquots L de cultures de cellules de levure sur des plaques sélectives minimales (tableau 2).
  6. Incuber pendant 2 jours à 30 oC.
  7. Mesurer la croissance des levures en comptant le nombre de colonies obtenues dans les gouttes de culture de 100 L (unité de formation de colonies, compte CFU). Par exemple, calculer l'effet de réactivation mutant des composés en tenant compte de la croissance de la levure de type sauvage P53 exprimant comme l'effet maximal possible (réglé à 100 %), tandis que la croissance des cellules exprimant le P53 mutant (mais exposée au contrôle des solvants) représente le niveau zéro de réactivation.

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Résultats

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Construction de ADE2 (En) ou LUC1 LUC1 souches de levure journaliste

Ledelitto perfettoapproach12,14,15,16 a été adapté pour permettre la construction de souches de levure squelin P53 reporte...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les essais à base de levure se sont avérés utiles pour étudier divers aspects des fonctions protéiques P53. Ces essais sont particulièrement sensibles pour évaluer le potentiel de transactivation P53 vers des variantes de sites cibles RE, y compris l'évaluation des polymorphismes fonctionnels. L'utilisation de journalistes de couleur ainsi que la miniaturisation de l'analyse de la luciférase se traduisent par des essais rentables et relativement évolutifs. En outre, le test d'inhibition de la croissance est potentielleme...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions l'Union Européenne (Fonds FEDER POCI/01/0145/FEDER/007728 par programa Operacional Factores de Competitividade - COMPETE) et les Fonds Nationaux (FCT/MEC, Fundaço para a Ciência e Tecnologia et Ministério da Educaçào e Ciência) sous le Accord de partenariat PT2020 UID/QUI/50006/2019 et les projets (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581. Bourses FCT: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Ce travail a été soutenu par la Compagnia S. Paolo, Turin, Italie (Projet 2017.0526) et le Ministère de la Santé, (Projet 5x1000, 2015 et 2016; recherche actuelle 2016). Nous remercions profondément la Dre Teresa Làpez-Arias Montenegro (Université de Trente, laboratoires d'enseignement des sciences expérimentales) pour son aide à l'enregistrement vidéo.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acide L-aspartiqueSIGMA11189
QIAquick PCRPurification Kit QIAGEN28104
L-PhénylalanineSIGMA78019
PeptoneBD Bacto211677
Levure ex+A2 :C26tractBD Bacto212750
Difco Base d’azote de levure sans acides aminés et sulfate d’ammoniumBDTM233520
Acétate de lithium dihydratéSIGMA517992
gélose bactériologique de type ABiokar DiagnosticsA1010 HA
G418 Sel de disulfateSIGMAA1720
Sulfate d’ammoniumSIGMAA2939
Monochlorure de L-arginineSIGMAA5131
Sel d’hémisulfate d’adénineSIGMAA9126
Tampon de lyse passive 5xPROMEGAE1941
Bright-Glo Luciferase Assay System  ;PROMEGAE2620
5-FOAZymo ResearchF9001
D-(+)-GalactoseSIGMAG0750
Acide L-glutamiqueSIGMAG1251
Dextrose  ;SIGMAG7021
L-HistidineSIGMAH8125
L-IsoleucineSIGMAI2752
L-LysineSIGMAL1262
L-LeucineSIGMAL8000
L-MéthionineSIGMAM2893
PEGSIGMAP3640
D-(+)-Raffinose PentahydrateSIGMAR0250
L-SerineSIGMAS4500
L-TryptophaneSIGMAT0271
L-ThréonineSIGMAT8625
UracilSIGMA U0750
L-ValineSIGMAV0500

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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