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Article de méthode

Microfocus X-ray CT (microCT) Imagerie d'Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), et Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

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⸱

DOI :

10.3791/59161

⸱

6 août 2019

 ,  ,  , 
1Mammalian Genetics Laboratory, National Institute of Genetics, 2Misaki Marine Biological Station, The University of Tokyo, 3Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba

Dans cet article

Résumé

Ici, les protocoles pour effectuer l'imagerie par tomodensitométrie par rayons X (microCT) de trois animaux invertébrés marins sont expliqués en détail. Cette étude décrit des étapes telles que la fixation de l'échantillon, la coloration, le montage, la numérisation, la reconstruction d'images et l'analyse des données. Des suggestions sur la façon dont le protocole peut être ajusté pour différents échantillons sont également fournies.

Résumé

Traditionnellement, les biologistes ont dû s'appuyer sur des méthodes destructrices telles que la section pour étudier les structures internes des organismes opaques. L'imagerie par tomodensitométrie par rayons X (microCT) microfocus non destructive est devenue un protocole puissant et émergent en biologie, en raison des progrès technologiques dans les méthodes de coloration des échantillons et les innovations dans le matériel microCT, les ordinateurs de traitement et les données logiciel d'analyse. Cependant, ce protocole n'est pas couramment utilisé, comme c'est le cas dans les domaines médical et industriel. L'une des raisons de cette utilisation limitée est l'absence d'un manuel simple et compréhensible qui couvre toutes les étapes nécessaires : prélèvement d'échantillons, fixation, coloration, montage, numérisation et analyse des données. Une autre raison est la grande diversité des métazoaires, en particulier les invertébrés marins. En raison de la diversité des tailles, des morphologies et des physiologies des invertébrés marins, il est crucial d'ajuster les conditions expérimentales et les configurations matérielles à chaque étape, selon l'échantillon. Ici, les méthodes d'imagerie microCT sont expliquées en détail à l'aide de trois invertébrés marins phylogénétiquement divers : Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) et Xenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Des suggestions sur l'exécution de l'imagerie microCT sur divers animaux sont également fournies.

Introduction

Les chercheurs en biologie ont généralement dû faire des sections minces et effectuer des observations par microscopie légère ou électronique afin d'étudier les structures internes des organismes opaques. Cependant, ces méthodes sont destructrices et problématiques lorsqu'elles sont appliquées à des spécimens rares ou précieux. En outre, plusieurs étapes de la méthode, telles que l'encastrement et la sectionnement, prennent du temps, et il peut prendre plusieurs jours pour observer un échantillon, selon le protocole. En outre, lors de la manipulation de nombreuses sections, il ya toujours une possibilité d'endommager ou de perdre certaines sections. Des techniques de défrichement sont disponibles pour certains spécimens1,2,3,4,5 mais ne sont pas encore applicables pour de nombreuses espèces animales.

Pour surmonter ces problèmes, certains biologistes ont commencé à utiliser microfocus radiographie par tomodensitométrie (microCT) imagerie6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15. Dans la tocrose à rayons X, le spécimen est irradié avec des rayons X sous différents angles qui sont générés à partir d'une source de rayons X se déplaçant autour de l'échantillon, et les rayons X transmis sont surveillés par un détecteur qui se déplace également autour de l'échantillon. Les données de transmission aux rayons X obtenues sont analysées pour reconstituer des images transversales du spécimen. Cette méthode permet l'observation des structures internes sans destruction de l'échantillon. En raison de sa sécurité et de sa facilité, il est couramment utilisé dans les applications médicales et dentaires, et les systèmes de Tomode peuvent être trouvés dans les hôpitaux et les centres dentaires dans le monde entier. De plus, la toctologie à rayons X industrielle est fréquemment utilisée pour observer des échantillons non médicaux aux fins d'inspection et de métrologie dans le domaine industriel. Contrairement à la ToMode médicale, dans laquelle la source de rayons X et les détecteurs sont mobiles, les deux parties sont fixées en CT industriel, l'échantillon tournant pendant la numérisation. Le CT industriel produit généralement des images à plus haute résolution que la toctorde médicale et est appelé microCT (résolution micrométrique) ou nanoCT (résolution nanométrique). Récemment, la recherche utilisant le microCT a rapidement augmenté dans divers domaines de la biologie14,15,16,17,18,19, 20 Ans, états-unis , 21 Ans, états-unis , 22 Ans , 23 Ans, états-unis , 24 Ans, états-unis , 25 Annonces , 26 Annonces , 27 Annonces , 28 Annonces , 29 Ans et plus , 30 Ans, états-unis ( , 31 Ans, états-unis ( , 32 Ans, états-unis ( , 33 Ans, états-unis ( , 34.

Les études biologiques utilisant CT ont au commencement visé des structures internes qui se composent principalement des tissus durs, tels que l'os. Les progrès dans les techniques de coloration utilisant divers agents chimiques ont permis la visualisation des tissus mous dans divers organismes6,7,8,9,14,15 , 16 Annonces , 17 Annonces , 18 ans, états-unis qui , 19 ans, états-unis qui , 20 Ans, états-unis , 21 Ans, états-unis , 22 Ans , 23 Ans, états-unis , 24 Ans, états-unis , 25 Annonces , 26 Annonces , 27 Annonces , 28 Annonces , 29 Ans et plus , 30 Ans, états-unis ( , 31 Ans, états-unis ( , 32 Ans, états-unis ( , 33 Ans, états-unis ( , 34. Parmi ces réactifs, les agents de contraste à base d'iode sont relativement sûrs, peu coûteux et peuvent être utilisés pour la visualisation des tissus mous dans divers organismes7,14. En ce qui concerne les invertébrés marins, le microCT a été largement utilisé sur des animaux tels que les mollusques6,25,32,33, annelides18,19, 20 Ans, états-unis , 28, et les arthoropodes21,23,29,31. Cependant, il ya eu peu de rapports sur d'autres phyla animales, tels que les bryozoaires6, xenacoelomorphs26, et les cnidaires24,30. En général, il y a eu moins d'études utilisant le microCT sur les invertébrés marins que sur celles sur les vertébrés. L'une des principales raisons de cette utilisation limitée des invertébrés marins est la grande diversité observée chez ces animaux. En raison de leurs diverses tailles, morphologies et physiologies, chaque espèce réagit différemment aux différentes procédures expérimentales. Par conséquent, il est crucial pendant la préparation de l'échantillon de choisir le réactif de fixation et de coloration le plus approprié, et de fixer les conditions à chaque étape, ajustée pour chaque espèce. De même, il est également nécessaire de définir les configurations de balayage, telles que la méthode de montage, la tension, le courant, le taux de grossissement mécanique, et la puissance de résolution de l'espace, de manière appropriée pour chaque échantillon. Pour surmonter ce problème, un manuel simple et compréhensible qui couvre toutes les étapes nécessaires, explique comment chaque étape peut être ajustée en fonction du spécimen, et montre des exemples détaillés à partir de plusieurs échantillons est essentiel.

Dans la présente étude, nous décrivons le protocole d'imagerie microCT étape par étape, de la fixation de l'échantillon à l'analyse des données, en utilisant trois espèces d'invertébrés marins. Des spécimens de l'anémone de mer Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria) ont été recueillis près de la station biologique marine de Misaki, Université de Tokyo. Ils avaient un corps sphérique et mou d'environ 2 cm de diamètre (figure1A-C). Des échantillons de Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) ont également été prélevés près de la station biologique marine de Misaki. Il s'agissait de vers minces d'environ 1,5 cm de longueur, avec des chaetae dures présentes tout le corps (figure1D). Un spécimen de Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) a été prélevé près du Centre de recherche marine de Shimoda, Université de Tsukuba, au cours de la 13e enquête conjointe sur les organismes côtiers DE JAMBIO. Il s'agissait d'un ver à corps mou d'environ 0,8 cm de longueur (figure 1E). Les ajustements effectués pour les conditions et les configurations de chaque échantillon sont expliqués en détail. Notre étude fournit plusieurs suggestions sur la façon d'effectuer l'imagerie microCT sur les invertébrés marins, et nous espérons qu'elle inspirera les biologistes à utiliser ce protocole pour leurs recherches.

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Protocole

1. Fixation

  1. Pour Actinia equina, détendez les animaux dans 10% mgCl2 eau de mer pendant environ 15 min à température ambiante. Transférer à 70 % d'éthanol et conserver à température ambiante.
  2. Pour Harmothoe sp., anesthésiez les animaux en les plaçant dans l'eau de mer glacée pendant environ 15 min. Transférer à 10 % (v/v) solution formaline avec de l'eau de mer et stocker à température ambiante.
  3. Pour Xenoturbella japonica, détendez l'animal en utilisant 7% MgCl2 en eau douce. Fixez le paraformaldéhyde (PFA) de 4 % dans l'eau de mer filtrée pendant la nuit. Placer dans 70 % d'éthanol et conserver à 4 oC.
    CAUTION: PFA est dangereux et doit être manipulé avec soin.

2. Staining

  1. Transférer les échantillons à 50 % d'éthanol et les conserver à température ambiante pendant 15 h. Remplacer l'éthanol à 50 % par 25 % d'éthanol et les conserver à température ambiante pendant 2 h.
    REMARQUE : Ce n'est pas nécessaire pour l'échantillon harmothoe sp. dans 10 % (v/v) solution formaline avec de l'eau de mer.
  2. Remplacer la solution par de l'eau distillée (DW) et conserver les échantillons en DW à température ambiante pendant 2 h. Répétez cette étape trois fois.
  3. Préparer 25% solution Lugol en diluant la solution stock (ci-dessous) à 25% avec DW. La solution stock (100% Lugol solution) contient 10 g de KI et 5 g de I2, ajusté à 100 mL avec DW.
    REMARQUE : La solution Lugol est sensible à la lumière, alors stockez et manipulez la solution protégée de la lumière. Suivez les règlements de chaque pays et institution pour la manipulation de l'iode et l'élimination des déchets.
  4. Décant le DW des échantillons et versez dans la solution Lugol 25%. Tache pendant 24 h à température ambiante.

3. Montage de scène

  1. Préparer 0,5 % d'agarose en dissolvant 500 mg d'agarose dans 100 ml de DW dans un flacon conique de 250 ml au micro-ondes (800 W, environ 1-3 min). Laisser refroidir jusqu'à environ 30-40 oC en gardant à température ambiante.
    CAUTION: Ne pas surchauffer ou sceller complètement le flacon lors du chauffage pour empêcher l'agarose de bouillir.
  2. Montez de grands échantillons comme A. equina à l'aide d'un tube de 50 ml.
    REMARQUE : Utilisez des tubes de 50 ml pour monter de gros échantillons qui ne s'insèrent pas dans une pointe « bleue » de micropipette de 1 000 l.
    1. Placer l'échantillon taché dans un plat de 60 mm avec DW pour laver la solution de coloration excessive de la surface.
    2. Verser doucement 5 ml d'agarose de 0,5 % dans un tube de 50 ml et durcir l'agarose sur la glace. Veillez à ne pas faire de bulles dans l'agarose.
    3. Ajouter doucement 20 ml d'agarose de 0,5 % au tube de 50 ml et placer sur la glace jusqu'à ce que l'agarose commence à durcir. Placez le spécimen dans l'agarose de 0,5% à l'aide de forceps. Veillez à ne pas faire de bulles dans l'agarose.
    4. Ajuster la position et l'orientation de l'échantillon avec des forceps et durcir l'agarose sur la glace.
    5. Placer l'argile sur la scène de montage microCT et placer le tube de 50 ml sur l'argile (Figure 2A).
  3. Montez de petits échantillons tels que Harmothoe sp. et X. japonica à l'aide d'une pointe « bleue » de micropipette de 1 000 l.
    REMARQUE : Pour les échantillons plus petits, une pointe «jaune» de 200 l micropipette peut être utilisée. Dans ce cas, utilisez 30 l'agarose pour le bouchon et ajoutez 200 l d'eau d'agarose ou distillée.
    1. Dessinez 100 L de 0,5 % en une pointe « bleue » de 1 000 l et durcissonz l'agarose en tenant la pointe sur la glace, en faisant une prise dans la pointe (figure 2B-a).
    2. Décant l'échantillon taché dans un plat de 60 mm sans utiliser de forceps.
    3. Transférer délicatement l'échantillon à l'aide d'une pince à épiler dans un autre plat de 60 mm avec DW pour laver la solution de coloration excessive de la surface.
    4. Ajouter 1 000 l d'agarose de 0,5 % ou DW dans la pointe branchée (étape 3.3.1) à l'aide d'une micropipette.
      REMARQUE : L'utilisation de 0,5 % d'agarose est recommandée, mais utilisez DW pour des échantillons fragiles ou précieux dans lesquels l'agarose doit être évitée.
    5. Transférer délicatement l'échantillon du plat de 60 mm dans l'agarose ou le DW dans la pointe branchée à l'aide d'une pince à épiler.
    6. Ajustez délicatement la position et l'orientation de l'échantillon à l'œil d'une aiguille de pétiolée ou d'une pince de précision. Veillez à ne pas faire de bulles dans le support de montage. Assurez-vous que l'échantillon est stable entre les parois de la pointe lorsque DW est utilisé comme milieu de montage (Figure 2D-b). Placer la pointe sur la glace pour durcir l'agarose si elle est utilisée comme milieu de montage.
    7. Coupez la pointe d'une nouvelle pointe « bleue » de 1 000 l de micropipette (figure2B-b,c)et insérez la pointe de la pointe branchée dans la nouvelle pointe.
    8. Placez l'argile sur la scène de montage microCT et placez les pointes avec l'échantillon à l'intérieur sur l'argile (Figure 2C,D).
      REMARQUE : La solution de coloration commencera à laver l'échantillon une fois qu'il est placé dans DW, ainsi passez à l'étape suivante de balayage rapidement.

4. Numérisation MicroCT

  1. Allumez le faisceau de rayons X à 80 kV, 100 A.
  2. Tout en observant l'image de transmission aux rayons X au centre de l'écran (Figure 3A), déplacez la scène de sorte que l'échantillon entier peut être vu en cliquant sur les boutons de l'axe X et Z (Figure 3A), et manuellement réglage du bouton de l'axe Y sur la scène de montage (Figure 3B). Définir le contraste de l'image de sorte que les structures internes peuvent être observées en ajustant les conditions de contraste (Figure 3A: Contraste d'image ).
  3. Ajuster l'orientation de l'échantillon en modifiant l'angle du tube/pointe dans l'argile (figure 2A). Faites pivoter l'étape à 90 degrés en réglant l'axe de rotation (figure 3A) à 90 et en cliquant sur le bouton de mouvement relatif (Figure 3A). Effectuez la même manœuvre quatre fois pour effectuer une rotation complète.
    REMARQUE : Éteignez manuellement le faisceau de rayons X chaque fois que la porte de l'échantillon est ouverte, à moins que le système ne l'éteigne automatiquement.
  4. Déplacez la scène de sorte que l'échantillon soit au centre de la vue en cliquant sur le bouton de l'axe Z (Figure 3A) et en ajustant manuellement le bouton de l'axe Y sur l'étage de montage (Figure 3B). Tournez la scène par 90 et faites de même. Tournez l'étape à 360 degrés et vérifiez que l'échantillon est au centre de la vue de toutes les directions.
  5. Déplacez l'étape le long de l'axe X vers la source du faisceau de rayons X en cliquant sur le bouton de l'axe X (Figure 3A) pour agrandir l'échantillon et ajuster au besoin afin qu'il s'adapte juste dans la vue (Figure 3C).
  6. Tournez l'étape à 360 degrés et ajustez-la au besoin pour que l'échantillon s'insère dans la vue de toutes les directions.
  7. Ajuster les conditions de numérisation comme indiqué dans le tableau 1.
  8. Commencer la numérisation; il faut environ 10 min.

5. Reconstruction d'image

  1. Démarrez le logiciel accessoire du système microCT (voir le Tableau des matériaux) et ouvrez les données numérisées.
  2. Ajuster les différences dans l'axe de rotation de l'échantillon lors de la numérisation en cliquant sur le bouton de calcul automatique de la valeur des décalages (figure4A: boîte verte).
  3. Ajuster l'orientation de l'image en tournant les flèches oranges (Figure 4B). Si l'orientation a été modifiée, répétez l'étape 5.2.
  4. Cliquez sur l'onglet zone (figure4C: boîte magenta) et les zones de finition où les échantillons ne sont pas présents (figure 4C: boîte jaune).
  5. Cliquez sur l'onglet reconfiguration (Figure4D: boîte magenta) et configurez les filtres comme suit pour éliminer le bruit. Filtre de réduction d'artefact : Filtre médian -3 ; Filtre d'élimination du bruit : Filtre moyen-1.
  6. Effectuer la reconfiguration en cliquant sur le bouton de reconfiguration (Figure4D : boîte verte).
  7. Ajustez la luminosité et le contraste de l'image en définissant les valeurs noir et blanc comme valeur noire 0, valeur blanche 250 (Figure 4D: boîte bleue).
  8. Enregistrez le jeu de données d'image TIFF reconstruit en tant que TIFF 8 bits en cliquant sur le bouton enregistrer. Renommer les fichiers TIFF comme suit : Date-sample-resolution (m)-number.tiff.
    REMARQUE : Les ensembles de données microCT originaux de cette étude sont disponibles dans le référentiel de Figshare, doi:10.6084/m9.figshare.767083736.

6. Analyses de données

  1. Démarrez le logiciel d'analyse de données (voir le Tableau des Matériaux) et activez l'importation de fichiers TIFF en cliquant sur l'icône Base de données (Figure5A: boîte magenta) et en éteignant la case indiquée dans la figure 5B.
  2. Cliquez sur l'icône d'importation (figure5C: boîte magenta), sélectionnez le jeu de données enregistré dans la section 5, et cliquez sur open.
  3. Cliquez sur le bouton de liens de copie (Figure 5D) pour importer les données.
  4. Affichez la section 2D en cliquant sur l'icône du visualiseur 2D (figure5C: boîte bleue).
  5. Calibrer le jeu de données en cliquant sur l'onglet visionneuse 3D (figure5E: boîte magenta) et en entrant la valeur de résolution à la numérisation (qui était de 0,018 dans cette étude [ Figure5F]).
  6. Cliquez sur l'icône luminosité/contraste (Figure 5E boîte verte). Ajustez la luminosité et le contraste en déplaçant le curseur à l'intérieur de l'image 2D affichée et en changeant le niveau de la fenêtre et la largeur de la fenêtre (Figure 5G).
  7. Vérifiez d'autres images transversales en déplaçant la barre de défilement (figure5G : boîte).
  8. Modifier l'orientation de la section transversale en cliquant sur l'icône d'orientation (figure5E: boîte bleue) et vérifier les images à toutes les orientations (Figure 5H).
  9. Cliquez sur l'image affichée et choisissez l'onglet d'exportation pour stocker des images transversales.

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Résultats

Nous avons exécuté la formation image de microCT sur A. equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida), et X. japonica (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) après coloration des échantillons avec la solution lugol de 25%. La coloration a amélioré avec succès le contraste des structures internes dans tous les spécimens, permettant l'observation des tissus mous internes (figure 6). Avec les rapports précédents6,

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Discussion

Les fixatifs utilisant la formaline, tels que la solution formaline de 10 % (v/v) dans l'eau de mer utilisée dans cette étude, sont connus pour préserver la morphologie de divers invertébrés marins et sont souvent utilisés pour l'imagerie microCT18,24,25 ,26,28,30,33. Cependant, des restric...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Nous tenons à remercier Toshihiko Shiroishi pour son aide et pour fournir l'environnement de recherche au cours de cette étude. Nous sommes reconnaissants à Kensuke Yanagi et Takato Izumi pour des conseils sur A. equina, et Masaatsu Tanaka pour des conseils sur le spécimen Harmothoe sp. Nous tenons à remercier le personnel du Shimoda Marine Research Center, de l'Université de Tsukuba et de la station biologique marine de Misaki, à l'Université de Tokyo, pour leur aide dans les collections d'échantillons. Nous tenons à remercier Editage (www.editage.jp) pour l'édition en anglais. Ce travail a été soutenu par le JSPS Grant-in-Aid for Young Scientists (A) (JP26711022) à HN, et JAMBIO, Japanese Association for Marine Biology.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Erlenmeyer 250 mlCorningCLS430183
5 ml Tube d’échantillonnage ST-500BIO-BIK103010
50 ml Tube en polypropylèneGreiner Bio One International227261
60 mm Plat non traitéIWAKI1010-060
AgarosePromegaV3125
Pointe de qualité écologique (bleu) 1000 et micro ; lBMBioBIO1000RF
ÉthanolWako Pure Chemical Industries057-00451
FormolWako Pure Chemical Industries061-00416
IodeWako Pure Chemical Industries094-05421
Chlorure de magnésium hexahydratéWako Pure Chemical Industries135-00165
Visionneuse DICOM OsiriXPixmeo SARLOsiriX MD v10.0https://www.osirix-viewer.com
ParaformaldéhydeWako Pure Chemical Industries163-25983
Aiguille pétioléeAS ONE2-013-01
Micropipette Pipetman P200GILSONF123601
Pipetman P1000 MicropipetteGILSONF123602
Iodure de potassiumWako Pure Chemical Industries166-03971
Pince à épiler de précision 5DUMONT0302-5-PS
QuickRack MultI fit tip (jaune) 200 ulSorenson10660
Lames de rasoirFeatherFA-10
Pince à épilerNAPOXA-26
Microscope stéréoscopiqueLeicaMZ95
Système d’imagerie Micro-CT à rayons XComscantechnoScanXmate-E090S105

Références

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Microfocus X-ray CT (microCT) Imagerie d'Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), et Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)
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