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Mesure des métalloprotéinases de la matrice cellulaire Global et l’activité métabolique des Hydrogels 3D

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DOI :

10.3791/59123

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22 janvier 2019

 , 
1Department of Biomedical Engineering, The Ohio State University, 2The Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Arthur G. James Cancer Hospital and Richard J. Solove Research Institute, 3Biomedical Technology Department, King Saud University

Dans cet article

Résumé

Ici, un protocole est présenté pour encapsuler et cultivant les cellules en poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels fonctionnalisés avec un fluorogène matrice métalloprotéinases (MMP)-peptide dégradable. MMP cellulaire et l’activité métabolique sont mesurées directement à partir de l’hydrogel de cultures à l’aide d’un lecteur de microplaques standard.

Résumé

Systèmes de cultures cellulaires (3D) en trois dimensions souvent mieux récapitulent in vivo des réponses cellulaires et les fonctions que les systèmes de la culture traditionnelle à deux dimensions (2D). Toutefois, la mesure de la fonction des cellules en culture 3D est souvent plus difficile. Plusieurs dosages biologiques nécessitent de récupération du matériel cellulaire qui peut être difficile dans les cultures 3D. Pour relever ce défi consiste à développer de nouveaux matériaux qui permettent de mesurer de la fonction des cellules dans le matériau. Ici, on présente une méthode pour la mesure de l’activité cellulaire matrix métalloprotéinases (MMP) hydrogels 3D dans un format de 96 puits. Dans ce système, un hydrogel poly(ethylene glycol) (PEG) est fonctionnalisé avec un capteur de clivables fluorogène MMP. L’activité cellulaire MMP est proportionnelle à l’intensité de la fluorescence et peut être mesurée avec un lecteur de microplaques standard. Miniaturisation de ce test dans un format 96 puits réduit le temps requis pour expérimental mis en place par l’utilisation de 50 % et réactif de 80 % par l’état par rapport à la précédente version de 24 puits du dosage. Ce dosage est également compatible avec les autres mesures de la fonction cellulaire. Par exemple, une analyse de l’activité métabolique est démontrée ici, qui peuvent être menées simultanément avec les mesures de l’activité au sein de l’hydrogel même MMP. Le dosage est illustrée avec des cellules de mélanome humain encapsulés dans un éventail de cellules pour déterminer la densité d’encapsulation approprié pour la plage de travail de l’analyse des densités de semis. Après 24 h d’encapsulation de cellules, MMP et affichages de l’activité métabolique ont été proportionnelles à la densité de semis de cellule. Tandis que le dosage est démontré ici avec un un substrat fluorogène dégradable, le dosage et la méthodologie pourraient être adaptés à une grande variété de systèmes d’hydrogel et autres sondes fluorescentes. Une telle analyse fournit une plate-forme de culture 3D pratique, efficace et facilement accessible pour une grande variété d’applications.

Introduction

Systèmes en trois dimensions (3D) souvent plus étroitement les récapituler en vivo les réponses cellulaires que les systèmes de la culture traditionnelle à deux dimensions (2D), voir plusieurs excellentes publications1,2,3 . Cependant, utilisant des systèmes de culture 3D permettant de mesurer la fonction des cellules a été difficile en raison de la difficulté d’extraction cellulaire et encore goûter de traitement. Cette difficulté limite la mesure de nombreuses fonctions cellulaires dans des systèmes de culture 3D. Pour surmonter cette difficulté, nouvelles techniques sont nécessaires qui permettent de mesurer facilement de la fonction des cellules au sein d’environnements 3D. Une façon de répondre à ce besoin est l’élaboration de matériel qui non seulement soutenir la culture cellulaire 3D mais incorporent également des capteurs pour mesurer la fonction des cellules. Par exemple, plusieurs systèmes d’hydrogel ont intégré des fractions clivables de protéase fluorogène pour permettre la visualisation de l’activité protéase dans les environnements 3D4,5,6,7. Tandis que ces systèmes ont été initialement utilisés pour l’imagerie microscopique, ces systèmes peuvent être adaptées pour une utilisation dans une analyse d’activité de métalloprotéinases (MMP) matrice globale à l’aide d’un lecteur de plaque standard, ce qui permet de mesure facile d’une fonction de la cellule en 3D environnement,8.

MMP, une super-famille de protéases de zinc, joue un rôle crucial dans l’homéostasie des tissus normaux et dans de nombreuses maladies. MPM se dégrade et remodelage de la matrice extracellulaire (mec), Cliver les cytokines et les récepteurs de surface cellulaire et activer les autres MMP9,10. MMP joue un rôle crucial dans les processus physiologiques tels que la cicatrisation des plaies et maladies comme l’arthrite, l’athérosclérose, Alzheimer et le cancer (voir commentaires du 9,10,,11). Dans le cancer, des niveaux élevés d’expression MMP sont fortement corrélés avec les métastases du cancer et de mauvais pronostic,12. En outre, MMPs contribuent à la progression tumorale en favorisant l’invasion des cellules du cancer et la migration des processus cellulaires qui sont intrinsèquement 3D phénomènes13,14. Par conséquent, il y a beaucoup d’intérêt dans la capacité de mesurer l’activité des MMP dans la culture 3D dans de nombreux contextes, y compris des études biologiques fondamentales et les tests de dépistage de drogue.

Les hydrogels PEG sont largement utilisés pour la culture cellulaire 3D en raison de leur forte teneur en eau, résistance à l’adsorption de protéines et la nature accordable. Hydrogels PEG ont été fonctionnalisés avec un certain nombre de portions à la fonction des cellules direct, comme avec des peptides mimétiques ECM comme RGD, RLD et IKVAV pour faciliter l’adhérence de cellules, ou direct attacher des facteurs de croissance tels que transformant β facteur de croissance (TGF-β) 15,,16. Plus récemment, les hydrogels PEG ont été fonctionnalisés avec des peptides de capteurs qui permettent de mesurer de la fonction des cellules bien5,,8. En particulier, l’utilisation d’un système d’hydrogel PEG fonctionnalisés avec un fluorogène MMP-dégradables mesure de peptide a permis de l’activité cellulaire de MMP dans les cultures 3D avec un lecteur de plaque standard et ne requis aucune poursuite de la procédure. Ces systèmes sont également compatibles avec les autres mesures de la fonction cellulaire, y compris l’activité métabolique. Ici, un protocole est décrit pour le mesurage de l’activité des MMP des cellules cultivées dans un hydrogel PEG 3D fonctionnalisés avec un peptide MMP-dégradables fluorogéniques et présentés des résultats montrant les expériences d’optimisation initiale nécessaires à l’utilisation de ce dosage. Cellules de mélanome humain (a375 Office) ont été encapsulés dans les hydrogels fluorogène sur une plage d’ensemencement des densités pour déterminer les densités de semis appropriées qui sont dans la portée de l’essai. Après 24 h d’encapsulation, MMP et l’activité métabolique ont été mesurés en utilisant un lecteur de microplaques standard. Ensuite, l’activité MMP a été normalisée à activité métabolique pour déterminer les densités de semis dans la gamme linéaire du dosage. Enfin, coefficient intraplaques des pourcentages de variation (CV %) ont été calculées entre réanalysés pour refléter la reproductibilité des résultats obtenus. Cette méthode permet à la culture cellulaire 3D simple et rapide et simple mesure de l’activité de la protéase avec traitement de l’échantillon minimal.

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Protocole

1. préparation des composants Hydrogel

  1. Synthétiser les peptides fluorescents protéase-dégradables comme décrit ailleurs8, utilisant la fluorescéine comme la molécule fluorescente et dabcyl comme l’extincteur. Dissoudre le peptide dans le DMSO à une concentration de 10 mM et le magasin dans un congélateur à-80 ° C dans de petites aliquotes (~ 30 µL) d’éviter les cycles répétés de gel-dégel.
    Remarque : Ces peptides peuvent également être achetés dans le commerce. Ce protocole requiert une cystéine C-terminale de la séquence peptidique pour permettre l’incorporation covalente dans le réseau de polymère hydrogel.
  2. Préparer 8 amine (PEG) de (éthylène glycol) de la poly des kDa de l’arm 40-norbornène (NB) comme décrit17. Vérifiez la fonctionnalisation de groupe de fin de plus de 90 % à l’aide d' 1H RMN. Dissoudre PEG-NB en solution saline tampon stérile de phosphate (PBS) à 25 % p/v et l’entreposer dans le congélateur-80 ° C (~ 300 µL) d’extraits.
    NOTE : PEG fonctionnalisés avec norbornène peut également être acheté dans le commerce.
  3. Synthétiser le trimethylbenzoylphosphinate de phényle 2,4,6 lithium photo-initiateur (LAP) comme décrit ailleurs18. Dissoudre les genoux dans l’eau stérile à une concentration de 68 mM et stocker dans un congélateur à-80 ° C dans les parties aliquotes (~ 300 µL).
    Remarque : comme alternative, Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) utilisable comme l’initiateur de photo. LAP et Irgacure peuvent être achetés dans le commerce.
  4. Dissoudre la reticulation MMP-dégradables de peptide (KCGPQG↓IWGQCK) et le peptide d’adhérence cellulaire (CRGDS) dans de l’eau stérile à une concentration de 200 mM et 100 mM respectivement et les stocker dans un congélateur à-80 ° C (~ 300 µL et ~ 30 µL) parties aliquotes, respectivement.

2. Mode operatoire médias préparation

  1. Préparer l’inactivés par la chaleur, charbon de bois dépouillé sérum fœtal (SVF) pour le dosage MMP :
    NOTE : Protéases dans FBS peuvent produire un signal de fond élevé avec le test MMP ; par conséquent, il est recommandé d’inactiver à la chaleur et du charbon de bois bande la FBS pour les médias de dosage.
    1. Inactiver les 100 mL de FBS en chauffant pendant 30 min à 55 ° C.
      Remarque : 100 mL de FBS a été utilisé ici pour aliquotage et stockage à-20 ° C pour une utilisation future. Petits volumes peuvent être utilisés selon les besoins.
    2. Ajouter 0,25 % p/v de charbon actif et 0,025 % p/v de dextran à une petite quantité de FBS (environ 5 mL) et mélangez jusqu'à forme une pâte. Ensuite, ajouter le reste de la FBS et remuez pendant 30 min à 55 ° C.
    3. Centrifuger à 1 962 x g pendant 20 min à 4 ° C. Puis transférer le surnageant sur un autre navire.
    4. Répétez l’étape 2.1.2 mais à 37 ° C, suivie de l’étape 2.1.3. Stériliser le surnageant à l’aide d’un filtre de 0,45 µm et ensuite un filtre de 0,2 µm.
  2. Préparer les milieux d’essai à l’aide de milieux supplémentés avec 1 % charbon dépouillé FBS, 2 mM de L-glutamine, 10 U/mL de pénicilline, 10 µg/mL de streptomycine.
    NOTE : Les médias sans rouge de phénol sont recommandé parce qu’il a moins d’interférences fluorescence. Autres ajouts à la presse d’essai telles que l’insuline, facteurs de croissance, etc.,. peut être ajouté en tant que l’absorbance et pics du spectre de fluorescence ne se chevauchent pas avec le capteur (494 nm/521 nm).
  3. Enzyme collagénase bactérienne diluée de type I à 10 et 1 000 µg/mL dans les médias de dosage comme témoin positif.

3. Hydrogel préparation et cell encapsulation

  1. Préparer la solution de précurseur d’hydrogel.
    1. Ajouter les réactifs dans un tube de 1,5 mL dans l’ordre suivant, vortex après addition de chaque composant : 20 mM 8 bras 40 kDa PEG-NB, 12,75 mM reticulation MMP-dégradables peptide, 17,8 mM NaOH, 1 mM CRGDS, 2 mM au tour et le peptide de fluorogène MMP-dégradables de 0,25 mM.
      Remarque : Le tableau 1 montre contenu de solution pour le précurseur hydrogel, les concentrations de stock, les concentrations de travail, formules de calcul de volume et les volumes requis nécessaires pour faire 120 µL de solution de précurseur d’hydrogel, suffisante mener une expérimenter avec 10 hydrogels. Pour tenir compte de la perte de la solution d’hydrogel à cause de pipetage, augmenter le volume total de 20 %. Les peptides commerciaux sont souvent fournis dans une solution d’acide chlorhydrique ; NaOH est donc ajouté pour atteindre un pH final de 7. pH de la solution finale doit être confirmée par l’utilisateur.
    2. Diviser la solution de précurseur d’hydrogel en tubes multiples de 1,5 mL, un tube par la condition testée.
      Remarque : Plusieurs conditions de contrôle dans lequel les hydrogels sont préparés sans l’ajout de cellules sont suggérées. Pour un contrôle négatif, pour tenir compte de la dégradation non spécifique du capteur fluorogène, une condition d’hydrogel peut être incubée avec le contrôle du véhicule ou les médias expérimentaux seuls s’il n’y a aucune condition de traitement. Pour un contrôle positif et pour l’étalonnage entre les expériences, hydrogels peuvent être incubées avec une protéase connue en conjonction avec le capteur fluorogène. Par exemple, deux concentrations de collagénase bactérienne ont été utilisées ici.
  2. Encapsuler des cellules d’hydrogels.
    1. Préparer une suspension monocellulaire comme approprié pour le type de cellule utilisé. Par exemple, laver un plat de 10 cm de cellules de mélanome a375 Office avec 10 mL de PBS. Trypsinize des cellules à l’aide de la trypsine 0.05 % et incuber à 37 ° C et 5 % CO2 pendant 3 min. numération des cellules avec un hémocytomètre pour déterminer le nombre total de cellules.
    2. Centrifuger la solution cellulaire à 314 x g pendant 3 min, aspirer les milieux de culture, puis remettre en suspension les cellules dans du PBS à environ trois fois la densité plus élevée requise semie pour l’expérience. Par exemple, une suspension de cellules avec une densité de 21 x 106 cellules a été utilisée ici pour atteindre une densité finale encapsulée de 7 x 106 cellules/mL.
    3. Compter les cellules à nouveau afin d’assurer une concentration cellulaire précis.
    4. Ajouter des cellules suspendues et PBS dans chaque tube de solution de précurseur d’hydrogel selon la densité de semis requise (0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 et 7 x 106 cellules/mL dans cet exemple). Ajouter PBS à conditions avec aucune cellule au lieu de cellules de la suspension.
      NOTE : Toutes les conditions doivent avoir le même volume de solution finale hydrogel précurseur pour assurer le rapport entre les composantes de l’hydrogel et PBS est constante. Ne pas les tubes vortex qui possède des cellules en eux, pipette de haut en bas vigoureusement sans créer de bulles afin de mélanger la solution de précurseur.
    5. Diluer 10 µL de la solution de précurseur d’hydrogel dans un stérile noir rond bas plaque 96 puits, veiller à ce que la pointe est centrée au milieu de chaque puits pendant la distribution.
    6. Polymériser solution de précurseur d’hydrogel en exposant la plaque à la lumière ultraviolette (UV) à 4 mW/cm2 pendant 3 min.
      Remarque : La lampe UV (UVL-56 poche UV lampe, UVP, Upland, Californie) produit de lumière UV-A longue longueur d’onde UV (365 nm), qui n’affecte pas la viabilité cellulaire.
    7. Ajouter 150 µL de médias de dosage dans toutes les loges, à l’exception des conditions de contrôle positif sans cellules encapsulées. Les contrôles positifs, ajouter 150 µL de solution d’enzyme collagénase.
    8. Ajouter 150 µL de PBS aux puits externes de la plaque pour réduire l’évaporation durant l’incubation.

4. MMP et mesure de l’activité métabolique

  1. Mesurer la fluorescence immédiatement après encapsulation pour établir une mesure de fluorescence de base et d’assurer l’uniformité dans la polymérisation de l’hydrogel. Lire la plaque à l’aide d’une microplaque de fluorescence lecteur utilisant un protocole de plaque à 96 puits opaque avec une superficie scan réglage à 494 nm/521 nm (excitation/émission). Ce sera la 0 h lire.
  2. Incuber les plaques dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 18 h.
  3. Ajouter une activité métabolique réactif (résazurine) à 01:10 (v/v) pour chaque puits.
  4. Incuber les plaques dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 6 h supplémentaires.
    Remarque : Ce temps d’incubation peut varier selon le type de cellule.
  5. Mesurer la fluorescence à l’encapsulation après 24h. Lire la plaque à l’aide d’une microplaque de fluorescence lecteur utilisant un protocole de plaque à 96 puits opaque avec une superficie scan réglage à 494 nm/521 nm (excitation/émission) pour l’activité des MMP et 560 nm/590 nm (excitation/émission) pour l’activité métabolique.

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Résultats

Le dosage en cours a été adapté d’un système de culture hydrogel 3D précédemment développé et caractérisé fonctionnalisé avec un fluorogène MMP clivables capteur8. Le capteur MMP fluorogène utilisé ici se compose d’une séquence peptidique, GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (Almeras) C (↓ indique le site de clivage) qui a été précédemment optimisé pour le clivage par MMP-14 et MMP-1119. Le peptide est étiqueté avec une molécule fluorescente (fluorescé...

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Discussion

La culture in vitro de cellules 3D reprend plusieurs aspects importants de l’environnement in vivo. Cependant, la culture 3D permet également d’évaluer la fonction des cellules et signalisation difficile, autant d’épreuves biologiques nécessitent extraction cellulaire et un grand nombre de cellules. Par conséquent, la mise au point d’un système de culture 3D simple qui permet la mesure de la fonction cellulaire sans autre échantillon traitement augmenterait considérablement l’utilité des systèmes de culture 3D. Le systèm...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs aimeraient souligner Ohio Cancer Research (OCR), OH, é.-u., pour le financement de ces travaux ainsi que King Saud University (KSU), Riyad, Arabie saoudite d’avoir parrainé le premier auteur. Poids moléculaire de la sonde fluorescente peptide a été mesurée à l’aide de la matrice assistée, désorption-ionisation laser, spectrométrie de masse (MALDI-TOF) temps de vol avec l’aide de la Campus chimique Instrument centre de spectrométrie de masse et protéomique Installation à l’Ohio State University.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1X Saline tamponnée au phosphateFisher Scientific10-010-049
Charbon actif  ;Sigma-AldrichC3345
Noir fond rond 96 puitsplaque Brand-Tech89093-600
Peptide d’adhésion cellulaire (CRGDS)GenScript USA Inc.
type I  ;Life Technologies17100-017
DextranSigma-AldrichD4876
DMEM Média à haute teneur en glucoseInvitrogen11965118
sérum de veau fœtal (FBS)  ;Seradigm1500-500
Lecteur de microplaques à fluorescenceHémocytomètre BioTekCytation 3
Hausser Scientific Co.3200
L-glutamineLife Technologies25030-081
Réticulant peptidique dégradable MMP (KCGPQG&darr ; IWGQCK)GenScript USA Inc.
sur mesure NaOHFisher ScientificS318500
Pénicilline /streptomycineLife Technologies15140-122
Resazurin (Alamar Blue)Life TechnologiesDAL1100
la lumière UV  ;Référence : UVP95-0006-02
enzyme collagénase de sur mesure

Références

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Mots-clés

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