Article de méthode

Analyse par cytométrie en flux de vésicules extracellulaires de médias conditionné par cellule d’écoulement

DOI :

10.3791/59128

⸱

12 février 2019

 ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Cardiology Laboratory, Cardiocentro Ticino Foundation, Switzerland, 2Molecular Cardiology Institute, Dept. of Cardiology, University of Zürich, 3Faculty of Biomedical Science, Università Svizzera Italiana, Switzerland

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole décrit une méthode reproductible, conçue pour être utilisé avec les surnageants de culture de cellules pour détecter des épitopes de surface sur petites vésicules extracellulaires (EV). Il utilise l’immunoprécipitation de EV spécifique à l’aide de billes couplées avec des anticorps qui reconnaissent l’antigène de surface CD9, CD63 et CD81. La méthode est optimisée pour l’analyse en cytométrie en flux en aval.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytométrie en flux (FC) est la méthode de choix pour la mesure semi-quantitative des marqueurs de l’antigène de surface de la cellule. Récemment, cette technique a été utilisée pour des analyses phénotypiques des vésicules extracellulaires (EV) y compris les exosomes (Exo) dans le sang périphérique et d’autres liquides organiques. La petite taille des EV exige l’utilisation d’instruments consacrés ayant un seuil de détection autour de 50-100 nm. Par ailleurs, EV peut être lié à des microbilles de latex qui peuvent être détectées par le FC. Microbilles, conjugué avec des anticorps qui reconnaissent les EV associées aux marqueurs/Cluster de différenciation CD63 et CD9 CD81 peut être utilisé pour la capture de l’EV. Exo isolée du CM peut être analysée avec ou sans pré enrichissement par ultracentrifugation. Cette approche consiste aux analyses de EV en utilisant les instruments conventionnels de FC. Nos résultats démontrent une corrélation linéaire entre les valeurs d’intensité de Fluorescence signifie (IFM) et de la concentration de l’EV. Perturbant EV par sonication considérablement diminué MFI, indiquant que la méthode ne détecte pas de débris de la membrane. Nous rapportons une méthode précise et fiable pour l’analyse des antigènes de surface EV, qui peut être facilement implémenté dans n’importe quel laboratoire.

Introduction

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Les cellules sécrètent des vésicules extracellulaires (EV) de différentes tailles, y compris des microvésicules (MV) et les exosomes (Exo). Ce dernier se distingue de MV par taille et par le compartiment subcellulaire d’origine. MV (200 – 1 000 nm de taille) sont libérés de cellules mères en projetant de la membrane plasmique. À l’inverse, Exo (30 à 150 nm) proviennent de membranes endosomale et sont libérés dans l’espace extracellulaire lorsque les corps multivésiculaires (MVB) fusionnent avec la membrane cellulaire1,2.

EV sont de plus en plus utilisés comme biomarqueurs diagnostiques ainsi que, éventuellement, des outils thérapeutiques dans de nombreux domaines, y compris l’oncologie, neurologie, cardiologie et maladies musculo-squelettiques3,4,5. Une grande majorité des études en cours à l’aide de EV comme agents thérapeutiques exploitent l’isolement des vésicules de cellule conditionnée moyen (CM) des cellules cultivées in vitro. Cellules souches mésenchymateuses (CSM) exercent des effets bénéfiques dans plusieurs contextes, et dérivé de MSC EV ont montré des avantages dans les modèles d’ischémie/reperfusion myocardique blessures6 et cerveau blessure7. Dérivé de MSC EV présentent également des activités modulateurs immunitaires qui peuvent être exploitées pour traiter le rejet immunitaire, comme l’a démontré dans un modèle de réfractaires à la thérapie graft - versus - host disease8. Les cellules souches fluides amniotiques (hAFS) enrichir activement CM avec MVs et Exo, hétérogène dans la taille (50 – 1 000 nm), qui véhiculent plusieurs effets biologiques, tels que la prolifération de cellules différenciées, angiogenèse, inhibition de la fibrose, et cardioprotection4. Nous avons récemment démontré que EV et particulièrement Exo, sécrétée par les cellules progénitrices de dérivés cardiaque humaine (Exo-CPC) réduisent la taille de l’infarctus du myocarde rats5,9.

Exo partager un ensemble commun de protéines sur leur surface, y compris tetraspanins (CD63, CD81, CD9) et le complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (MHC-I). En plus de cet ensemble commun de protéines, Exo contiennent également des protéines spécifiques pour le sous-ensemble de EV du type producteur. Exo marqueurs gagnent une importance primordiale car ils jouent un rôle crucial dans la communication inter cellulaire, donc réglementer de nombreux processus biologiques5,10. En raison de leur petite taille, trouver un moyen facile d’analyser les EV à l’aide de classique écoulement cytometry (FC) reste une tâche difficile.

Nous présentons ici un protocole simplifié d’analyse EV à l’aide de FC, qui peut être appliqué aux préenrichi échantillons obtenus par ultracentrifugation ou directement au CM (Figure 1). La méthode utilise des perles recouverts d’un anticorps spécifique qui lie canoniques épitopes surfaces Exo-associés (CD63, CD9, CD81) sans nouveaux lavages. FC analyses peuvent être effectuées à l’aide d’un cytomètre classique sans avoir besoin d’ajustements avant mesures. Méthodes de caractérisation des antigènes sur chaque petites particules à l’aide des cytomètres ont été décrites par d’autres groupes en ce qui concerne les diverses applications11,12,13. Ici, nous avons utilisé des billes magnétiques pour la capture de petites particules et Exo, suivie de phénotypage des particules capturées par le FC. Bien que cette méthode peut être utilisée pour caractériser la composition antigénique de petites vésicules publié par n’importe quel type de cellules in vitro, nous avons fourni ici les conditions de culture de cellules spécifiques qui s’appliquent pour la culture des progéniteurs cardiaques humaines (CPC) et le plus environnement approprié pour la production de EV par ces cellules.

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Protocole

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1. collecte et traitement des milieux conditionnés

  1. Manteau 55 cm2 boîtes de pétri avec de la gélatine porcine peau 0,02 % dans du PBS.
  2. CPC (8 000/cm2) dans les plats revêtus sur plaque avec 7 mL de Dulbecco modifiée de Iscove Medium (IMDM) additionné de 20 % SVF (sérum de veau fœtal) et 1 % la pénicilline/streptomycine (P/S).
    Remarque : Le terme « CPC » fait référence aux cellules humaines explant dérivé qui ont été décrites ailleurs14. CM peut être prélevé sur différents types de cellules cultivées dans des conditions de culture spécifique. Porter des gants et travailler sous une hotte biologique.
  3. Une fois que les cellules atteignent sur confluence de 80 %, enlevez le milieu de culture, laver deux fois avec de Dulbecco PBS (PBS) Ca et Mg-exempt de cellules et remplacez-le avec 10 mL de milieu sans sérum, Exo-production (de l’aigle de la modification de Dulbecco moyen [DMEM] taux de glycémie élevé, 4,5 g/mL).
    Remarque : Procéder à une diminution progressive de la concentration sérique en milieu de culture, d’adapter progressivement les cellules à condition sans sérum (SF). Pour les cellules qui sont sensibles au milieu sans sérum préparer un milieu contenant FBS mais appauvris en EV. Préparer le milieu supplémenté avec tous les éléments nutritifs, ainsi que 10 à 20 % (v/v) de SVF. Centrifuger le milieu du jour au lendemain à 100 000 × g, 4 ° C. Sachez que cette procédure ne garantit pas 100 % élimination des dérivés de FBS EV.
  4. Après 7 jours, recueillir le CM dans un tubes à centrifuger en polypropylène.
    Remarque : Le temps pour climatisation moyenne dépend du type de cellule. Pour les cellules qui sont sensibles au milieu sans sérum, augmenter le volume initial du milieu et de réduire le temps pour la collecte de CM à 24-48 h.
  5. Effacer les CM de débris cellulaires par centrifugation à 3 000 x g pendant 20 min à 4 – 10 ° C. Récupérer le surnageant dans un tube de filtre à centrifuger 100 kDa.
  6. Concentré d’effacé CM en faisant tourner le tube à 2 000 x g pendant 20 min à 4 – 10 ° C.
    Remarque : Cette étape permettra de réduire le volume initial de CM permettant l’utilisation de petits tubes pour des mesures haute vitesse centrifuge et contribuera à éliminer les agrégats de la petite protéine.
  7. Recueillir le concentré dans un tube de microcentrifuge. Centrifuger à 10 000 x g pendant 15 min à 4 – 10 ° C.
  8. Recueillir le liquide surnageant et passez à la section 2 (enrichissement EV). Si une ultracentrifugeuse n’est pas disponible, passez directement à la section 3 (quantification de l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA)).
    Remarque : Pré-enrichissement de fraction EV améliore la lecture finale en intensité de fluorescence (voir résultats représentatifs et Figure 4). Défrichée CM (du point 1.8) peut être stocké à 4 ° C pour ne plus puis 1-2 jours ou, subsidiairement à −80 ° C pendant plusieurs mois. 5 CM doit être préapprouvé d’enlever tous les débris cellulaires avant leur stockage à-80 ° C afin d’assurer que les débris de taille exosome est formé pas dans le processus de gel-dégel.

2. extracellulaire vésicules enrichissement par ultracentrifugation (facultative)

  1. Placez le surnageant à l’étape 1.8 dans un tube en polycarbonate ultracentrifugeuse à paroi épaisse. Remplir le tube avec 1 x solution saline le tampon au phosphate (PBS), jusqu'à atteindre la capacité maximale (3,2 mL).
  2. Charger les échantillons dans un rotor à angle fixe titane (8 x 3,2 mL, facteur k-13). Charger le rotor dans une ultracentrifugeuse sur table. Ultracentrifugation à 100 000 x g pendant 3 h à 4 – 10 ° C.
  3. Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 100 µL de solution 1 PBS x.

3. nanoparticules Tracking Analysis (NTA) Quantification

  1. Diluer 1 µL de l’échantillon (à partir de chaque étape 2.3 ou 1,8) en 999 µL de PBS 1 x. Charger l’échantillon dans une seringue de 1 mL, évitant la formation de bulles. Charger la seringue dans l’orifice d’entrée de la salle d’examen.
  2. Allumer l’appareil. Ouvrir la caméra avec la touche de Capture . Ajuster la mise au point.
  3. Enregistrer au moins 3 différentes images de 60 s chaque.
  4. Analyser les 3 acquisitions différentes à l’aide de l’option de Traitement par lots dans le logiciel.
    Remarque : Si la technologie d’annulation n’est pas disponible, effectuer un dosage de la protéine par l’analyse de Bradford (1 x 108 particules correspondent à 1 à 2 µg de protéine totale après ultracentrifugation ou à 50 – 60 µg de protéine totale si la quantification est effectuée directement pour CM comme Il comprend des contaminants de protéines différentes de EV ; voir tableau 1)5.

4. préparation de l’échantillon

  1. Préparer un pool de 3 types de perles de capture (CD9 perles, billes de CD63 et CD81 perles à un 1 : ratio 1:1 ; voir Table des matières) et vortex.
    Remarque : La piscine a été testée pour être stable pendant 1 mois. Un seul type de capturer les perles peut-être être utilisé, ce qui permet la détection des sous-populations EV pas distinguées avec piscine de perles. En utilisant un antigène unique capture perles, il sera possible de contemporain démontrent la présence de protéines de tétraspanines, comme la CD9, CD81 ou CD63, et l’antigène d’intérêt détectés par immunofluorescence. Billes de latex autre aldéhyde-sulfate sont également disponibles dans le commerce. Ces perles présentent une surface hydrophobe pour l’adsorption de MV et EV.
  2. Dans un tube à fond rond, ajouter la quantité de volume correspondant à 1 x 108 particules plus 1 µL de la piscine de perle, correspondant à 1,2 × 105 perles au total (pour chaque épreuve).
  3. Préparer un tube contenant 1 µL de perles sans EV qui servira de témoin négatif, ci-après comme les « Perles ».
  4. Réglez le volume à 100 µL avec 1 x PBS. Placer le tube dans un thermo-table de mixage et l’agiter à 400 tr/min pendant la nuit à 4 – 10 ° C.
  5. Le lendemain, passer les échantillons à une plaque à 96 puits fond rond (ou FC tubes).
  6. Ajoutez l’anticorps (10 µg/mL de CD9_FITC, 10 µg/mL de CD63_PE et de 5 µg/mL de CD81_PE).
  7. Incuber 1 h à 4 – 10 ° C.
  8. Ajouter 100 µL de solution 1 PBS x dans chaque puits.
  9. Procéder à l’acquisition.

5. acquisition

  1. Ouvrez le logiciel d’acquisition et de commencer l’instrument (cytomètre > programme de démarrage de système). Ouvrez une nouvelle expérience.
  2. Créer un modèle expérimental, puis sélectionner et ensuite Ajouter plaque . Sélectionnez la position des échantillons sur la plaque et puis appuyez sur Définir comme échantillon dans la coupelle.
  3. Entrez le nom de l’échantillon (c'est-à-dire CPC #1_CD9FITC) dans les Règles de nommage. Ouvrez l’onglet canaux et allumez la FITC et canaux de PE.
  4. Charger la plaque dans l’instrument.
  5. Appuyez sur Parcelle de Dot et créer une nouvelle parcelle de dot (P1). Mettre avant zone de dispersion (FSC-A) par rapport à Side Scatter-zone (SSC-A).
  6. Sélectionnez initialiser pour commencer le laser et la fluidique. Appuyez sur acquérir pour lancer l’acquisition.
  7. Ajustez l’échelle pour montrer à la population au milieu de la P1. Dans P1, dessiner la porte de « Perles » autour de l’ensemble de la population (à l’exclusion des débris) (Figure 2 a). Appuyez sur arrêter.
  8. Appuyez sur Parcelle de Dot et créer une nouvelle parcelle de dot (P2). Mettre Forward Scatter-hauteur (FSC-H) par rapport à FSC.-a. Porte le nouveau tracé de la dot sur « Perles ». Dans P2 tracer une nouvelle porte autour de la plus grande population et nommez-le « Maillots de corps » (Figure 2 a).
    Remarque : Cette stratégie est conçue afin d’éviter autant que possible l’inclusion des agrégats de perles dans les étapes d’acquisition et d’analyse.
  9. Appuyez sur Dot Plot et créer deux parcelles différentes dot ; un FITC et SSC-A et un PE versus SSC-A. Porte le nouveau tracé de la dot sur « Maillots de corps. »
  10. Sélectionnez le nombre d' événements à enregistrer (par exemple, 20 000). Sélectionnez enregistrement et commencer l’expérience.

6. analyse de données

  1. Charger les fichiers d’acquisition dans le logiciel d’analyse.
    Remarque : Les étapes suivantes doivent être appliquées à chaque échantillon, y compris les perles seulement et chaque échantillon inconnu.
  2. Ouvrir un nouveau protocole et créer des emplacements de points suivant la même stratégie décrite à l’étape 5.
  3. Définissez tous les axes de dispersion à l’échelle linéaire et tous les axes de fluorescence se connecter échelle.
  4. Afficher la moyenne géométrique de Fluorescence (X-Gmean-IFM) à canaux FITC et PE.
  5. Calculer le rapport X-Gsignifie des échantillons / X-Gsignifie des perles colorées avec des anticorps sans exosome.
  6. Comparer le changement de pli IMF de différentes préparations de EV.

7. extracellulaire vésicule numéro titrage

Remarque : Articles 7 à 10 peuvent être effectuées pour configurer le nombre de particules, la concentration d’anticorps et spécificité, mais peut être ignoré si le type de cellule, d'où EV sont dérivés, et les anticorps restent les mêmes.

  1. Diluer les particules, obtenus à l’étape 2.3, dans du PBS 1 x pour obtenir une série de suspensions allant de 5 x 10,5 à 2,5 x 108 particules.
  2. Pour chaque suspension ajouter dans un tube à fond rond 1 µL de piscine de perle de capture.
  3. Suivre le protocole de l’étape 4.3.

8. un titrage d’anticorps

Remarque : Titrage d’anticorps neutralisants est généralement réalisée en ajoutant un seul anticorps pour chaque tube.

  1. Le nombre d’EV (particules totales ou teneur en protéines) maintenir constante dans tous les échantillons.
    Remarque : Le nombre approprié est déterminé empiriquement comme décrit ci-dessus à l’article 7.
  2. Suivre le protocole de mesures 4.1 à 4.5.
  3. Tester une gamme de concentrations d’anticorps ci-dessus et ci-dessous le montant recommandé par le fournisseur. Par exemple, pour un anticorps avec une concentration suggérée de 10 µg/mL par test, test 1, 2, 5, 10, 20 et 50 µg/mL. Inclure un échantillon avec des « perles seulement », ajoutant la plus forte concentration d’anticorps.
  4. Incuber pendant 1 heure à 4 – 10 ° C.
  5. Ajouter 100 µL de solution de 1 PBS x pour chaque échantillon.
  6. Acquérir les échantillons.

9. temps d’incubation

  1. Vérifier le temps d’incubation effectuant des acquisitions à des moments différents (par exemple, 1 h, 2 h et 5 h).
  2. Suivre le protocole à partir de la section 4.
  3. Incuber les échantillons à 4 – 10 ° C pendant 1 h.
  4. Acquérir des échantillons.
  5. Incuber les échantillons à 4 – 10 ° C pendant 3 h.
  6. Acquérir des échantillons.

10. protocole Validation

  1. Liaison de EV
    1. Dans un tube à fond rond, ajouter la quantité de volume correspondant à 1 x 108 particules ou le montant correspondant des protéines totales.
    2. Réglez le volume à 100 µL avec 1 x PBS.
    3. Perturber la membrane EV par sonication (alternativement une étape de choc thermique peut être appliquée) conformément aux instructions du fabricant. Définissez la fréquence et l’intensité. La période de sonication peut être empiriquement établie définissant une expérience temporelle (c.-à-d., 0 s, 30 s, 1 min, 5 min, etc..).
    4. Ajouter 1 µL de la piscine de perle.
    5. Suivre le protocole à partir de l’étape 4.4.
  2. Spécificité de l’anticorps
    1. Préparer un tube pour chaque fluorochrome conjugué IgG et ajouter le complexe de perles-EV comme indiqué au point 4.6.
      Remarque : L’Isotype fluorochrome-conjuguées doit correspondre avec les IgG de l’anticorps utilisé.

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Résultats

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Nombre total de particules pour une coloration unique

Puisqu’un seul cordon pouvez lier plusieurs particules, nous avons testé différentes conditions pour définir la plus petite quantité d’EV total (seul anticorps par tube) pour atteindre la phase exponentielle au début de la courbe de l’IFM. Une concentration fixe d’anticorps a été utilisée alors que le nombre total de particules varie de 5 x 10,5 et...

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Discussion

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Technique classique de FC reste la plus simple méthode analytique pour caractériser des marqueurs exprimés à la surface de l’EV. À cet égard, sélectionner le protocole plus approprié est essentiel pour obtenir des informations utiles sur des fractions de particules individuelles d’intérêt en évitant les limites en raison de la sensibilité de l’instrument. Nous avons décrit une méthode qui utilise des particules magnétiques, couplés avec des anticorps qui reconnaissent les Exo et les antigènes de surface EV petits qui con...

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Déclarations de divulgation

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Rien à déclarer.

Remerciements

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L.B. a bénéficié de subventions de recherche de Helmut Horten Stiftung et Velux Stiftung, Zurich (Suisse). G.V. a été soutenue par des subventions de recherche de Swiss National Science Foundation, la Fondation Cecilia-Augusta, Lugano et la SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (Suisse)

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
IMDMGibco12440061
Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100  ; kDa  ;MilliporeUFC910024
CytoFlex, plate-forme de cytomètre en fluxBeckman CoulterCytoFlex
DMEM, glycémie élevée, HEPES, sans rouge de phénolGibco21063045
sans Dulbecco’s PBS (PBS) sans Ca ni MgLonzaBE17-512F
ExoCap CD63 CaptureJSR Life SciencesEx-C63-SP
ExoCap CD81 Capture KitJSR Life SciencesEx-C81-SP
ExoCap CD9 Kit de captureJSR Life SciencesEx-C9-SP
FBS appauvri en exosomesThermofisherA2720801
Supplément de média FBS appauvri en exosomesSBIEXO-FBS-250A-1
FBS-Fetal BovinSerum Gibco10270106
FITC anti-anticorps CD9 humainBiolegend312104   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; RRID : Logiciel d’analyse de
Beckman CoulterKaluza
NanoSight LM10MalvernNanoSight LM10
Logiciel NanoSightMalvernNTA 2.3
Optima Max-XPBeckman Coulter393315
PE anti-humain CD63 AnticorpsBiolegend353004  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; RRID :AB_10897809
PE anti-human CD81 (TAPA-1)Biolegend349505  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; RRID :AB_10642024
Pénicilline-StreptomycineGibco15140122
Thermomixeur CEppendorf5382 000 015
TLA-110Beckman CoulterTLA-110 rotors
cytomètre en flux AB_2075894

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Cytom trie en fluxcellules prog nitrices cardiaquesultracentrifugationsuivi de nanoparticulesconjugaison d anticorpsintensit moyenne de fluorescenceCD63 CD9 CD81capture sur billes

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