Manipulation de la fonction du gène en mexicain Agassizii

Bethany  A. Stahl; James  B. Jaggard; Jacqueline  S.R. Chin; Johanna  E. Kowalko; Alex  C. Keene; Erik  R. Duboué

doi:10.3791/59093

Article de méthode

Manipulation de la fonction du gène en mexicain Agassizii

DOI :

10.3791/59093

⸱

22 avril 2019

Bethany A. Stahl¹^,² , James B. Jaggard¹^,² , Jacqueline S.R. Chin¹^,² , Johanna E. Kowalko²^,³ , Alex C. Keene¹^,² , Erik R. Duboué²^,³

¹Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University, ²Jupiter Life Science Initiative, Florida Atlantic University, ³Harriet L. Wilkes Honors College, Florida Atlantic University

Dans cet article

Résumé

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Les auteurs décrivent les approches pour la manipulation des gènes dans le système de modèle évolutionniste Astyanax mexicanus. Trois techniques différentes sont décrites : Tol2 médiée par transgénèse, manipulation ciblée du génome à l’aide de CRISPR/Cas9 et précipitation d’expression utilisant les morpholinos. Ces outils devraient faciliter l’enquête directe des gènes qui sous-tendent la variation entre les formes de surface - et cavernicoles.

Résumé

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Animaux de la grotte d’un système convaincant pour étudier les mécanismes évolutifs et bases génétiques des changements dans nombreux traits complexes, y compris la dégénérescence de l’oeil, l’albinisme, perte de sommeil, une hyperphagie et traitement sensoriel. Espèce d’agassizii de partout dans le monde affiche une évolution convergente des caractéristiques morphologiques et comportementales en raison des pressions environnementales partagées entre systèmes de grottes différentes. Grotte de diverses espèces ont été étudiés en laboratoire. Le tétra aveugle, Astyanax mexicanus, avec des formes voyants et aveugles, a fourni un aperçu unique des processus biologiques et moléculaires qui sous-tendent l’évolution des caractères complexes et est bien placée comme un système modèle émergent. Alors que les gènes candidats régissant l’évolution des divers processus biologiques ont été identifiés chez a. mexicanus, la capacité de valider un rôle des gènes individuels a été limitée. L’application de transgenèse et de la technologie de modification génétique a le potentiel pour surmonter cet obstacle significatif et d’étudier les mécanismes qui sous-tendent l’évolution des traits complexes. Nous décrivons ici une méthode différente pour manipuler l’expression des gènes chez a. mexicanus. Approches incluent l’utilisation de morpholinos, Tol2 transgénèse, et systèmes d’édition de gène, couramment utilisés en poisson-zèbre et autres poissons des modèles, pour manipuler la fonction du gène chez a. mexicanus. Ces protocoles incluent des descriptions détaillées des procédures de reproduction temporisée, la collecte des ovocytes fécondés, des injections et la sélection des animaux génétiquement modifiés. Permettront à ces approches méthodologiques pour l’étude des mécanismes génétiques et neuronales qui sous-tendent l’évolution des divers traits chez a. mexicanus.

Introduction

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Depuis l' Origine des espècesde Darwin¹scientifiques ont gagné profonde mieux comprendre comment des traits sont en forme évolutives en réponse à des pressions environnementales et écologiques définies, grâce à la grotte organismes². Le tétra aveugle, a. mexicanus, se compose d’eyed populations « surfaces » ancestrales qui peuplent les rivières dans tout le Mexique et le sud du Texas et d’au moins 29 populations géographiquement isolées des formes dérivées de la grotte qui habitent la Sierra del Abra et d’autres régions du Nord-est du Mexique³. Un certain nombre de traits associé....

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Protocole

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1. Morpholino oligo design

Remarque : Les séquences pour a. mexicanus sont offerts par le Centre National d’Information sur la biotechnologie (NCBI) gène et NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), ainsi que depuis le navigateur de génome Ensembl (https://www.ensembl.org). Lorsque vous concevez un morpholino pour utilisation dans les deux formes de surface - et cavernicoles, il est essentiel d’identifier une variation génétique entre les morphes à ce stade, alors ces régions génétiques peuvent être évitées en tant que cibles pour les morpholinos. Toute variante polymorphe au sein d’un site cible de morpholino peut conduire à liaison ....

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Résultats

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Plusieurs populations de roche troglodytique a. mexicanus montrent sommeil réduit et éveil/activité accrue par rapport à leurs congénères de surface-logement¹⁴. Hypocrétine/orexine (HCRT) est un neuropeptide hautement conservé, qui agit pour augmenter l’éveil, et des aberrations dans la voie HCRT causent la narcolepsie chez les humains et autres mammifères⁴⁷^,⁴⁸. Nous avons déjà démontré cette grotte a. mexicanus ont augme.......

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Discussion

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Ici, nous avons fourni une méthodologie permettant de manipuler la fonction du gène en utilisant les morpholinos, gène CRISPR/Cas9 édition et méthodologie de la transgénèse. La richesse des technologies génétiques et l’optimisation de ces systèmes chez le poisson zèbre permettra probablement pour le transfert de ces outils dans a. mexicanus avec facilité,⁵². Des découvertes récentes ont utilisé ces approches dans a. mexicanus, mais elles restent sous-utilisées dans l’enquête de d.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Les auteurs remercient Sunishka Thakur pour son aide dans le génotypage et imagerie le poisson mutant oca2 illustrée au tableau 2. Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation (NSF) prix 1656574 à A.C.K., award NSF 1754321 J.K. et A.C.K. et prix National Institutes of Health (NIH) R21NS105071 A.C.K. et E.R.D.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fish breeding & egg supplies
Filet de pêche à mailles fines	Penn Plax	BN4
Chauffage	d’aquarium Aqueon	100106108
Pièges à œufs	NA sur mesure		Concevez et créez une grille en plastique à placer au fond de l’aquarium pour protéger les œufs
Pipettes en verre	Fisher Scientific	13-678-20C
Ampoules pipette	Fisher Scientific	03-448-21
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Moules à oeufs	Adaptive Science Tools	TU-1
Morpholino supplies
Control Morpholino	Gene Tools, LLC	Contrôle standard olio
Custom Morpholino	Gene Tools, LLC	NA
Phenol Red	Sigma Aldrich	P0290-100ML
em>CRISPR supplies
Cas9 Plasmide	AddGene	46757
GoTaq ADN polymérase	Promega	M3001
KOD Hot Start Taq	EMD Millipore	71-842-3
Amorces	Integrated DNA Technologies	Custom
T7 Megascript Kit	Ambion/Thermofisher	AM1333
miRNeasy Kit	Qiagen	217004
mMessage mMachine T3 kit	Ambion/Thermofisher	AM1348
MinElute Kit	Qiagen	28204
Tol2 transgenesis supplies
pCS-zT2TP plasmide	Kawakami et al., 2004	Demande de l’auteur
CutSmart Buffer	New England Biolabs	B7204
NotI-HF Restriction Enzyme	New England Biolabs	R3189
Kit de purification PCR	Qiagen	28104
SP6 mMessenger Kit	Ambion/Thermofisher	AM1340
Alimentations par microinjection
Tubes capillaires en verre	Sutter Instruments	BF100-58-10
Extracteur de pipettes	Sutter Instruments	P-97
Picoinjecteur	Warner Instruments	PLI-100A
Micromanipulateur	World Precision Instruments	M3301R
Support de micromanipulateur	World Precision Instruments	M10
Micmanipulator	Base World Precision Instruments	Base en acier de 10 lb

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Références

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Darwin, C. On the Origin of Species by Means of Natural Selection. , D. Appleton and Company. (1859).
Culver, D. C., Pipan, T. The Biology of Caves and Other Subterranean Habitats. , Oxford University Press. New York, NY. (2009).
Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R.

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Mots-clés

Manipulation g n tique injection de morpholinos dition g nomique CRISPR transg n se Tol2 proc dure de microinjection collecte d embryons criblage ph notypique extraction d ADN imagerie calcique

Manipulation de la fonction du gène en mexicain Agassizii

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