Phagocytose des macrophages alvéolaires et dégagement de bactéries chez la souris

Résumé

Nous rapportons ici les méthodes courantes pour analyser la fonction phagocytaire des macrophages alvéolaires murines et clairance bactérienne du poumon. Ces méthodes d’étudient de la phagocytose des perles de l’isothiocyanate de fluorescéine in vitro et in vivo phagocytose de Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. On décrit également une méthode de dégagement de P. aeruginosa chez la souris.

Résumé

Les macrophages alvéolaires (AMs) gardent l’espace alvéolaire des poumons. Phagocytose par AMs joue un rôle essentiel dans la défense contre l’invasion des agents pathogènes, l’élimination des cellules mortes ou des particules étrangères et dans la résolution des réactions inflammatoires et le remodelage des tissus, des processus qui sont véhiculées par les différents récepteurs de surface l’AMs. Nous rapportons ici les méthodes pour l’analyse de la fonction phagocytaire des AMs à l’aide d’essais in vitro et in vivo et stratégies expérimentales de différencier entre les récepteurs de reconnaissance de pattern - récepteur complément- et Fc gamma médiée par les récepteurs phagocytose. Finalement, nous discutons une méthode afin d’établir et de caractériser un modèle de pneumonie P. aeruginosa chez la souris afin d’évaluer la clairance bactérienne in vivo. Ces tests représentent les méthodes les plus courantes pour évaluer les fonctions AM et peuvent également être utilisés pour étudier la fonction des macrophages et la clairance bactérienne dans d’autres organes.

Introduction

AMs sont les principaux phagocytes résidents dans les alvéoles à l’étape de repos et l’un des principaux acteurs de la réponse immunitaire innée grâce à la reconnaissance et l’internalisation des pathogènes inhalés et particules étrangères^1,2. Il a été rapporté que AMs sont essentiels pour le dédouanement rapid de nombreux pathogènes pulmonaires telles que P. aeruginosa et Klebsiella pneumonie^3,4, donc une carence dans la phagocytose AM aboutit souvent à des voies respiratoires infections, telles que la pneumonie aiguë, entraînant des....

Protocole

Ce protocole suit les directives de l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de Eastern Virginia Medical School.

1. fluorescent perles phagocytose

1. Euthanasier la souris (C57BL/6J, âgés de 6 semaines femelle) de CO₂ asphyxie selon les protocoles IACUC pour l’euthanasie éthique des animaux.
2. Poser la ventre de la souris sur une planche de dissection, couverte avec du papier absorbant. Cerner ses pattes avec ses membres tout et accrocher une chaîne sous ses dents avant de tirer sa tête arrière de façon que la trachée est positionnée directement et niveau.
3. Mouiller la gorge, poitrine et ve....

Résultats

Nous avons tout d’abord réalisé l’expérience pour analyser la phagocytose de souris primaires AMs. Tout au long de toutes les analyses, nous avons comparé les AMs isolées des souris^KO de WT et TRIM72. Comme illustré dans la Figure 1A, microscopie à fluorescence a révélé que la phagocytose des perles de verre-FITC de souris primaires AMs survient après 1 h d’incubation. Figure 1 B montr.......

Discussion

Tout en remplissant une fonction d’échange de gaz, le poumon confronte constamment allergènes, pathogènes et les particules étrangères. AMs fournissent la première ligne de défense en raison de leur fonction principale, à savoir la phagocytose. AMs est également coordonnent avec d’autres cellules de système immunitaires à détruire les agents pathogènes et la résolution de l’inflammation. Ici, nous avons décrit les méthodes permettant d’évaluer plus précisément la phagocytose par AMs isolé par les poumons de souris. Le pr.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Aiguille 18-G	Nipro Medical  ;	CI+1832-2C	Biologie moléculaire grade
2,7-diaminofluorène (DAF)	Sigma-Aldrich	D17106	Biologie moléculaire grade
70 % Ethanol	Decon Labs Inc.	18C27B	Grade analytique
Plaque à 96 puits	Corning	3603	Biologie cellulaire grade
Tampon de lyse ACK	Technologies	A10492	Grade de biologie moléculaire
Alexa fluor-488 Bioparticule de Zymosan-A	Thermofisher	Scientific Z23373	Biologie moléculaire grade
C5 sérum déficient  ;	Sigma-Aldrich	C1163	Réactif biochimique
Centrifuge	Labnet International	C0160-R
Cytospin 4 Cytocentrifuge	Thermofisher	Scientific A78300101 Issue 11
DMEM Cell Culture	Gibco	11995-065	Biologie cellulaire grade
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	Biologie cellulaire grade
Flow Cytomètre	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Jo Software	FlowJo, LLC
Forceps	Dumont	0508-SS/45-PS-1	Convient pour la dissection d’animaux de laboratoire
FITC Billes de latex carboxylées	Sigma-Aldrich	L4530	Biologie cellulaire
grade GFP-P. aeruginosa	ATCC	101045GFP	Convient pour  ; tests d’infection cellulaire
Plat à fond de verre	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C
Seringue haute pression	Penn-Century	FMJ-250	Convient pour une utilisation sur des animaux de laboratoire
Homogénéisateur	Omni International	TH-01
Peroxyde d’hydrogène	Sigma-Aldrich	H1009	Microscope à fluorescence inversée de qualité analytique
	Olympus	IX73
Kétamine Chlorhydrate	Hospira	CA-2904	Qualité pharmaceutique
Shandon Kwik-Diff Stains	Thermofisher Scientific	9990700	Biologie cellulaire
grade LB Agar	Fisher Scientific	BP1425	Biologie moléculaire grade
LB Broth	Fisher Scientific	BP1427	Biologie moléculaire
grade MicroSprayer Aerosolizer	Penn-Century	IA-1C	Convient pour une utilisation sur des animaux
de laboratoire Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	P6148	Qualité réactif
PBS	Gibco	20012-027	Biologie cellulaire lapin
anti-SRBC-IgG  ;	MP Biomedicals	55806	Convient pour les immuno-dosages
de lapin anti-SRBC-IgM  ;	Cedarline Laboratories	CL9000-M	Convient pour les immuno-dosages
Ciseaux	Miltex	5-2	Convient pour la dissection d’animaux de laboratoire
Laryngoscope pour petits animaux	Penn-Century	LS-2	Convient pour une utilisation sur des animaux de laboratoire
Dodécylsulfate de sodium (SDS)	BioRad	1610301	Ciseaux à ressort de qualité analytique
(Med)	Outils scientifiques fins	15012-12	Convient pour la dissection d’animaux
de laboratoire Ciseaux à ressort (petits)	Outils scientifiques fins	91500-09	Convient pour la dissection d’animaux de laboratoire
Globules rouges de mouton (SRBC)  ;	MP Biomedicals	55876	SRBC lavés et conservés
Urée	Sigma-Aldrich	U5378	Biologie moléculaire grade
Xylazine  ;	Akorn Animal Health	59399-110-20	Qualité pharmaceutique

Life Media de qualité biologie cellulaire