Visualisation fluorescente de l'ARN étiqueté mangue dans les gels de polyacrylamide par l'intermédiaire d'une méthode de coloration

Résumé

Ici, nous présentons une méthode sensible, rapide et discriminante de coloration post-gel pour imager les ARN marqués avec des aptamers de mangue d'ARN I, II, III, ou IV, utilisant des gels indigènes ou dénaturants de gel de polyacrylamide (PAGE). Après avoir utilisé des gels PAGE standard, l'ARN étiqueté mangue peut être facilement taché de TO1-Biotine, puis analysé à l'aide de lecteurs de fluorescence couramment disponibles.

Résumé

Les gels polyacrylamides indigènes et dénaturants sont couramment utilisés pour caractériser la mobilité complexe de ribonucleoprotein (RNP) et pour mesurer la taille de l'ARN, respectivement. Comme de nombreuses techniques d'imagerie par gel utilisent des taches non spécifiques ou des sondes de fluorophore coûteuses, des méthodologies sensibles, discriminatoires et économiques d'imagerie par gel sont hautement souhaitables. Les séquences de noyau de mangue d'ARN sont de petits motifs de séquence (19-22 nt) qui, une fois fermés par une tige arbitraire d'ARN, peuvent être simplement et peu coûteux annexés à un ARN d'intérêt. Ces étiquettes de mangue se lient avec une forte affinité et spécificité à un ligand fluorophore thiazole-orange appelé TO1-Biotine, qui devient des milliers de fois plus fluorescent lors de la liaison. Ici, nous montrons que la mangue I, II, III, et IV peut être utilisé pour imager spécifiquement l'ARN dans les gels à haute sensibilité. Aussi peu que 62,5 fmol d'ARN dans les gels indigènes et 125 fmol d'ARN dans les gels dénaturants peuvent être détectés par des gels de trempage dans un tampon d'imagerie contenant du potassium et 20 nM TO1-Biotine pendant 30 min. Nous démontrons la spécificité du système Mango-étiqueté par l'imagerie d'un ARN bactérien 6S marqué par Mango dans le contexte d'un mélange complexe de l'ARN bactérien total.

Introduction

La mangue est un système de marquage à ARN composé d'un ensemble de quatre petits aptamers à ARN fluorescents qui se lient étroitement (liaison nanomolaire) à de simples dérivés du thiazole-orange (TO1-Biotine, Figure 1A)^1,2^,3 . Lors de la liaison, la fluorescence de ce ligand est multipliée par 1 000 à 4 000 selon l'aptamer spécifique. La haute luminosité du système Mango, qui pour Mango III dépasse celle de la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP), combinée avec l'affinité de liaison nanomolaire des aptamers de mango d'ARN, lui permet d'être employé dans l'imagerie et la purification de l'ARN complexes^2,4.

Les structures de rayons X de Mango I⁵, II⁶, et III⁷ ont été déterminées à haute résolution, et les trois aptamers utilisent un quadruplex d'ARN pour lier TO1-Biotine (Figure 1B- D). Les noyaux compacts des trois aptamères sont isolés de la séquence externe de l'ARN par des motifs d'adaptateur compacts. Mango I et II utilisent tous deux un adaptateur flexible de boucle gNRA-like pour relier leurs cœurs de mangue à un duplex arbitraire d'ARN (figure 1B,C). En revanche, Mango III utilise un motif triplex rigide pour connecter son noyau à une hélice arbitraire de l'ARN (Figure 1D, résidus violets), alors que la structure de Mango IV n'est pas actuellement connue. Comme le noyau liant ligand de chacun de ces aptamères est séparé de la séquence externe de l'ARN par ces adaptateurs hélicoïdaux, il semble probable qu'ils puissent tous être simplement incorporés dans une variété d'ARN. L'ARN régulateur bactérien 6S (Mango I), les composants de la levure spliceosome (Mango I), et l'homme 5S ARN, U6 ARN, et un C / D scaRNA (Mango II et IV) ont tous été marqués avec succès de cette façon^2,8, ce qui suggère que de nombreux les ARN biologiques peuvent être étiquetés à l'aide du système d'aptamer DE mango d'ARN.

Les gels dénaturants et indigènes sont couramment utilisés pour étudier les ARN. Les gels dénaturants sont souvent utilisés pour juger de la taille de l'ARN ou du traitement de l'ARN, mais généralement, dans le cas d'une tache nordique, par exemple, nécessitent plusieurs étapes lentes et séquentielles afin de générer une image. Alors que d'autres aptamers fluorogènes d'ARN, tels quel'épinard d'ARN et le brocoli, ont été employés avec succès pour l'imagerie de gel 9, aucun système fluorogenic d'aptamer à ce jour possède la luminosité élevée et l'affinité du système de mangue, le faisant d'un intérêt considérable d'étudier les capacités d'imagerie par gel de Mango. Dans cette étude, nous nous sommes demandé si le système de mango d'ARN pourrait être simplement étendu à l'imagerie de gel, car les longueurs d'onde d'excitation et d'émission de TO1-Biotine (510 nm et 535 nm, respectivement) sont appropriées pour l'imagerie dans le canal d'eGFP commun à la plupart fluorescent instrumentation de balayage de gel.

Le protocole de coloration post-gel présenté ici fournit un moyen rapide de détecter spécifiquement les molécules d'ARN étiquetées mango dans les gels d'électrophorèse de gel polyacrylamide (PAGE) indigènes et dénaturants. Cette méthode de coloration consiste à tremper les gels dans un tampon contenant du potassium et de la TO1-Biotine. Les aptamers de mangue d'ARN sont g-quadruplex basés et le potassium est exigé pour stabiliser de telles structures. À l'aide de l'ARN transcrit à partir de modèles d'ADN minimaux encodants par Mango (voir la section du protocole), nous pouvons simplement détecter aussi peu que 62,5 fmol d'ARN dans les gels indigènes et 125 fmol d'ARN dans les gels dénaturants, en utilisant un protocole de coloration simple. Contrairement aux taches d'acide nucléique non spécifiques courantes (voir Tableau des matériaux, référence à SG à partir de là), nous pouvons clairement identifier l'ARN marqué par mango, même lorsque des concentrations élevées d'ARN total non étiqueté sont présents dans l'échantillon.

Protocole

1. Préparation des réactifs

1. SOLUTION de coloration TO1-Biotine (solution de coloration de gel)
   1. Faire 1 L de 1 M tampon de phosphate à pH 7,2 à 25 oC en ajoutant 342 ml de 1 M de Na₂HPO₄ et 158 ml de 1 M NaH₂PO₄. Ajuster le pH à 7,2 à 50 mm en ajoutant la solution de phosphate appropriée. Filtre stérile à l'aide d'un filtre de 0,2 m et rangez la solution dans des plastiques à température ambiante.
   2. Préparer la solution de coloration 5x gel (sans TO1-Biotine) comme suit. Faire une solution de 1 L en mélangeant 247,5 ml de ddH₂O, 700 ml de 1 M KCl, 50 ml de tampon de phosphate de 1 M (pH 7,2) et 2,5 mL d'entre10 20. Filtre stérile à l'aide d'un filtre de 0,2 m et stockez la solution dans des plastiques. Il peut être stocké à température ambiante.
      REMARQUE : MgCl₂ peut être ajouté à cette solution si nécessaire car elle peut potentiellement stabiliser les complexes d'ARN. Cela aura un impact modeste sur le signal fluorescent².
   3. Faites une solution de coloration de gel 1x en utilisant la solution de coloration de gel 5x de l'étape 1.1.2 et, immédiatement avant l'utilisation, complétez-la avec le fluorophore de TO1-Biotine (voir tableau des matériaux)à une concentration finale de 20 nM. Par exemple, ajouter 20 ml de solution de coloration de gel 5x à 80 ml d'eau déionisée pour faire 100 ml de solution de coloration de gel 1x, et ajouter 2 l d'un stock de 1 mM to1-Biotine (préparé en diméthylformamide).
      REMARQUE : Le coefficient d'extinction du colorant TO1-Biotine à 500 nm est de 63 000 M^-1cm^-1, mesuré dans la solution de coloration¹.
2. Page dénaturante (2x solution de chargement de gel dénaturant et solutions A, B, C, ammonium persulfate, et téramethylethylenediamine)
   1. Préparer 50 ml de solution de chargement de gel dénaturant 2x en mélangeant 40 ml de formamide, 0,5 ml d'acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA, pH 8.0), et 9,5 mL ddH₂O. La solution peut être stockée à température ambiante. Les colorants de chargement ne sont pas ajoutés à cette solution car elle peut obscurcir l'imagerie fluorescente.
   2. Préparer 2x dénaturant le colorant de chargement de gel comme suit. Lors de la purification de l'ARN et de l'ADN oligonucléotides, ajoutez 0,5 mL de 2,5 % (w/v) bleu bromophenol (BB) et 0,5 mL de 2,5 % (w/v) cyanol xylène (XC) à la solution décrite à l'étape 1,2,1, et ajoutez 8,5 mL de ddH₂O au lieu de 9,5 mL. La solution peut être stockée à température ambiante.
   3. Préparer 100 ml de solution A en pesant 200,2 g d'urée (poids de la formule : 60,06 g/mol) et en l'ajoutant à 312,5 ml de 40 % 19:1 acrylamide :N,N'-methylenebisacrylamide. Remuer avec une barre magnétique à la vitesse maximale jusqu'à dissolution (environ 3 h) et faire la solution à 500 ml en utilisant ddH₂O. Notez que les concentrations finales sont 6.667 M urée et 25% 19:1 acrylamide:N,N'-méthylenebisacrylamide. Conserver à 4 oC dans des plastiques propres.
   4. Préparer 1 L de la solution B en pesant 400,4 g d'urée et faire la solution à 1 L avec ddH₂O; remuer jusqu'à ce que l'urée soit dissoute. La solution B peut être conservée à température ambiante.
   5. Préparer la solution C (10x Tris-borate-EDTA [TBE]) comme suit. Préparer 4 L de 10x TBE en pesant 432 g de base Tris et 220 g d'acide borique, en ajoutant 160 ml de 0,5 M EDTA avec un pH de 8 (filtré), et en constituant la solution à 4 L avec ddH₂O. Un grand stock de ce tampon est fait car il est également utilisé comme tampon de fonctionnement de gel.
   6. Préparer 10% de persulfate d'ammonium (APS) en dissolvant 1 g d'APS dans un volume total de 10 ml de ddH₂O. Magasin à 4 oC.
   7. Gardez la tétramethylethylenediamine (TEMED) à portée de main. Conservez-le à 4 oC avec la solution APS.
3. Native PAGE (2x solution de chargement de gel indigène)
   1. Préparer 50 ml de solution de chargement de gel indigène 2x en mélangeant 25 ml de glycérol à 100 %, 10 ml de solution de coloration de gel 5x et 15 ml de ddH₂O pour compenser la solution à 50 ml.
      REMARQUE : Comme dans la section de gel dénaturant, les colorants de chargement peuvent être ajoutés à ce stock, mais leur addition peut potentiellement obscurcir le signal fluorescent dans le gel et, par conséquent, devrait être évité.

2. Préparation et chargement des gels dénaturants

1. Préparer un gel dénaturant avec un pourcentage approprié en suivant le tableau 1. Considérez le système spécifique de coulée de gel ; Les gels de 30 ml sont couramment utilisés. Le pourcentage de gel approprié peut être estimé en utilisant le tableau 2: sélectionnez le pourcentage de polyacrylamide lorsque les colorants BB et XC ont des motricités plus rapides et plus lentes, respectivement, que l'ARN d'intérêt, afin d'assurer une séparation à haute bande dans la taille pertinente gamme.
2. Mélangez les solutions A, B et C selon le tableau 1 et ajoutez APS et TEMED immédiatement avant de verser le gel. Mélangez bien les solutions dans des plastiques propres.
3. Verser la solution de gel dans un appareil de coulée de gel approprié, après s'être assuré que tous les composants sont scrupuleusement propres. Soulevez un côté de l'appareil de sorte que le gel soit légèrement incliné lors de la coulée, afin d'éviter que les bulles d'air ne se coincent dans le gel lui-même.
4. Insérez le peigne désiré et laissez-le polymériser (environ 30 min). Observez la polymérisation en cherchant de près un changement dans l'indice de réfraction autour des puits de gel. Maquillez le réservoir de gel en utilisant la solution 1x C (1x TBE) et retirez soigneusement le peigne. À l'aide d'une seringue, aspirer les puits immédiatement avant le chargement de l'échantillon.
5. Préparer les échantillons dénaturantcommes comme suit. Ajoutez 2x solution de chargement de gel dénaturant aux échantillons d'ARN d'intérêt pour faire la solution de chargement de gel dénaturant 1x et la chaleur-dénature à 95 oC pendant 5 min en utilisant un thermocycleur ou un bain d'eau.
6. Avant de charger les échantillons, refroidissez-les à l'air plusieurs minutes jusqu'à ce qu'ils soient frais au toucher. Chargez les échantillons en les superposant au fond de chaque puits, à l'aide de pointes de chargement de gel.
   REMARQUE : Des pointes rondes peuvent être utilisées pour les gels d'épaisseur de 1 mm ou plus; utiliser des pointes plates pour les gels plus minces.
7. Exécuter les gels dénaturants à température ambiante. Assurez-vous que la puissance est suffisamment faible pour que les plaques de verre du système de gel ne se fissurent pas.
   REMARQUE : Dans notre laboratoire, 28 W pour des plaques de 20 cm x 16 cm étaient suffisants à cette fin.

3. Préparation et chargement des gels indigènes

1. Préparer un gel indigène avec un pourcentage approprié en se référant au tableau 3. Considérez le système spécifique de coulée de gel, mais gardez à l'esprit que les gels de 30 ml sont couramment utilisés. Mélanger les solutions de 1x TBE, 40% 29:1 acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide, et le glycérol selon le tableau 3, et ajouter APS et TEMED immédiatement avant de verser le gel. Procédez comme décrit dans les étapes 2.3 et 2.4.
2. Préparer des échantillons indigènes en ajoutant 2x solution de chargement de gel indigène aux échantillons d'ARN d'intérêt pour faire la solution 1x et lui permettre d'incuber à température ambiante pendant 100 min avant d'exécuter le gel pour assurer le pliage complet de l'ARN.
3. Faire fonctionner le gel indigène dans une chambre froide à 4 oC, en veillant à ce que la puissance soit suffisamment faible pour ne pas chauffer le gel.
   REMARQUE : Dans notre laboratoire, 14 W pour des plaques de 20 cm x 16 cm suffisait à cette fin.

4. Préparation de l'ARN par transcription T7 de ruissellement

REMARQUE : Les séquences d'ADN utilisées pour la transcription de ruissellement¹⁰ des constructions d'ARN Mango ont été commandées commercialement. Dans cette méthode, les oligonucléotides d'ADN contenant le complément inverse (RC) de la séquence à transcrire et du promoteur T7 sont hybrides à une séquence de brin supérieur de promoteur T7 et ensuite transcrit in vitro. Ci-dessous, pour chaque oligonucléotide, le RC de la séquence de base de mangue est montré en gras et le RC de la région de promoteur T7 est montré en italique. Les résidus dans la police régulière correspondent à des régions hélicoïdales complémentaires par ailleurs arbitraires requises pour permettre au noyau de mangue de se plier correctement.

Mangue I: GCA CGT ACT CTC CTC CCc GCA CCG CC CTT CGT ACG TGC CTA TAG TGA GTC GTA TTA AAG
Mangue II: GCA CGT ACT CTC CTC TTC CTC TCT CCT CCT C GTACG TGC CTA TAG TGA GTC GTA TTA AAG
Mangue III: GGC ACG TAC GAA TAT ACC ACA TAC CAA TCC TTC CTT CGT ACG TGC CTA TAG TGA GTC GTA TTA AAG
Mangue IV: GCA CGT ACT CGC CTC ATC ACC ACT CCC TCG GTA CGT GCC TAT AGT GAG TCG TAT TAA AG
T7 Top Strand: CTT TAA TAC GAC TCA CTA TAG G

1. Purification du gel préparifice des oligonucléotides d'ADN
   1. Pour une synthèse de l'ADN à l'échelle de l'amol de 0,2 , resuspendre l'oligonucléotide d'ADN déprotégé en 100 oL de ddH₂O et 100 oL de colorant de chargement dénaturant 2x (à partir de l'étape 1.2.2). Dans ce cas, y compris les colorants de chargement de gel dans la solution de chargement à la même concentration que dans l'étape 1.2.2 est préféré.
   2. Purifier l'oligonucléotide d'ADN à l'aide d'un gel dénaturant à l'échelle préparative de 50 ml du pourcentage approprié de polyacrylamide; utiliser le tableau 2 pour choisir le pourcentage de gel. Par exemple, utilisez un gel de 8 % pour une séquence de 50 nt. Idéalement, le bleu bromophénol devrait courir plus vite que l'oligonucléotide, et le cyanol de xylène devrait courir plus lentement.
      REMARQUE : Dans notre laboratoire, de tels gels ont été coulés à l'aide d'espaceurs de coulée d'une épaisseur de 1,5 mm et d'un peigne à chargement de gel avec des puits de 2 à 2,5 cm de large.
   3. Chargez 100 L des solutions d'oligonucléotide d'ADN préparées à l'étape 4.1.2 par gel préparatif ainsi que décrites dans les étapes 2.4-2.7.
   4. Séchez soigneusement l'extérieur du gel, retirez les plaques de verre et recouvrez les deux côtés du gel d'une pellicule plastique. Placez-le sur un écran d'imagerie fluorescente (les plaques de chromatographie à couches minces à l'aluminium imprégnées de fluorophore sont une solution économique) et utilisez une lampe uv à longueur d'onde courte pour visualiser les bandes d'ADN par l'ombre UV.
   5. Une ombre nette et bien définie doit être observée si la synthèse de l'ADN est de haute qualité. Marquer les bandes sur la pellicule plastique, à l'aide d'un marqueur permanent.
      REMARQUE : Protégez la peau et les yeux de la lumière UV et gardez les expositions courtes pour éviter d'endommager l'échantillon d'acide nucléique.
   6. Placer le gel sur une plaque de verre propre, découper soigneusement les bandes marquées et placer chaque fragment de gel dans 400 L de 300 mM NaCl. Éluter l'ADN pendant la nuit, à l'aide d'un rotateur à température ambiante.
   7. Récupérer l'éludanse dans un tube de centrifugeuse propre et ajouter 2,5 équivalents d'éthanol pour précipiter l'ADN. Vortex bien et placer le tube à -20 oC pendant 30 min.
   8. Pelleter l'échantillon dans une centrifugeuse supérieure de banc à 156 000 x g pendant 30 min à 4 oC. Retirez soigneusement le supernatant et suspendez la pastille dans ddH₂O. Utilisez un spectrophotomètre pour déterminer avec précision la concentration d'oligonucléotide d'ADN. Conservez l'échantillon sous forme de stock de 10 m pour plus de commodité à -20 oC.
2. Transcription de ruissellement et purification de gel des échantillons d'ARN
   1. Préparer 5x stock de triphosphate nucléoside (NTP) en mélangeant des stocks ntP liquides constitués d'une concentration finale de 40 mM de guanosine triphosphate (GTP, 11 400 M^-1cm^-1), 25 mM de cytidine triphosphate (CTP, 7 600 M^-1cm^-1), 25 mM adénosine triphosphate (ATP, 5 000 M^-1cm^-1), et 10 mM d'uridine triphosphate (UTP, 10 000 M^{- 1}cm^-1); tous les coefficients d'extinction à 260 nm.
      REMARQUE : Les stocks liquides ou en poudre peuvent être obtenus commercialement. Si vous préparez les stocks primaires à partir de poudre, ajustez soigneusement le pH à un pH final de 7,9, à l'aide de 1 M NaOH. Aliquot le stock dans des tubes microcentrifuges de 1,5 ml et le stocker à -20 oC.
   2. Préparer 100 ml de 10x T7 transcription tampon stock en mélangeant 25,6 mL de 1 M Tris-HCl, 14,4 ml de 1 M Tris base, 26 ml de 1 M MgCl₂, 10 ml de 10% Triton X-100, et 0,637 g de spermidine. Composent le stock à un volume final de 100 ml en ajoutant ddH₂O.
      REMARQUE : Un pH final de 7,9 de la solution 1x doit être confirmé à l'aide d'un pH mètre calibré. Le 10x doit être filtré stérilement et stocké à -20 oC dans des aliquots de taille convenable.
   3. Effectuer la transcription comme suit.
      1. Ajouter les réactifs suivants pour constituer une concentration finale de tampon de transcription 1x T7 à l'aide du stock tampon de transcription 10x T7 et ddH₂O (à partir de l'étape 4.2.2), 1x NTP, 10 mM de dithiothreitol (TTT), 1 'M T7 séquence du brin supérieur (voir la section 4 Note pour le séquence), 1 séquence d'ADN de mangue purifiée par gel (étape 2.1), et enzyme de polymérase d'ARN T7 (1 U/L).
      2. Vortex, spin down, and incubate the solution at 37 oC for 2 h or until it becomes cloudy and a white precipitate forms at the bottom of the tube. Une transcription de 50 L devrait donner lieu à 50 L d'ARN de 50 m après la purification du gel. Ajouter un volume égal de colorant dénaturant 2x et le stocker à -20 oC jusqu'à ce qu'il soit prêt pour la purification du gel.
   4. Gel-purifier l'ARN résultant tel que décrit dans la section de purification de gel d'oligonucléotides d'ADN en suivant des étapes 4.1.2-u20124.1.8, substituant l'échantillon d'ARN pour l'ADN.
      REMARQUE : L'ARN est extrêmement sensible à la dégradation de la RNase, alors assurez-vous que, à toutes les étapes, des gants et une blouse de laboratoire propre sont portés en tout temps. Assurez-vous que tous les échantillons sont préparés et stockés dans des plastiques à usage unique pour se protéger contre la contamination par la RNase, et lavez soigneusement les plaques de verre avec du savon chaud et de l'eau avant de l'utiliser, rincez-les soigneusement avec le ddH₂O et séchez la verrerie avec le l'aide de l'éthanol appliqué à partir d'une bouteille de compression.
   5. Utilisez 1 L de l'échantillon d'ARN final et, à l'aide d'un spectrophotomètre à base de gouttelettes, déterminez l'absorption à 260 nm. À l'aide d'un coefficient d'extinction déterminé par la méthode voisine la plus proche, calculez la concentration d'ARN et ajustez la concentration de l'échantillon à 10 M avec ddH₂O pour plus de commodité. Conserver les échantillons d'ARN à -20 oC.
3. Escherichia coli extraction totale d'acide nucléique brut
   REMARQUE : Le protocole suivant est un exemple. Ce protocole utilise endogènement exprimé Mango I-marqué 6S ARN à partir d'un plasmide dans E. coli, et l'induction de ce plasmide est décrit ailleurs dans le détail⁴.
   1. Aux fins de cette étude, préparer 500 ml de cellules induites pour la mangue pEcoli-ARN et les plasmides pEcoli-T1 (les cellules sont induites à un OD_600nm de 1). Pelleter les cellules et les stocker à -80 oC avant de les utiliser.
   2. Effectuez l'extraction d'ARN comme suit.
      1. Prenez 0,5 ml de granule de cellules pEcoli induite et ajoutez 500 l de phénol équilibré. Ensuite, vortex l'échantillon; la solution deviendra blanc laiteux. Centrifugeàeur à vitesse maximale pendant 2 min pour séparer les couches.
      2. Extraire la couche supérieure, qui sera légèrement jaune, et répéter l'étape 4.3.2.1 en ajoutant un volume égal de phénol, centrifuge, et l'extraction pour un total de 5x (ou jusqu'à ce que la couche moyenne, qui est blanc opaque, disparaît et seulement deux couches claires sont à gauche).
      3. Ajouter le volume aqueux extrait du phénol à un volume égal de chloroforme, de vortex, puis de centrifugeuse à vitesse maximale pendant 2 min.
      4. Extraire la couche aqueuse et ajouter NaCl à une concentration finale de 300 mM. Précipitez l'acide nucléique résultant par l'ajout de 2,5 équivalents d'éthanol, de vortex, de spin down et précipitez-vous à -20 oC pendant au moins 30 min.
      5. Pelleter dans une centrifugeuse de banc à 15,6 x 1 000 x g à 4 oC pendant 30 min. Retirez soigneusement le supernatant et suspendez la pastille en 100 oL de ddH₂O.
      6. Ajouter une étape de digestion DNase I à cette procédure, suivant le protocole référencé¹¹, pour obtenir l'ARN total.
         REMARQUE: Vortex vigoureusement jusqu'à ce que la pastille est complètement dissous en ddH₂O.

5. Coloration post-gel

1. Préparer la solution de coloration de gel 1x selon la recette dans l'étape 1.1.3 et l'ajouter à un récipient en verre propre qui est assez large pour s'adapter confortablement le gel.
   REMARQUE : Les récipients en verre de Borosilicate avec les couvercles d'ajustement de claquement servent bien à cet usage.
2. Ajouter assez de 1x gel solution de coloration au récipient de sorte que le gel est complètement recouvert de la solution et le liquide sloshes sur le dessus du gel quand il est placé sur le rotateur orbital.
   REMARQUE : Le récipient doit être assez grand pour s'adapter au gel de sorte qu'il puisse se déplacer et avoir assez de tampon dans le récipient pour couvrir entièrement le gel.
3. Une fois que le gel natif ou dénaturant a fini de fonctionner (section 2 ou 3, respectivement), retirez le gel de l'appareil et coupez ses puits. Il peut être utile d'enlever un coin du gel pour l'orientation plus tard dans l'analyse.
4. Transférer délicatement le gel à la solution de coloration de gel 1x préparée à l'étape 5.2.
   REMARQUE: Les gels sont fragiles et sujettes à la rupture alors soyez prudent lors du transfert du gel. Gardez le couvercle sur le récipient de coloration en tout temps afin de ne pas contaminer le gel.
5. Placer le gel sur un rotateur orbital à une vitesse de 100 tr/min pendant 30 min à température ambiante.
   REMARQUE : Assurez-vous que le gel ne se replie pas sur lui-même; sinon, l'ARN peut se diffuser hors du gel et ainsi étiqueter une partie différente du gel.

6. Imagerie Des ARN étiquetés mangue dans le gel

1. Décant soigneusement le tampon d'imagerie. Rincer le gel rapidement avec de l'eau, en veillant à ce qu'il reste suffisamment de liquide pour garder le gel légèrement mobile dans le récipient.
2. Transférer délicatement le gel sur l'imageur. Transférer en ramassant soigneusement les côtés du gel et en le plaçant sur le plateau de l'imageur; alternativement, le gel peut être versé lentement sur le plateau. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles sous le gel et qu'il n'y a pas d'excès de liquide sous le gel. Une pipette roulée sur le gel peut être utile pour enlever tout excès de liquide.
   REMARQUE : Utilisez un essuie-tout pour absorber l'excès de liquide.
3. Prenez une image de gel, en observant la fluorescence entre la longueur d'onde d'excitation 510 nm et la longueur d'onde d'émission 535 nm (par exemple, feu vert à 520 nm réglages de fluorescence de longueur d'onde sur l'imageur). Assurez-vous que les réglages sont entièrement optimisés sur l'instrument et suivez attentivement les instructions pour l'instrument utilisé.

Résultats

Des ARN à courte mangue ont été préparés comme décrit dans la section du protocole. En supposant que la fluorescence dans les conditions dénaturantes serait plus difficile à observer en raison de la présence d'urée dans les gels, nous avons d'abord étudié la résistance des accoucheuses de mangue à l'urée, qui agit comme un dénaturant d'acide nucléique. Nous avons constaté que les acquiamères à la mangue sont considérablement résistants à la dénaturation jusqu'à une concentration d'urée d'...

Discussion

Un avantage significatif de l'étiquette fluorescente Mango est qu'une seule étiquette peut être utilisée de plusieurs façons. La luminosité élevée et l'affinité de ces aptamers les rendent utiles non seulement pour la visualisation cellulaire 2, mais aussi pour l'ARN in vitro ou la purification RNP⁴. Par conséquent, l'imagerie gel étend la polyvalence de l'étiquette Mango d'une manière simple. La sensibilité d'imagerie de gel de mangue est légèrement inférieure à celle d'un...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Peigne de 0,8 mm d’épaisseur 14 puits pour gels PAGE de 30 mL	LabRepCo	11956042
101-1000 µ ; L  ; pourboires	Fisher	02-707-511
20-200 & micro ; L faible rétention  ; conseils	Fisher Scientific	02-717-143
Acrylamide :N,N'-méthylènebisacrylamide (40 % 19:1)	Bioréactifs	BP1406-1	Toxicité aiguë
Acrylamide :N,N'-méthylènebisacrylamide (40 % 29:1)	Fisher	BP1408-1	Toxicité aiguë
Agar	Anachemia	02116-380
Plaque TLC à dos en aluminium	Sigma-Aldrich
Amersham Imager 600	GE Healthcare Lifesciences	29083461
Persulfate d’ammonium	Biorad	161-0700
Cellules BL21	NEB	C2527H
Acide borique	ACP	B-2940
Bromophénol Bleu sel de sodium	Sigma	B8026-25G
Chloloforme	ACP	C3300
Dithiothreitol	Sigma Aldrich Alcools	D0632-5G
DNase I	ThermoFisher	EN0525
EDTA Sel disodique	ACP	E-4320
Éthanol	commercial  ;
Gel plat Conseils de chargement	Costar	CS004854
Formamide 99 %	Alfa Aesar	A11076
Ensemble d’appareils en gel avec entretoises et peignes	LabRepCo	41077017
Plat en verre avec couvercle en plastique	Pyrex	1122963	Devrait être assez grand pour s’adapter à votre morceau de gel
Glycérol	Anachemia	43567-540
HCl	Anachemia	464140468
ImageQuanTL	GE Healthcare Lifesciences	29000605
IPTG	Invitrogen	15529-019
KCl	ACP	P-2940
MgCl2	Caledron	4903-01
MgSO4	Sigma-Aldrich	M3409
NaCl	ACP	S-2830
NaOH	BDH	BDH9292
Rotateur orbital	Ligne
Phénol	Invitrogen	15513-039
Gel rond Conseils de chargement	Costar	CS004853
Phosphate de sodium dibasique	Caledron	8120-1
Phosphate de sodium monobasique	Caledron	8180-01
SYBRGold	ThermoFisher	S11494
T7 ARN polymérase	ABM	E041
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024-50 ml
TO1-3PEG-Biotine Fluorophore	ABM	G955
Tris Base	Fisher	BP152-500
Tryptone	Fisher	BP1421-500
Tween-20	Sigma	P9496-100
Urea	Fisher	U15-3
Xylene Cyanol	Sigma	X4126-10G
Extrait de levure	Bioshop	YEX401.500