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Article de méthode

Absorption de nouvelles nanoparticules lipides enduit contenant Falcarindiol par des cellules souches mésenchymateuses humaines

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DOI :

10.3791/59094

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9 février 2019

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1Department of Chemical Engineering, Biotechnology and Environmental Technology, University of Southern Denmark, 2Center for Single Particle Science and Engineering (SPSE), Institute for Molecular Medicine, Health Sciences, University of Southern Denmark, 3Department of Mechanical Engineering and Material Science, Duke University, 4School of Pharmacy, University of Nottingham

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit l’encapsulation de falcarindiol en lipides enduit 74 nm nanoparticules. L’assimilation de nanoparticules par des cellules souches humaines en gouttelettes lipidiques est surveillée par imagerie de fluorescence et confocale. Nanoparticules sont fabriqués par la méthode de l’injection rapide du solvant en déplacement, et leur taille est mesurée par la technique de diffusion dynamique de la lumière.

Résumé

Nanoparticules font l’objet d’un intérêt accru pour les systèmes de délivrance de médicaments pour le traitement du cancer. Nanoparticules de lipides enduit sont inspirent dans la structure et la taille des lipoprotéines de basse densité (LDL) parce que les cellules cancéreuses ont un besoin accru de cholestérol à proliférer, et cela a été exploitée comme un mécanisme de prestation de produits anticancéreux au cancer cellules. En outre, selon la chimie pharmaceutique, encapsulant la drogue peut être avantageuse pour éviter la dégradation du médicament lors de circulation in vivo. Par conséquent, dans cette étude, cette conception est utilisée pour fabriquer des nanoparticules de lipides enduit de la falcarindiol de médicaments anticancéreux, offrant un potentiel nouveau système de délivrance de falcarindiol afin de stabiliser sa structure chimique contre la dégradation et améliorer sa absorption par des tumeurs. Nanoparticules de falcarindiol, avec une monocouche de phospholipides et de cholestérol encapsulant le cœur purifié de drogue de la particule, ont été conçus. L’enduit monocouche de lipides se compose de 1,2-distéaroyl-SN-glycéro-3-phosphocholine (CSCB), le cholestérol (Chol) et 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) ainsi que de la fluorescence étiquette DiI (rapports molaires de 43:50:5:2). Les nanoparticules sont fabriquées en utilisant la méthode d’injection rapide, qui est une technique simple et rapide pour précipiter des nanoparticules par bon-solvant anti-solvant échange. Il se compose d’une injection rapide d’une solution d’éthanol contenant les composants de nanoparticules en phase aqueuse. La taille des nanoparticules fluorescentes est mesurée à l’aide de diffusion dynamique de la lumière (DLS) à 74,1 ± 6,7 nm. L’absorption des nanoparticules est testée dans des cellules souches mésenchymateuses (CSM) humaines et photographié à l’aide de la fluorescence et la microscopie confocale. L’absorption des nanoparticules est observée dans le CSM, ce qui suggère la possibilité d’un tel médicament stable livraison système pour falcarindiol.

Introduction

Nanoparticules de lipides enduit voient un intérêt accru en ce qui concerne leur fonction comme systèmes de délivrance de médicaments pour le cancer thérapie1. Les cancers ont une altération reprogrammation lipide-métabolique2 et un besoin accru de cholestérol à proliférer3. Ils surexpriment LDLs1 et admirez LDLs plus que les cellules normales, dans la mesure où nombre de LDL d’un patient atteint de cancer peut même descendre de4. Captation des LDL favorise les phénotypes agressif5 entraînant une prolifération et invasion du sein cancer6. Une abondance de récepteurs LDL (LDLRs) est un indicateur pronostique du potentiel métastatique7. Inspiré par le LDL et son absorption par les cellules cancéreuses, une nouvelle stratégie a été appelée : rendre la drogue ressemblent aux aliments le cancer8. Ainsi, ces nouvelles nanoparticules drogue livraison conceptions8,9,,10 ont été inspirés par la conception de base et lipides-stabilisé du LDL naturel11 comme un mécanisme de prestation des médicaments anticancéreux pour les cellules cancéreuses. Ce passif ciblant le système prend en charge l’enveloppage de, notamment, médicaments hydrophobes, qui sont habituellement donnés sous forme posologique orale mais fournissent seulement une petite quantité de la drogue dans la circulation sanguine, limitant ainsi leur efficacité attendus12. Comme avec les liposomes stealth13, un revêtement de polyéthylène glycol (PEG) contribue à réduire toute réponse immunologique et s’étend de la circulation dans le sang pour l’absorption optimale de tumeur par la prétendue renforcement de perméation et effet de rétention (EPR) 14 , 15. Toutefois, en plus de, dans certains cas, l’instabilité dans la circulation et la distribution indésirable dans le système de16, certains obstacles demeurent non résolus, tels que comment et dans quelle mesure ces nanoparticules sont recueillies par les cellules et ce qui est leur sort intracellulaire. C’est ici que cet article se penche sur l’absorption de nanoparticules de médicament anticancéreux hydrophobe particulier falcarindiol, à l’aide de confocale et épifluorescence, techniques d’imagerie.

L’objectif de cette étude est de fabriquer des nanoparticules lipidiques-enduit de falcarindiol et d’étudier leur absorption intracellulaire dans les CSM. Ainsi, potentiellement stabiliser son administration, surmonter les défis associés à la livraison et à améliorer la biodisponibilité. Ainsi évaluer un nouveau système de livraison pour ce médicament anticancéreux. Auparavant, les falcarindiol a été administré oralement par une forte concentration purifiée falcarindiol comme un supplément alimentaire17. Cependant, il y a nécessité d’une approche plus structurée de livrer ce médicament prometteur. Par conséquent, les nanoparticules falcarindiol, phospholipides et cholestérol encapsulant monocouche avec la drogue purifiée qui constituent le noyau de la particule, ont été conçus. La méthode de l’injection rapide du solvant, déplacement, comme l’a récemment développé par Needham et al. 8, est utilisé dans cette étude pour encapsuler le polyacétylène falcarindiol.

La méthode a déjà été utilisée pour la fabrication de nanoparticules lipidiques pour encapsuler des18,d’agents d’imagerie diagnostique19, mais aussi de tester des molécules (trioléine)27 et médicaments (orlistat, stéarate de niclosamide)8 ,27,28. C’est une technique relativement simple lorsque réalisées avec les molécules de droite. Il forme des particules de taille nanométrique, à la limite de leur critique nucléation (~ 20 nm de diamètre), des solutés hydrophobes hautement insolubles, dissoutes dans un solvant polaire. L’échange de solvant se fait par une injection rapide de la solution organique dans un excès d’antisolvent (généralement, une phase aqueuse en un organique du 1 / 9 : rapport volume aqueux)20,21.

La conception compositionnelle des nanoparticules donnent lieu à de multiples avantages. Les composants de DSPC:Chol donnent une monocouche très serrée, presque imperméable, biocompatible et biodégradable. Le PEG fournit une interface stériquement stabilisante qui agit comme un bouclier d’opsonisation par le système immunitaire, ralentit toute l’absorption par le système réticulo-endothélial (foie et rate) et protégeant contre le système des phagocytes mononuclées, empêchant leur rétention et la dégradation du système immunitaire et par conséquent, augmentant leur circulation mi-temps dans le sang,22. Cela permet aux particules de circuler jusqu'à ce qu’ils extravasate sur les sites de malades, comme les tumeurs, où le système vasculaire n’est pas étanche, ce qui permet de EPR-effet de donner lieu à une accumulation passive des particules. En outre, la couche lipidique permet d’avoir le meilleur contrôle sur la taille des nanoparticules en piégeant cinétiquement l’âme à son noyau critique dimension27,28. Lipides induisent diverses propriétés de surface (y compris le peptide ciblant, qui n’était pas encore disponible pour ce projet), un noyau de drogue pure et une faible polydispersité22,27,28. La méthode utilisée pour l’analyse granulométrique est DLS, une technique qui permet aux chercheurs de mesurer la taille d’un grand nombre de particules en même temps. Toutefois, cette méthode peut fausser les mesures aux plus grandes tailles, si les nanoparticules ne sont pas monodisperses23. Cette question est évaluée avec la couche lipidique ainsi. Plus de détails sur ces conceptions fondamentales et la quantification de toutes les caractéristiques sont données dans les autres publications27,28.

La drogue encapsulée dans des nanoparticules est falcarindiol, un polyacétylène alimentaire trouvé dans les plantes de la famille des Apiaceae. C’est un métabolite secondaire du type de polyacétylènes aliphatiques de17C qui a été trouvé pour afficher des effets favorisant la santé, y compris l’activité anti-inflammatoire, des effets antibactériens et cytotoxicité contre un large éventail de lignées de cellules cancéreuses. Sa forte réactivité est liée à sa capacité d’interagir avec diverses biomolécules, agissant comme un agent alkylant très réactif contre mercapto et groupes aminés24. Falcarindiol a déjà été démontré pour réduire le nombre de lésions néoplasiques dans le côlon17,25, bien que les mécanismes biologiques sont encore inconnues. Cependant, c’est la pensée qu’il interagit avec des biomolécules telles que NF-κB, COX1, COX-2 et cytokines, inhibant leurs tumeur la progression et les cellule prolifération processus, menant à arrêtant le cycle cellulaire, le réticulum endoplasmique (re) mettre l’accent et l’apoptose 17,26 dans les cellules cancéreuses. Falcarindiol est utilisé dans cette étude comme un médicament anticancéreux exemple en raison de son potentiel anticancéreux et le mécanisme sont actuellement étudiés, et parce qu’il montre des effets anticancéreux prometteurs. L’assimilation des nanoparticules est testée au CSM et photographié à l’aide d’épifluorescence et microscopie confocale. Ce type de cellule a été choisi en raison de sa grande taille, ce qui les rend idéales pour la microscopie.

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Protocole

1. nanoparticules synthèse par solvant rapide déplacement technique

  1. Mettre en place ce qui suit pour la préparation des nanoparticules : un concentrateur de chauffage/échantillon de bloc, un dessiccateur, un système de distribution numérique avec une seringue de verre de 1 mL, un flacon de verre de 12 mL, un agitateur magnétique, une puce magnétique (15 mm x 4,5 mm, dans une forme cylindrique avec revêtement de polytétrafluoroéthylène [PTFE]) à l’intérieur de la fiole de verre et un évaporateur rotatoire.
  2. Distribuer 2,4 mL de 250 µM falcarindiol stock dissous dans un mélange 70 % EtOH eau dans un flacon à scintillation.
  3. Faire évaporer la fraction liquide, utiliser le concentrateur de l’échantillon pendant environ 4 h, pour obtenir falcarindiol sec.
    1. Placer le flacon à scintillation dans le chauffe-bloc ; le concentrateur d’échantillon fournit des gaz sur l’échantillon à l’aide d’aiguilles en acier inoxydable, concentration de l’échantillon. Évaporer à température ambiante ; n’utilisez pas de chaleur.
  4. Une fois sec, ajoutez les éléments suivants de l’enduit de lipides dans le flacon de scintillation susmentionné : 16,3 µL de mM 31,64 DSPC chloroforme solution mère, 3,4 µL de solution mère de chloroforme 17,82 mM DSPE PEG 2000, 24 µL de stock de chloroforme cholestérol 25 mM solution et 6 µL de 4 mM DiI solution mère de chloroforme. Nettoyer la seringue avec du chloroforme après avoir ajouté chaque composant pour éviter la contamination croisée.
    Attention : Fermez immédiatement les flacons contenant des lipides afin que le solvant ne s’évapore et, ainsi, modifier la concentration. Travailler sous une hotte.
    Remarque : Les concentrations des solutions mères de chloroforme peuvent varier, selon le fournisseur chimique ou les dilutions faites en laboratoire.
  5. Envelopper le flacon avec du papier d’aluminium pour protéger DiI de lumière. Laisser l’échantillon pendant la nuit dans le dessiccateur pour évaporer le chloroforme.
  6. Dissoudre l’échantillon desséché en éthanol absolu pour un volume final de 1,2 mL, ce qui donne la concentration finale de DSPC DSPE PEG 2000, cholestérol et DiI de 0,43 mM, 0,05 mM, 0,5 mM et 0,02 mM, respectivement. Cette solution représente la phase organique.
  7. Prenez le flacon de verre de 12 mL, remplissez-le avec 9 mL d’eau purifiée et ajouter la puce magnétique dans le flacon contenant 9 mL d’eau. Garder le flacon sur l’agitateur magnétique, en remuant à 500 tr/min (Figure 1).
  8. Fixer la seringue de verre de 1 mL pour le système de distribution et le nettoyer avec du chloroforme pour éviter toute contamination. Ceci en, lentement en tirant le chloroforme dans la seringue de verre et dispenser manuellement dans un collecteur de déchets au moins 10 tiems.
    Attention : Ceci doit se faire sous une hotte aspirante.
  9. Amorcer la seringue avec de l’éthanol. Amorçage remplace le solvant usé, ainsi que supprime les bulles d’air.
    Attention : Ceci doit se faire sous une hotte aspirante.
  10. À l’aide de la seringue, aspirer 1 mL de la phase organique.
  11. Insérer la seringue dans le flacon en verre, jusqu’au milieu du tatouage 9 mL et maintenir stable dans le milieu de la cuvette (comme illustré à la Figure 1).
  12. Injecter la solution à la vitesse choisie d’injection (833 µL/s) en appuyant sur le bouton dispense sur le système de distribution (Figure 2). Cette opération génère 10 mL de nanoparticules de lipides enduit 50 µM de falcarindiol dans 10 % d’eau contenant de l’éthanol.
    Remarque : Cette vitesse d’injection a été trouvée pour atteindre les particules les plus fines, obtention d’une granulométrie étroite. Il est essentiel de s’assurer que la seringue est dans le centre, stable et droite lors de la distribution de la solution.
  13. Immédiatement après l’injection, retirer la cuvette de l’agitateur et transférer l’échantillon dans un ballon à fond rond 50 mL (RBF).
  14. Fixez la BRF sur l’évaporateur rotatif et évaporer 1 mL de solvant organique, à l’aide de l’évaporateur rotatif à température ambiante. Eviter la formation de bulles excédentaire.
    Remarque : Cette étape prendra environ 5 min.
  15. Transférer la suspension de nanoparticules de la BRF à un autre flacon de verre de 12 mL. Assurez-vous que le volume est de 9 mL. Diviser l’échantillon en deux flacons en verre 12 mL (put 4,5 mL chacune).
  16. Ajouter 0,5 mL d’eau ultrapure à l’un des flacons et 0,5 mL de 10 x la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans le flacon d’autre. Prendre 1 ml de chaque échantillon pour la mesure de taille de particules.

2. analyse granulométrique en utilisant la technique DLS

NOTE : Mensurations taille ont été effectuées à l’aide d’un analyseur de DLS qui détermine les distributions granulométriques. Il est équipé d’un laser de 100 mW fonctionnant à une longueur d’onde de 662,2 nm et avec un avalanche photodiode détecteur placé à un angle de 90° pour l’angle d’incidence. Le faisceau est dispersé par les nanoparticules et détecté par le photodétecteur.

  1. Allumez l’instrument DLS et régler la température à 20 ° C, jusqu'à ce qu’il se stabilise.
  2. Définissez les paramètres de l’instrument comme suit : temps d’acquisition de données = 4 s, le nombre d’acquisitions = 30, fonction d’auto-atténuation = marche et les délais d’atténuation automatique = 0.
  3. Remplir la cuvette en plastique avec 1 mL de suspension de nanoparticules et de commencer la mesure.
  4. Rapport de la taille mesurée selon le solvant utilisé (eau ou PBS).
    Remarque : La mesure dans du PBS est faite d’avoir une idée approximative de la taille des cellules dans le milieu en traitant les cellules. Le traitement de la cellule se fera avec les nanoparticules dissous dans l’eau.
  5. Répéter les mesures 24 h après la synthèse, à vérifier pour l’agrégation de particules.

3. cellule traitement

  1. Cultiver le CSM dans un milieu minimum essentiel (MEM) additionné de 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % la pénicilline/streptomycine, dans une chambre humifiée à 37° C, avec 5 % de CO2.
    Attention : Travailler dans la hotte à flux laminaire stérile pour obtenir la procédure 3.1, 3.2 et 3.3.
  2. Graines environ 50 000 cellules afin d’obtenir une densité d’environ 30 % sur précédemment absolu-EtOH-stérilisé #1.5 lamelles placées en plaques 6 puits. Ajouter MEM afin d’avoir un volume final de 3 mL à chaque puits. Incuber pendant 24 h dans les mêmes conditions qu’à l’étape 3.1. Les cellules 24h avant le traitement des semences.
    Remarque : Il est essentiel que les cellules sont ensemencées au moins 24h avant le traitement de la nanoparticule, pour s’assurer que les cellules sont dans un confluent adéquate.
  3. Sans enlever le support, ajouter 3 µL de la solution de nanoparticules, pour une concentration finale de falcarindiol de 5 µM. incuber pendant 24 h dans les mêmes conditions qu’à l’étape 3.1.
    NOTE : Préparation des nanoparticules a été réalisée le jour du traitement cellulaire, afin d’éviter l’agrégation des particules.
  4. Par la suite, après 24 h de traitement, laver les cellules 2 x avec du PBS, fixer à 4 % de formaldéhyde pendant 10 min à température ambiante, puis rangez-les dans du PBS à 4° C pendant plusieurs mois jusqu'à ce que l’image.
    Attention : Ceci doit se faire sous une hotte aspirante.
    1. Par ailleurs, après la fixation, un 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) coloration nucléaire peut être effectuée. Pour ce faire, après la fixation des cellules, permeabilize eux avec 0,1 % Triton X-100 pendant 30 min, les laver 2 x avec PBS et leur tache avec 250 µL de 300 nM DAPI pendant 5 minutes, abri de la lumière.

4. microscopie

  1. Microscopie en fluorescence
    1. Utiliser un microscope à fluorescence widefield équipé d’une caméra CCD électron-multiplié pour acquérir des images. Utilisez les 150 x objectif huile NA 1,45 et le canal de GFP LP.
  2. Microscopie confocale
    1. Acquisition d’images de microscopie confocale, utilisant les 63 x NA 1.4 objectif d’huile, un laser à l’Argon (514 nm) pour DiI et un laser à deux photons (780 nm) pour DAPI, pour vérifier l’absorption des nanoparticules dans les cellules.

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Résultats

Deux types différents de nanoparticules ont été fabriquées, à savoir pure falcarindiol nanoparticules et nanoparticules de lipides enduit falcarindiol. Différentes concentrations de lipides et de cholestérol ont été testées. Comme indiqué dans le tableau 1, les nanoparticules non couchés formés dans l’eau et mesurées dans du PBS avaient un diamètre de 71 ± 20,3 nm avec un indice de polydispersité (PDI) de 0,571. Ces paramètres ont été mesurés sur un analyseur de DLS. Les ...

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Discussion

Un protocole détaillé de fabrication de nanoparticules de lipides enduit pour la délivrance de médicaments avec le simple, méthode d’injection rapide rapide, reproductible et évolutive de ripage solvant a été suivi de27,28 et est présenté dans cet article, comme appliquée à falcarindiol. En contrôlant la vitesse de l’injection de la phase organique en phase aqueuse et en utilisant des lipides de revêtement à des concentrations appropriées pour enrober le noyau fa...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient Dr Moustapha Kassem (hôpital de l’Université d’Odense, Danemark) pour les cellules souches mésenchymateuses humaines. Les auteurs tiennent à remercier le centre danois de Bioimaging médical pour l’accès à leurs microscopes. Les auteurs remercient les fondements Carlsberg et Villum financièrement (E.A.C.). Les auteurs tiennent à souligner l’appui financier apporté par l’attribution du titre de professeur Niels Bohr de la Danish National Research Foundation.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Flacon à col vissé de 12 mL (verre transparent, filetage 15-425, 66 X 18,5 mm)Microlab Aarhus A/SML 33154LP
Plaques 6 puitsGreiner Bio One International GmbH657160
Absolute EthanolEMD Millipore (VWR)EM8.18760.1000
ChloroformRathburn Chemicals Ltd.RH1009
CholestérolAvanti Polar Lipids, Inc.700000P
Microscope confocalZeiss LSM510
Epaisseur #1.5Paul Marienfeld GmbH & Co117650
DessiccateurAuto-construction
DiIInvitrogenD282
DLSBeckman CoulterDelsaMAXpro 3167-DMP
DSPC (Stock de chloroforme)Avanti Polar Lipids, Inc.850365C  ;
DSPE PEG 2000 (stock de chloroforme)Avanti Polar Lipids, Inc.880120C
eVol XRSGE science analytique, Trajan Scientific Australia Pty Ltd.2910200
Sérum fœtal bovinGibco10270-106
Miccroscope à fluorescenceOlymous IX81avec manuel TIRF et Andor iXon EMCCD
Incubateur Panasonic  ;MCO-18AC
Puce magnétiqueVWR Chemicals15 x 4,5 mmForme cylindrique avec revêtement en PTFE
Agitateur magnétiqueIKART-10
Minimum Essential MediaGibco32561-029
Pastilles PBS pour la culture cellulaireVWR Chemicals97062-732
Pen/streptocoqueVWR Chemicals97063-708
Tampon phosphate salin (PBS, pH 7,4)Thermo Fisher10010031
Évaporateur rotatifRotavapor, Bü ; chi Labortechnik AGR-210
Concentrateur d’échantillons  ;Stuart, Cole-Parmer Instrument Company, LLCSBHCONC/1

Références

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