Article de méthode

Sidérophore High-throughput Screening d’échantillons environnementaux : planter la rhizosphère sols, sols en vrac et tissus

DOI :

10.3791/59137

⸱

9 février 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Crop and Soil Sciences, Washington State University, 2Department of Plant Pathology, Washington State University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons un protocole pour le dépistage rapide des échantillons environnementaux pour potentiel de sidérophores contribuant à la biodisponibilité des micronutriments et de chiffre d’affaires dans les systèmes terrestres.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sidérophores (métal de faible poids moléculaire composés de chélation) sont importantes dans divers phénomène écologique allant de fer (Fe) cycles biogéochimiques dans les sols, à concurrence de pathogène, stimulation de la croissance végétale et croix-Royaume de signalisation. En outre, les sidérophores sont également d’intérêt commercial dans la biolixiviation et bioweathering de minerais et minéraux métallifères. D’évaluer quantitativement la production de sidérophores dans des échantillons complexes de manière rapide, rentable et solide est essentiel pour identifier les aspects importants des ramifications écologiques de l’activité de sidérophores, y compris, roman sidérophore produisant des microbes. La méthode présentée ici a été développée pour évaluer l’activité de sidérophores des communautés en-tact microbiome, dans des échantillons environnementaux, tels que les tissus de sol ou de la plante. Les échantillons ont été homogénéisés et dilués dans un milieu modifié de M9 (sans Fe) et des cultures d’enrichissement ont été incubées pendant 3 jours. La production de sidérophores a été évaluée dans des échantillons à 24, 48 et 72 heures (h) à l’aide d’une microplaque de 96 puits nouvelle CAS (Chrome azurol sulphonate)-Fe agar dosage, une adaptation de la méthode colorimétrique traditionnellement pénible et fastidieuse de l’évaluation de sidérophores activité, effectuée sur l’individu cultivé des souches microbiennes. Nous avons appliqué notre méthode pour 4 différents génotypes/lignes de blé (Triticum aestivum L.), y compris Lewjain, Madsen, PI561725 et PI561727 communément cultivées à l’intérieur du Nord-Ouest du Pacifique. La production de sidérophores a été clairement affectée par le génotype de blé et dans les types spécifiques de tissus végétaux observés. Avec succès, nous avons utilisé notre méthode pour dépister rapidement l’influence du génotype de la plante sur la production de sidérophores, des fonctions essentielles dans les écosystèmes terrestres et aquatiques. Nous avons produit plusieurs répétitions techniques, ce qui donne des différences statistiques très fiables dans les sols et dans les tissus végétaux. Ce qui est important, les résultats montrent que la méthode proposée permet d’étudier rapidement la production de sidérophores dans des échantillons complexes avec un degré élevé de fiabilité, d’une manière qui permet aux communautés d’être préservés pour des travaux postérieurs à identifier les taxons et les gènes fonctionnels.

Introduction

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Les sidérophores sont des biomolécules importantes impliquées principalement dans la chélation du fer pour la biodisponibilité, mais avec un large éventail de fins supplémentaires dans les écosystèmes terrestres et aquatiques allant de microbienne quorum sensing, signalisation à microbiennes plantes-hôtes, stimulation de la croissance végétale, coopération et concurrence au sein des communautés microbiennes complexes1,2. Sidérophores peuvent être classées selon leurs sites actifs et ses caractéristiques structurelles, créer quatre types de base : carboxylate, hydroxamate, catécholate et contrastées types3,4. De nombreux micro-organismes sont capables d’excréter plusieurs types de sidérophores5 et dans les communautés complexes, une grande majorité des organismes biosynthétiser les récepteurs membranaires pour permettre l’absorption d’une variété encore plus large de sidérophores1, 6. Des travaux récents indiquent que les sidérophores sont particulièrement importants à l’échelon communautaire et même dans les communications inter-royaume et biogéochimiques transferts7,8,9,10 ,11.

Chrome azurol sulphonate (CAS) a été utilisé depuis plus de 30 ans comme agent chélateur pour lier le fer (Fe) de telle sorte qu’addition de ligands (c.-à-d. les sidérophores) peut entraîner la dissociation du complexe Fe-CAS, créant un changement de couleur facilement identifiables dans le milieu 12. lorsque des CAS the est lié avec Fe, le colorant apparaît comme une couleur bleue royal, et comme le complexe Fe-CAS se dissocie, le milieu change de couleur selon le type de ligand utilisée pour piéger le Fe13. Le milieu initial, base liquide créé par Schwyn et Neilands en 1987, a été modifiée à plusieurs égards à accueillir l’évolution microbienne cibles14, habitudes de croissance et limites15, ainsi que divers métaux en dehors de la Fe, y compris en aluminium, manganèse, cobalt, nickel cadmium, lithium, zinc16, cuivre17et même l’arsenic18.

De nombreux agents pathogènes humains, aussi bien comme plantes micro-organismes favorisant la croissance (PGPM) ont été identifiés comme organismes producteurs sidérophore3,19,20et important rhizosphère et endophyte PGPM souvent tester résultats positifs pour la production de sidérophores4. La méthode traditionnelle axée sur les Fe liquide a été adaptée pour microplaques essais des isolats en culture pour la production de sidérophores21. Toutefois, ces techniques ne reconnaissent pas l’importance de la communauté microbienne dans son ensemble (le microbiome), en coopération et règlement potentiel de production de sidérophores dans les sols et les plantes systèmes22. Pour cette raison, nous avons développé une évaluation au niveau communautaire haut débit de production de sidérophores d’un environnement donné, basé sur l’analyse de CAS traditionnel, mais avec la réplication, la facilité de la mesure, la fiabilité et la répétabilité dans une microplaque dosage.

Dans cette étude, une analyse de CAS-Fe rentable et à haut débit pour détecter la production de sidérophores est présentée afin d’évaluer l’enrichissement de la production de sidérophores d’échantillons complexes (c.-à-d. des homogénats de sol et plante de tissu). En vrac, couplage lâche et étroitement lié aux rhizosphère (en fonction de la façon dont le sol était lié à la racine) ont été obtenus avec grain, shoot et tissus racinaires de quatre génotypes distincts de blé (Triticum aestivum L.) : Lewjain, Madsen, PI561725, et PI561727. Il a été émis l’hypothèse que les différences fondamentales entre les génotypes de blé pourrait entraîner des différences dans le recrutement et la sélection des sidérophores produisant des communautés. Un intérêt particulier est la différence entre des communautés microbiennes associées à la ligne isogénique de PI561725, qui est tolérant en aluminium car il possède ALMT1 (aluminium-activé Malate transporteur 1), par rapport à l’aluminium PI561727 isogénique ligne sensibles, qui possède une forme sensible non-aluminium du gène, almt123,24,25,26. L’objectif principal de l’étude était de développer une méthode simple et rapide d’évaluer quantitativement la production de sidérophores dans des cultures d’enrichissement sidérophore de types d’échantillons complexes tout en préservant les cultures pour les travaux futurs.

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Protocole

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Remarque : Emplacement du terrain : Washington State University, ferme de pathologie végétale (46 ° 46' 38,0" N 117 ° 04' 57,4" W). Les graines ont été semées à l’aide d’un semoir mécanique sur 19 octobre 2017. Chaque génotype de blé a été planté en headrows, environ 1 mètre de distance pour éviter un chevauchement du système racinaire. Plante et du sol ont été prélevés sur 9 août 2018, lorsque les plantes étaient prêtes pour la récolte. Des échantillons ont été recueillis de trois répétitions de quatre génotypes de blé : PI561725, PI561727, Lewjain, Madsen.

1. préparation du milieu modifié de M9

  1. Utilisation Na2PO4∙7H2O (12,8 g/200 mL), KH2PO4 (0,3 g/200 mL), NaCl (0,5 g/200 mL) et NH4Cl (1 g/20 mL) réactifs pour préparer la solution de sel de M9.
  2. Permet de 18 g de MgSO4∙7H2O dans 100 mL d’eau désionisée double (ddH2O) pour préparer 0,75 M MgSO4∙7H2O.
  3. Faire 1 M CaCl2∙2H2O en ajoutant 14,7 g de CaCl2∙2H2O avec 100 mL de ddH2O.
  4. Préparer la solution tampon en dissolvant 6,048 g de tuyaux dans 156 mL de ddH2O en agitant. Ajuster le pH à 6,8 avec 5 M de NaOH.
  5. Préparer les 20 % de glucose (dextrose monohydraté) en dissolvant 20 g de glucose dans 100 mL de ddH2O.
  6. Préparer des solutions et individuellement autoclave tous mais le glucose. Filtre de stériliser la solution de glucose pour l’ajout aux médias M9 après autoclavage (0,22 µm).
  7. Préparer le milieu modifié de M9 en mélangeant 156 mL de solution tampon de PIPES, 40 mL de solution de sels M9, 20 μL de solution de CaCl2·2H2O, 266 μL de MgSO4·7H2O et 4 mL des solutions de glucose 20 % dans la prévention des risques biotechnologiques armoire, en utilise une technique stérile.
  8. Pour la préservation de la mis à jour le M9, fermer le récipient, couvrir avec du papier d’aluminium pour protéger contre les UV et placer à 4 ° C.

2. préparation du CAS-Fe-milieu gélosé

  1. L’acide laver toute la verrerie en 100 mM HCl/100 mM HNO3 pendant au moins 2 h avant l’utilisation dans l’analyse de CAS.
  2. Préparer un plat de cuisson en aluminium rempli de sable de qualité laboratoire et couvrez-la de papier d’aluminium. À l’autoclave à 121 ° C pendant 30 min et mettre de côté.
  3. Préparer le noyau (bromure d’hexadécyltriméthylammonium) en ajoutant 0,0365 g à 20 mL FD2O et placer la solution à 37 ° C, pour promouvoir la solubilisation.
  4. Préparer 10 mM HCl et générer 1 mM FeCl3·6H2O avec HCl 10 mM comme solvant. Ajouter 0,0302 g d’autorités de certification à 25 mL de ddH2O en remuant doucement avec une barre de stérile agitation magnétique. Ajouter ensuite 5 mL de 1 mM FeCl3·6H2O (dans HCl 10 mM) pour les 25 mL de solution CAS tout en continuant de remuer doucement (la solution se transforme en couleur noir rougeâtre foncé).
  5. Ajouter lentement les 20 mL de solution de noyau en remuant doucement, dans la solution de Fe-CAS (cela donne une solution de bleue foncée).
  6. Préparer la solution tampon en dissolvant 15,12 g de tuyaux dans 375 mL de ddH2O, en agitant doucement. Ajuster le pH à 6,8 avec 5 M de NaOH. Ajouter de l’eau pour porter le volume à 450 mL. Ajouter 5 g de gel d’agarose à la solution. Autoclave les tuyaux tampon solution et la solution de CAS-Fe à 121 ° C pendant 30 min.
  7. Ajouter avec précaution l’intégralité de la solution de CAS-Fe à la totalité de la mémoire tampon de tuyaux dans la prévention des risques biotechnologiques armoire après que chacun d’eux est stérilisé.
  8. Placer la mélange de la solution dans un bain d’eau à 50 ° C.
    NOTE : Préparer fraîchement tous les réactifs en CAS-Fe-Agar avant chaque essai, comme le stockage à long terme à 50 ° C conduit à précipitations des résultats complexes et refroidissement CAS-Fe dans un milieu solidifié.
  9. Placer un bateau réactif stérile dans le sable stérile dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet et faire chauffer jusqu'à 50 ° C. Transférer le CAS-Fe-Agar dans le bateau, puis rapidement aliquotes de 100 µL à chaque puits dans une microplaque 96 puits claire, fond plat, stérile.

3. préparation standard Pyoverdine/EDTA

  1. Préparation de la Pyoverdine
    1. Préparer 800 μM pyoverdine étalon (mélange d’acide succinique, 2-hydroxy-glutarimides et succinaminde formes de pyoverdine – voir Table des matières), dans un milieu M9 mis à jour le préalablement préparé.
    2. Diluer cette solution en 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 et 6,25 μM solutions.
  2. Préparation-étalon EDTA
    1. Ajouter 0,594 g de l’acide éthylènediaminetétraacétique disodique (EDTA : C10H14N2Na2O8.2H2O), à 500 mL de milieu de M9 modifié préalablement préparé pour élaborer 3200 μM EDTA norme.
    2. Diluer cette solution en 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 et 6,25 solutions μM.
  3. Génération de la courbe d’étalonnage
    1. Ajouter 100 μL de chaque concentration de pyoverdine et EDTA pour séparer les puits d’une microplaque 96 puits contenant 100 μl de milieu gélosé CAS-Fe. Faire des répétitions techniques en double de chaque concentration. Aussi, ajouter un puits vide avec seulement M9 (sans EDTA ou pyoverdine).
    2. À l’aide d’un lecteur de microplaques, mesurer absorbance (à 420 nm et 665 nm) après une incubation de 1, 6 et 24h à 22 ° C et des mesures d’absorbance utilisation pour générer des courbes d’étalonnage.
      Remarque : Pour les mesures de 420 nm, soustraire absorbance des ébauches de l’absorbance de la pyoverdine ou puits contenant de l’EDTA. Pour 665 nm, soustraire l’absorbance de la pyoverdine ou EDTA contenant des puits d’absorption de brutes. Puis, log10(pyoverdine µM ou EDTA) est calculé en fonction des mesures d’absorbance. Pour faciliter l’interprétation des résultats de l’échantillon, utiliser absorbance comme l’axe des abscisses et ouvrez une session10(pyoverdine µM ou EDTA) que l’axe des ordonnées.

4. la collecte d’échantillons environnementaux : tissus du sol et des végétaux

  1. Laver le matériel d’échantillonnage (pelles et ciseaux) avec 0,22 µm filtré ddH2O suivi de l’éthanol à 70 % et essuyer avec du papier absorbant avant l’échantillonnage et entre les deux échantillons pour maintenir une technique stérile et de réduire la contamination croisée.
  2. Exciser les tissus végétaux (céréales et pousses) des plantes sur le terrain et placez-les dans un sac de rangement en plastique marqué, laissant suffisamment chaume shoot pour la facilité en déracinant les échantillons de sol et la racine désirées.
  3. Creuser une petite racine boule environ 15 cm de profondeur et 23 cm de largeur et placez-le dans un sac en plastique étiqueté distinct pour la préparation des échantillons dans l’environnement de laboratoire. Cette étape est similaire aux méthodes de McPherson et al.,27.
  4. Placez tous les échantillons (graines, pousses, sol et boules de racines dans des sacs séparés) directement sur la glace et conserver à 4 ° C jusqu'à ce que les échantillons sont traités pour l’essai de production de sidérophores.
  5. Des échantillons de sol racine associé se divisent en vrac, couplage lâche rhizosphère et étroitement lié aux rhizosphère.
    1. Sortez les boules de racine les sacs. Secouer doucement du sol de la motte. Secoué de sol, ainsi que le sol gauche dans le sac comprend le sol « en vrac ».
    2. Utiliser un maillet en caoutchouc pour enlever plus loin la terre de la motte. Il s’agit de la rhizosphère de couplage lâche.
    3. Générer étroitement lié aux rhizosphère en prenant racines avec l’échantillon étroitement liés et les mettre dans un tube à centrifuger. Ajouter 30 mL de ddH2O et vortex pour 2-3 minutes. Enlever les racines pour obtenir la dilution de lisier rhizosphère étroitement lié aux sols.

5. préparation des cultures d’enrichissement de sidérophores et test de production de sidérophores CAS-Fe

Remarque : Toute la verrerie doit être lavée avant de commencer les essais l’acide.

  1. Préparation d’échantillons de sol (pour chacun des trois types de sols échantillon)
    1. Homogénéiser chaque échantillon de sol dans le sac de prélèvement, en mélangeant et en tournant le sol autant que possible sans ouvrir le sac.
      Remarque : Ceci permet de réduire la variabilité spatiale du sol naturel et s’aligne avec les procédures d’échantillonnage de sol normal. Autres méthodes peuvent être utilisées pour homogénéiser les échantillons environnementaux, selon le cas et selon le protocole expérimental.
    2. Après chaque échantillon a été bien mélangées, aliquote et suspendre 2,0 g de chaque sol dans 20 mL de milieu modifié de M9, puis diluer 10-3 pour un volume total de 20 mL dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL avec un bouchon de mousse stérile pour permettre l’aération.
    3. Pour les échantillons de la rhizosphère étroitement lié, ajouter 2 mL de la suspension de sol rhizosphère à 20 mL de milieu modifié de M9, puis diluer 10-3 pour un volume total de 20 mL dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL avec un bouchon de mousse stérile pour permettre l’aération.
  2. Préparation des échantillons (racine, tige et grain) tissu
    1. Surface de stériliser l’échantillon avec l’éthanol à 70 %. Macérer 2,0 g de tissu frais dans 20 mL de milieu M9 modifié à l’aide d’un mélangeur à haute pendant 30 secondes. Transférer l’échantillon dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL, puis diluer 10-3 pour un volume total de 20 mL dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL avec un bouchon de mousse stérile pour permettre l’aération.
  3. Enrichissement de la Production de sidérophores par Limitation de Fe
    1. Incuber les tubes à centrifuger 50 mL à température ambiante et l’agiter à 160 tours/minute.

6. dosages agar CAS-Fe pour la détection de la production de sidérophores dans des échantillons environnementaux

  1. À 24, 48 et 72 h après le début de la culture d’enrichissement, retirer les tubes de l’enrichissement à l’aide technique stérile et centrifuger à 10 000 x g pendant 1 min en tubes de centrifugeuse de 2 mL pour Pelletiser les cellules sous-échantillons de 1 mL.
  2. Récupérer le surnageant séparé. Utilisant une technique stérile, ajouter 100 μL de surnageant à la solution de 100 μL de CAS-Fe-Agar en double ou triple exemplaire dans la microplaque. Également ajouter 100 µL de milieu stérile de M9 (comme vides). Puis incuber la plaque à 28 ° C.
  3. Suspendre le surnageant et granule pour chaque échantillon (ne pas ajouté à la plaque de microtitration) restants dans sa propre, tube à centrifuger stériles de 2 mL. Ajouter 400 ml de glycérol stérile dans chaque tube d’échantillon-surnageant et resuspendre le culot pour créer des stocks de glycérol. Congeler le stock à-80 ° C pour les analyses ultérieures.
    Remarque : Cette étape peut être modifiée pour générer des stocks de glycérol selon n’importe quel protocole interne préféré.
  4. Mesurer l’absorbance à 6, 24, 48 et 72 h, à la longueur d’onde de 420 nm.
  5. Utilisation des courbes standards produits de pyoverdine ou EDTA pour interpréter les mesures d’absorbance échantillon en termes de pyoverdine équivalents.
    NOTE : Pyoverdine a été établie à un niveau supérieur par rapport à l’EDTA (voir infra), afin de l’EDTA ne servait pas à interpréter les résultats dans la présente étude.

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Résultats

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Une pyoverdine mélange biosynthétisée par Pseudomonas fluorescens a été utilisée comme une norme à interpréter et à quantifier l’absorbance (à 420 nm) des échantillons en termes d’équivalents de pyoverdine en µM. la Figure 1 montre la relation entre l’absorbance (420 nm) et à partir de la concentration de la pyoverdine (molarité de10 Log en µM). EDTA ne prévoyaient pas un niveau suffisant, parce que les échantillons des mesures d’absorbanc...

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Discussion

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Le principal résultat de ce travail est la production d’une nouvelle méthodologie qui permet d’enrichir rapidement pour sidérophore produisant des microbes quand on mesure quantitativement sidérophore/activité de production dans les échantillons environnementaux. La méthode est rapide, simple et rentable, et les résultats montrent comment il peut être utilisé pour détecter les activités sidérophore de types d’échantillons complexes et nouveaux (p. ex.., tissus de sol et les plantes). Le protocole se traduit égal...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Remerciements

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Les auteurs tiennent à remercier Kalyani Muhunthan d’assistance dans les procédures de laboratoire, Lee Opdahl pour la récolte de blé génotype, le Washington State raisin Concord Research Council et la Washington State University Center pour soutenir l’Agriculture et Ressources naturelles pour un BIOAg subvention pour soutenir ce travail. Un financement supplémentaire a été fourni par l’USDA/NIFA à travers projet Hatch 1014527.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AgaroseApexLF451320014
Plat
Feuille
Chlorure d’ammonium, granulaireFiesher Scientific152315A
Autoclave et stérilisateurThermo Scientific
Chlorure de calcium dihydratéFiesher Scientific171428
CAS (Chrome Azurol S)Chem-Impex Int’l Inc)000331-27168
Dextrose monohydraté (glucose), poudre cristallineFiesher Scientific1521754
EDTA, sel disodique, dihydraté, CrystalJ.T.BakerJI2476
Glycérol, anhydreBaker analyséC22634
HDTMA (cétyltriméthylammomonium Réactif de bromureWorldFZ0941
Chlorhydrate d’acideACROS OrganicB0756767
Infinite M200 PRO lecteur de plaquesTECAN
Chlorure de fer (III) hexahydraté, 99 %ACROSOrganic
Hotte de laboratoireThermo Scientific
Incubateur de laboratoireVWR Scientific
Sulfate de magnésiumFiesher Scientific27855
Acide nirique, (69-70) %J.T.Baker72287
PIPES tampon, 98.5 %ACROSOrganic A0338723
Phosphate de potassium, dibaisc, poudreJ.T.BakerJ48594
PyoverdineSIGMA-ALDRICH078M4094V
Sable
SI-600R ShakerLab Companion
Chlorure de sodium, granulaireFiesher Scientific136539
Hydroxyde de sodium, granulésJ.T.BakerG48K53
Phosphate de sodium, heptahydrate dibasique, 99 %ACROS A0371705
de cuisson en aluminiumd’aluminium A0342179 organique

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Siderophore ScreeningCAS AssayMicroplate MethodSoil SamplesPlant TissuesEnrichment CultureIron LimitationPyoverdine StandardEDTA StandardWheat Genotypes

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