Fluorescence par résonance énergétique axée sur le transfert en temps réel observation systems de l’ADN brin réaction d’échange médiée par Rad51 ont été développés. En utilisant les protocoles présentés ici, nous sommes en mesure de détecter la formation des intermédiaires réactionnels et leur transformation en produits, tout en également analyser la cinétique enzymatique de la réaction.
La réaction d’échange de brin ADN médiée par Rad51 est une étape cruciale de la recombinaison homologue. Dans cette réaction, Rad51 forme un filament de nucléoprotéine sur ADN simple brin (ssDNA) et capture l’ADN à double brin (dsDNA) non spécifiquement pour interroger pour une séquence homologue. Après avoir rencontré une homologie, Rad51 catalyse échange brin ADN pour atténuer l’appariement avec le brin complémentaire de l’ADN double brin de l’ADN simple brin. Cette réaction est fortement réglementée par nombreuses protéines accessary in vivo. Bien que des épreuves biochimiques conventionnels ont été avec succès employés pour examiner le rôle de cette protéine accessoire in vitro, analyse de la cinétique de formation intermédiaire et sa progression dans un produit final s’est avérée difficile due à la intermédiaires de nature instable et transitoire de la réaction. D’observer ces étapes réactionnelles directement dans la solution, transfert d’énergie de fluorescence par résonance (FRET)-observation en temps réel de systèmes de cette réaction ont été mis en place. L’analyse cinétique des observations en temps réel montre que la réaction d’échange de brin ADN médiée par Rad51 obéit à un modèle de triple réaction impliquant la formation d’un intermédiaire trois brins de l’ADN, la maturation de cet intermédiaire et la libération d’ADN simple brin de l’intermédiaire mature. Le complexe Swi5-1 francs suisses, une protéine accessary conservée chez les eucaryotes, améliore fortement les deuxième et troisième étapes de cette réaction. Les frette-analyses présentés ici permettent de découvrir les mécanismes moléculaires par lequel recombinaison accessary protéines stimulent l’activité d’échange brin ADN de Rad51. Le principal objectif du présent protocole est de renforcer le répertoire des techniques disponibles aux chercheurs dans le domaine de la recombinaison homologue, particulièrement ceux qui travaillent avec des protéines d’espèces autres que les Schizosaccharomyces pombe, afin que le conservation évolutive des conclusions présentées ici peut être déterminée.
Recombinaison homologue (HR) facilite le brassage de l’information génétique entre deux molécules d’ADN différents. Ressources humaines est essentiel pour deux phénomènes biologiques fondamentaux : la génération de la diversité génétique au cours de la gamétogenèse1 ainsi que la réparation de l’ADN double-brin tombe (CDB)2 au cours de la mitose. CDB est la forme la plus grave de dommages à l’ADN et constitue une rupture dans le chromosome. Une réparation incorrecte des CDB peut causer des réarrangements chromosomiques et instabilité génomique, qui sont les deux caractéristiques de cancer3.
La réaction d’échange de brin ADN est la phase centrale des ressources humaines. La protéine Rad51, qui est membre de la famille de RecA type hautement conservée de recombinases, est la protéine clé qui catalyse cette réaction dans eukaryotes4,5. Dans cette réaction, Rad51 se lie à l’ADN simple brin (ssDNA) généré par nucléolytiques traitement de la fin de l’ORD et formes une nucléoprotéine hélicoïdale complexe appelé le filament présynaptique. Ce filament contracte intacte ADN à double brin (dsDNA) non spécifique pour rechercher une séquence homologue. Quand le filament trouve une séquence homologue, une réaction intermédiaire contenant trois brins ADN est formée et le filament de Rad51 Médie brin échange au sein de cette structure6,7,8. Pour accomplir efficacement cette réaction, Rad51 nécessite plusieurs types de protéines accessoires tels que les gènes BRCA1 et BRCA2, produits de breast cancer susceptibility gènes9,10.
Comprendre comment les facteurs accessoires réglementent Rad51 est une étape intégrale en découvrant les causes de l’instabilité génomique au cours de la tumorigenèse. Bien que beaucoup de recherche est centré sur les effets de ces facteurs sur la formation des filaments présynaptique et stabilité11,12,13,14,15,16, la contribution de ces facteurs de formation de l’intermédiaire de trois brins et sa transformation en produit final est encore incertaine. Observer ces étapes réactionnelles grâce à des expériences biochimiques conventionnels est très difficile parce que l’intermédiaire de trois brins est instable et sujette à s’effondrer par des manipulations expérimentales courantes comme la déprotéinisation des échantillons ou électrophorèse.
Pour contourner ce problème, nous avons adapté les deux systèmes d’observation en temps réel développé antérieurement de la réaction d’échange de brin ADN à l’aide de transfert d’énergie de fluorescence par résonance (FRET) : l’ADN brin appariement et ADN chapelet déplacement dosages17, 18 (figure 1). Dans le brin d’ADN appariement dosage, Rad51 formes un filament présynaptique à la fluorescéine amidite (FAM) – nommé ADN simple brin et puis homologue carboxy-x-rhodamine (ROX) – étiqueté dsDNA est ajouté pour initier la réaction d’échange de brin. Quand le filament intercepte le dsDNA ROX-étiquetés et forme l’intermédiaire de trois brins, les deux fluorophores entrent en proximité et émission de fluorescence de FAM est piégée par ROX (Figure 1 a). Dans l’essai de déplacement DNA strand, un filament présynaptique formé sur non-marqué ssDNA est incubé avec FAM et ROX dsDNA marqués au double. Lorsque brin exchange est terminée et le FAM étiqueté ssDNA est libéré par les trois brins intermédiaire, l’émission de FAM augmente car FAM n’est plus à proximité de ROX (Figure 1 b). Ces tests permettent d’observer la formation d’intermédiaires de trois brins et leur transformation en produits finis en temps réel sans aucune perturbation à la réaction.
Grâce à ce système d’observation en temps réel, nous avons constaté que la réaction d’échange de brin ADN médiée par Rad51 procède en trois étapes-y compris la formation de la première réaction intermédiaire (C1), transitioning de premier intermédiaire dans un deuxième intermédiaire (C2) et la libération de l’ADN simple brin du C219. Nous avons également constaté que la levure fission (S. pombe) Swi5-1 francs suisses, qui est un évolutivement conservés Rad51 protéine complexe13,16,20,21,22, stimule la transition de C1-C2 et libération d’ADN simple brin par C2 d’une manière qui est tributaire de l’hydrolyse de l’ATP par Rad5119.
Si ces résultats sont évolutivement conservés reste inconnu. Ce protocole est fourni avec l’espoir que les chercheurs dans le domaine des ressources humaines, en particulier ceux qui travaillent avec des protéines provenant d’organismes autres que S. pombe, peuvent appliquer ces techniques pour déterminer la mesure dans laquelle le mécanisme moléculaire axée sur la Rad51 échange de brin est conservée. En outre, ces techniques ont prouvé très efficace pour déterminer le rôle de S. pombe Swi5-1 francs suisses. Ainsi, c’est une prédiction rationnelle que ces techniques seront inestimables en découvrant les rôles précis des autres facteurs accessoires HR.
Ici, nous avons décrit un protocole détaillé qui utilise frette pour mesurer les échanges brin ADN pilotée par Rad51 en temps réel. Ce qui est important, ces mesures permettent la détermination de la cinétique de la réaction. Alors que les descriptions données ci-dessus sont suffisantes pour reproduire nos résultats publiés, il y a plusieurs points critiques qui seront décrites dans cette section. En outre, les avantages et les inconvénients des méthodologies fondées sur la frette pour étudier l’échange de brin de l’ADN seront discutés, ainsi que l’application de ces techniques à étudier d’autres aspects du métabolisme de l’ADN.
Comme avec toutes les reconstitutions biochimiques, veiller à ce que tous les substrats de la réaction sont d’une grande pureté est indispensable. Il fait preuve de négligence à assumer l’absence de contaminantes activités basées uniquement sur la pureté apparente d’une préparation de protéines jugée par coloration au bleu de Coomassie. En particulier, la présence de traces de nucléases ou hélicases peut affecter considérablement les résultats de tests de l’appariement et le déplacement. Ainsi, nous encourageons vivement les essais pour de telles activités chaque fois qu’un nouveau lot de protéine est purifié. En outre, il est prudent de vérifier la pureté des substrats d’ADN synthétisés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide natifs. Malgré les nombreuses entreprises garantissant la pureté des oligonucléotides, nous avons souvent trouvé grâce à nos propres tests que la pureté de l’ADN synthétisé peut varier entre les lots.
Il est important de considérer les deux points suivants lorsqu’il procède à des expériences avec des cuvettes de quartz. Tout d’abord, certaines protéines sont enclins à lier des cuvettes de quartz de façon non spécifique. Pour contrer cela, monolaurate de BSA et polyoxyethylenesorbitan sont inclus dans les mémoires tampons de réaction. Deuxièmement, la température a un effet dramatique sur l’intensité de fluorescence et de la vitesse de réaction. Pour minimiser cet effet, la cuvette de quartz doit être préalablement incubée à 37 ° C avant de l’utiliser.
Bien que des épreuves biochimiques conventionnels ont été extrêmement utiles dans l’étude d’échange de brin de l’ADN, ils ont plusieurs inconvénients. Dans une expérience typique de l’évolution temporelle, une réaction est incubée à une certaine température et parties aliquotes sont retirées à intervalles souhaités et déprotéinisés par traitement avec du détergent et protéase de mettre fin à la réaction. Au terme de l’évolution temporelle, les échantillons sont ensuite soumis à l’électrophorèse pour séparer les substrats de l’ADN des produits. L’avantage majeur de la méthode décrite ici est qu’elle permet l’observation en temps réel de la réaction sans aucune perturbation. N’importe quel validant lors de la réaction peut être inspectée sans interruption de la réaction elle-même et il n’y a aucun besoin de deproteinize les échantillons ou les soumettre aux forces potentiellement perturbateurs de l’électrophorèse. Cela est particulièrement pertinent pour l’analyse des structures d’ADN labiles.
Malgré ces atouts au cours des essais conventionnels, la méthode décrite ici a quelques inconvénients. Alors que l’utilisation d’oligonucléotide ADN substrats pour l’échange de brin simplifie l’interprétation des résultats, il est important de se rappeler que ces substrats ne ressemblent pas les substrats de l’ADN impliquée dans les ressources humaines dans la cellule. Certains tests classiques utilisent des substrats d’ADN plasmidique taille, qui sont plus susceptibles de refléter le nombre de paires de bases qui sont échangés en vivo. En outre, l’utilisation de substrats de dsDNA circulaire topologiquement restreinte dans un sous-ensemble de tests classiques peut recréer au moins partiellement les tensions dans l’ADN physiologique.
L’application de la méthode décrite ici a commencé à se désagréger les mécanismes moléculaires d’échange brin ADN pilotée par Rad51. Néanmoins, il y a beaucoup de questions intéressantes qui reste à trancher. Il y a des preuves claires que HR au cours de la méiose requiert Rad51 et Dmc1, la recombinase de RecA type spécifiques à la méiose dans les eukaryotes24. Cependant, l’absence de différences biochimiques majeures entre ces deux recombinases a déconcerté les chercheurs dans le domaine pour les années. En outre, les rôles de nombreux groupes distincts des facteurs accessoires de recombinaison a été un sujet focal de la recherche dans le domaine des ressources humaines. En plus d’élucider les différences biochimiques entre Rad51 et Dmc1, notre objectif est d’étudier et de comparer les effets des facteurs accessoires différents de recombinaison sur la cinétique de l’ADN brin échange dans l’immédiat. Enfin, il est important de souligner que la méthodologie axée sur la frette décrite ici n’est pas limitée à l’étude de l’ADN brin échange. Avec des modifications relativement mineures, nous envisageons de nombreux types d’applications pour cette technique en enquêtant sur fonctionnellement diverses protéines impliquées dans l’ADN du métabolisme25,26,27,28. Nous espérons que l’évolution de la situation décrite ici fournira plus options aux chercheurs appartenant à nombreuses disciplines différentes.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé par les subventions pour la recherche scientifique (A) (18H 03985) et sur des domaines novateurs (15H 05974) hi, for Young Scientists (B) (17K 15061) à BA et pour Scientific Research (B) (18H 02371) à HT de la société japonaise pour la Promotion de la Science ( JSPS).
0.2 x 1.0 cm quartz cuvette | Hellma Analytics | 105-250-15-40 | |
1.0 x 1.0 cm quartz cuvette | Hellma Analytics | 101-10-40 | |
adenosine triphosphate (ATP) | Sigma | A2383 | |
DynaFit | BioKin, Ldt. | DynaFit is a program to analyze kinetics of biochemical reactions. | |
Fluorescent labeled and non-labeled oligonucleotides | Eurofins Genomics | The sequences of oligos are listed in Table. 1. | |
Magnetic stirrer | Aisis (Japan) | CM1609 | |
PCR machine | TAKARA (Japan) | TP600 | TAKARA PCR Thermal Cycler Dice |
Spectrofluorometer | JASCO | FP8300 | Contains a peltier temperature controller and magnetic stirrer system |
Syringe | HAMILTON | 1702RN 25ul SYR (22s/2"/2) |