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Article de méthode

Préparation et Immunostaining des cérébelleux Myélinisantes Organotypiques

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DOI :

10.3791/59163

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20 mars 2019

 ,  ,  ,  , 
1Sorbonne Université, Inserm, CNRS, Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM-GH Pitié-Salpétrière

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici une méthode pour préparer organotypique cultures tranche de cervelet de souris et de la gaine de myéline, la coloration par immunohistochimie approprié pour enquêter sur les mécanismes de la myélinisation et remyélinisation du système nerveux central.

Résumé

Dans le système nerveux, la myéline est une structure complexe membranaire générée par myélinisantes glial cells, les axones des cellules et facilite la conduction électrique rapide. Altération de la myéline s’est avérée de se produire dans diverses maladies neurologiques, où elle est associée à des déficits fonctionnels. Ici, nous fournir une description détaillée d’un ex vivo modèle composé de tranches de cervelet organotypique souris, qui peuvent être maintenues en culture pour plusieurs semaines et encore être étiquetés de manière à visualiser la myéline.

Introduction

Les neurones sont des cellules hautement polarisées, qui forment un compartiment somato-dendritique qui reçoit les entrées de son environnement et un axone qui assure la génération et la propagation des impulsions électriques à d’autres cellules. Propagation rapide et en temps opportun de l’information est essentielle au bon fonctionnement du système nerveux. Chez les vertébrés, elle est facilitée par la myélinisation, qui permet d’augmenter la vitesse de conduction axonale1. La myéline est une structure spécialisée, formée par des couches compactées de membrane de plasma généré par les cellules gliales myélinisantes, à savoir les oligodendrocytes dans le système nerveux central (CNS) et les cellules de Schwann dans le système nerveux périphérique (PNS). Aussi bien dans le SNC et des billets à ordre, des interactions axoglial conduire la formation de domaines axonales spécialisés : les nœuds de Ranvier et leurs domaines, paranodes et juxtaparanodes environs2. Les segments axones isolés par la myéline ou entrenoeuds, alternent avec les nœuds de Ranvier, qui correspondent aux petits domaines amyélinisés enrichis dans les canaux sodiques voltage-dépendants (Nav). La forte concentration et l’activation rapide des canauxv Na aux nœuds de Ranvier permettent la régénération des potentiels d’action et ainsi que les propriétés isolantes de la gaine de myéline, assurer la conduction saltatoire rapide et efficace de la influx nerveux le long de l' axone3.

Outre son rôle dans l’accélération de la vitesse de conduction de l’influx nerveux, cellules gliales myélinisantes fournit soutien métabolique à l’axone, la préservation de son intégrité à long terme et de participer à sa survie,4,à5. En outre, il est devenu évident dans ces dernières années que la myéline est modulée dynamiquement tout au long de la vie, sans doute participant ainsi à la régulation et la plasticité des diverses fonctions du système nerveux. Réglages de la distribution, nombre, longueur et épaisseur des gaines de myéline le long des axones peuvent ainsi représenter une nouvelle manière de régler finement les différents réseaux6,7,8. Par conséquent, l’acquisition évolutive de la myéline est un processus essentiel pour les fonctions sensorielles, motrices et cognitives et la perturbation de l’interaction entre les axones et cellules gliales est plus en plus considérée comme faisant partie de développement ou acquises neurologique les maladies9.

Composition de la myéline a été caractérisée, avec la particularité d’une grande proportion de lipides (70 %) par rapport aux protéines (30 %) Contrairement à d’autres membranes cellulaires10. Cependant, contrairement aux lipides de la myéline, la plupart des protéines de la myéline sont spécifique à la myéline, dont la protéine basique de la myéline (MBP), protéine protéolipidique (PLP), 2', glycoprotéine de 3'-nucléotide cyclique 3'-phosphodiestérase (CNP), associée à la myéline (MAG), glycoprotéine myéline oligodendrocyte (MOG), PMP-22 et P010. Diverses méthodes histologiques sur la tache de la myéline existent selon sa composition lipidique, tel que Luxol rapide bleu11, Soudan noir B12, Baker hématine acide méthode13, ainsi que14de coloration à l’argent. Néanmoins, ces approches ne permettent pas toujours un contraste adéquat et la résolution pour visualiser des fibres individuelles. Une autre approche pour détecter la myéline est par immunohistochimie dirigé contre les protéines de la myéline. Différents anticorps ciblent les antigènes spécifiques de la myéline avec une grande spécificité et peuvent être utilisés régulièrement pour détecter les structures myélinisées. L’interaction d’anticorps-antigène peut être révélée davantage à l’aide d’un anticorps secondaire couplé à un fluorophore dirigées contre l’anticorps primaire et visualisé à l’aide de la microscopie en fluorescence adéquate. Nous décrivons ici un protocole immunochimique pour souiller la myéline sur ex vivo tranches de cervelet, un modèle qui permet une bonne conservation de l’architecture du tissu nerveux. En outre, l’organisation et la taille des cellules de Purkinje (le seul neurone myélinisée du cervelet) rendent un modèle classique pour des études électrophysiologiques et ils sont de même idéales pour réaliser des études fixes ou d’images en direct.

Les tranches de cervelet sont générés à partir de souris P9-P10, un temps correspondant à l’apparition précoce de cellules de Purkinje myélinisation, un processus qui est principalement réalisé en une semaine ex vivo (6-7 jours in vitro, DIV)15. En outre, ce modèle est adapté pour enquêter sur les troubles démyélinisantes chronique comme la sclérose en plaques (MS), car une démyélinisation étendue peut être induite en tranches de cervelet à l’aide de la lysophosphatidylcholine composée de myelinotoxic (ou lysolécithine, LPC), qui est suivie par une remyélinisation spontanée16,17. Remyélinisation endogène a lieu deux jours après l’enlèvement de la LPC milieu de culture et est presque complète un traitement de post de la semaine.

L’achèvement du présent protocole prend environ 3 semaines, dont une demi-journée pour la préparation de cultures de tranches cérébelleux, une semaine pour obtenir des tranches entièrement myélinisées, suivis de 2 jours pour atteindre le sommet de démyélinisation et une autre semaine pour leur plein remyélinisation. En outre, l’immunohistochimie peut être complété en 2 jours. Le protocole décrit ici est adapté à une portée standard de 6 chiots de souris et doit être adaptée au sujet du nombre d’animaux utilisés pour l’expérience prévue.

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Protocole

Tous les travaux impliquant des animaux respecté les politiques institutionnelles et aux lignes directrices établies par l’UPMC, INSERM et Français et communautaire européen, la Directive 86/609/CEE.

1. préparation du milieu de Culture et de la Culture insère (Hands-on temps ≈ 10 à 15 min)

Remarque : Effectuez cette étape dans une hotte à flux culture en conditions stériles

  1. Préparation de 40 mL de milieu de culture, qui se compose de 50 % afro-Caribéens, équilibré de Solution de 25 % Hank saline (1 x), 25 % inactivés par la chaleur cheval sérum, additionné de dérivé de glutamine 2 mM, 100 UI/mL de pénicilline-streptomycine et 4,5 mg/mL D-Glucose. Ajuster le pH à 7,4.
  2. Filtre-stériliser le milieu à travers une 0,22 μm adapté sur une seringue en plastique de 50 mL.
    Remarque : Milieu de culture peuvent être stocké à 4 ° C pendant au moins une semaine.
  3. Pour une portée standard de 6 chiots, utiliser deux plaques de 6 puits stériles. Pour chaque plaque, retirez le couvercle et ajouter 1 mL de milieu de culture par puits.
  4. Placer un insert de culture dans chaque puits individuels en tenant le bord en plastique avec une pince stérile. Remettez le couvercle sur la plaque.
    Remarque : Les tranches de cervelet prélevés un chiot (6-8) peuvent être expédiés sur deux membranes (3-4 tranches de cervelet par insertion de la membrane).

2. préparation du milieu de la Dissection (Hands-on temps ≈ 5 min)

Remarque : Effectuez cette étape dans une hotte à flux culture en conditions stériles

  1. Préparer 100 mL de milieu de dissection, constitué de Solution de Gey saline équilibrée additionnée de 4,5 mg/mL x D-Glucose et 1 pénicilline-streptomycine (100 UI/mL chaque).
  2. Filtre-stériliser le milieu à travers un filtre de 0,22 μm.
    Remarque : Le milieu de la dissection peut être stocké à 4 ° C pendant au moins un mois.
  3. Ajouter 5 mL de milieu de dissection froide dans les boîtes de culture cellulaire 60 mm. Préparez une boîte de culture cellulaire 60 mm pour chaque chiot à être disséqué.
  4. Garder les plats de dissection sur la glace jusqu'à l’utilisation.

3. préparation du matériel de dissection (Hands-on temps ≈ 15 min)

  1. Nettoyer le banc avec 100 % d’éthanol.
  2. Stériliser tous les outils de dissection, une lame de rasoir et plate-forme en plastique de l’hélico de tissu avec 100 % d’éthanol.
  3. Fixer la lame de rasoir et de la plateforme en plastique sur le hacheur de tissu et ajuster l’épaisseur de coupe à 300 µm.
  4. Veillez à ce que tout l’éthanol s’est évaporée avant de commencer la dissection.

4. CerebellumDissection et préparation de Sections (Hands-on temps ≈ 15 à 20 min par animal)

  1. Lieu de la pétri de la cellule de 60 mm contenant le milieu de dissection glacé sous le microscope binoculaire et enlever la plaque supérieure.
  2. Tamponner la fourrure tête avec 70 % d’éthanol (évitant soigneusement touchant les yeux de l’animal) et décapiter l’animal à l’aide de grands ciseaux pointus, conformément à la procédure approuvée.
    Remarque : Les tranches de cervelet sont générés à partir de souris P9-P10 sans sexe spécifique ni partialité de souche.
  3. Petits ciseaux permet de couper la peau le long de la ligne médiane de la tête à partir du cou et allant jusqu'à la bouche de la souris.
  4. Pour tenir la tête et exposer le crâne, replier la peau sur le ventre sous la tête et pincez les deux plis de peau entre les doigts.
  5. Insérez les petits ciseaux doucement dans le trou occipital et couper le crâne en faisant un latéral incision sur le côté et couper tout autour du crâne tête. Garder la pointe des ciseaux comme parallèle et à proximité de crâne que possible pendant la coupe, pour éviter d’endommager le tissu cérébral.
  6. Récupérer la partie dorsale du crâne à l’aide de la pince fine-droit. Tout en soulevant délicatement la partie dorsale du crâne, couper les méninges adhérentes (membrane translucide irriguée qui entoure le tissu de cerveau) si nécessaire avec petits ciseaux pour éviter d’endommager le tissu cérébral.
  7. Introduire prudemment pince fine-droit (ou sinon utiliser une spatule) entre le crâne ventral et le cerveau, doucement flip sur le cerveau et couper les optiques et les nerfs trijumeau avec des petits ciseaux.
  8. Aider le cerveau à tomber par gravité dans le 60 mm cellule boîte de Petri contenant le support de dissection glacée en retournant la tête juste au-dessus de la capsule et libérer les adhérences derniers avec des petits ciseaux si nécessaire.
  9. À l’aide de pinces fines, orientez le cerveau avec la face dorsale vers le chercheur et la face ventrale, couché sur le fond du plat.
  10. Sous le microscope binoculaire, utiliser la pince fine-droit pour immobiliser le cerveau sur le côté du prosencéphale et évitez de toucher le cerveau postérieur, comme il pourrait obtenir endommagé. Séparer le cerveau postérieur du reste du cerveau (fore - et mésencéphale, voir schéma à la Figure 1Aa), à l’aide de la pince fine-droit. Pour séparer le cervelet du reste de la cerveau postérieur, utiliser la pince fine pour couper les pédoncules cérébelleux sous le cervelet (voir schéma sur 1Aa Figure').
  11. Une fois que le cervelet est isolé, soigneusement arracher les méninges avec une pincette amende-droit (voir le schéma sur 1Aa Figure').
  12. Tenez le cervelet délicatement avec la pince courbe fine et placez-le avec la face dorsale vers le haut sur le plateau en plastique perpendiculairement à la lame de rasoir hachoir (voir schéma sur la Figure 1).
  13. Aspirer l’excédent éventuel du milieu de dissection autour du cervelet en utilisant un embout de la pipette stérile de mince-fin adapté sur un 1 mL pipette (voir schéma sur la Figure 1).
  14. Veiller à ce que le cervelet repose à plat, mais il est pas étiré, une fois placé sur la plate-forme pour obtenir des tranches sagittales optimales lors de sectionnement (voir schéma sur la Figure 1).
  15. Couper 300 μm d’épaisseur coupes sagittales du cervelet avec le hachoir de tissu (voir le schéma sur Figure 1Bb'). La force et la vitesse de la lame doivent être optimisés sur site.
  16. Doucement, ajouter une goutte de milieu de dissection sur le cervelet en tranches. À l’aide d’une échelle-alésage de la pipette placée sur une pipette 1 mL, lentement aspirer le cervelet en tranches et le transférer dans la boîte de Petri 60 mm cellule contenant le support de dissection glacee (voir schéma sur Figure 1Bb'').
  17. Nettoyer la plate-forme en plastique de l’hélico de tissu avec 100 % d’éthanol entre chaque tranchage du cervelet. Laissez l’éthanol s’évapore avant de placer le cervelet suivant sur la plate-forme.
  18. Utiliser deux pinces fine-droit (ou aiguilles de titane) pour séparer les tranches individuelles et sélectionner 6-8 tranches dans le vermis (voir schéma sur la Figure 1Cc et 1Cc').
  19. Prenez une plaque 6 puits avec inserts de culture et de transférer jusqu'à 4 tranches sélectionnées sur une culture insertion ainsi qu’un support de dissection, à l’aide d’une échelle-alésage de la pipette adaptée sur une pipette 1 mL (voir schéma sur Figure 1Cc').
  20. Déposer les tranches dans le milieu de l’insert de la culture en utilisant le moyen de la dissection ou une pince à pousser et les tirer doucement dans le bon emplacement, évitant d’être en contact avec l’autre (voir schéma sur Figure 1Cc').
  21. Enlever tout excédent de milieu de dissection autour les tranches à l’aide d’un embout de la pipette de mince-fin. Veiller à ce que les tranches étaler à plat sur la membrane (voir schéma sur Figure 1Cc').
  22. Placer la plaque de 6 puits dans l’incubateur immédiatement après avoir ajouté les tranches sur la membrane.

5. tranches de Culture et la démyélinisation (Hands-on temps ≈ 15 à 20 min)

Remarque : Effectuez cette étape dans une hotte à flux culture en conditions stériles

  1. Remplacer le milieu de culture avec 1 mL par puits de milieu de culture frais préchauffé et tamponné tous les 3 jours après préparation de tranches.
  2. Démyélinisation, enlever tout milieu de culture ci-dessous la culture insère après 6 jours in vitro (DIV) et remplacez-le par 1 mL par puits préchauffé frais de milieu de culture contenant 0,5 mg/mL LPC. Incuber pendant 15 à 17 h à 37 ° C, 5 % de CO2.
  3. Après incubation, laver les inserts en les plaçant dans un 25 mm boîte de pétri contenant 1 mL de milieu de culture pré chauffé.
    Remarque : Les inserts doivent être en contact avec le fluide, mais ne pas englobés par celle-ci.
  4. Transférer immédiatement les inserts de culture dans une nouvelle plaque 6 puits contenant le milieu de culture frais préchauffé.
  5. Remplacer le milieu de culture avec 1 mL de milieu de culture frais préchauffé tous les 2-3 jours jusqu'à la fixation de tranches.

6. immunohistochimie (temps pratique ≈ 01:30 – 2 h)

Remarque : Réalisez les étapes 6.1. à 6,3. sous une hotte aspirante. Éviter l’exposition à la paraformaldéhyde (PFA) et reportez-vous à la fiche produit de sécurité pour la manipulation adéquate et protection.

  1. Utilisez des pinces à soulevez que chaque culture insère en tenant le bord en plastique et enlevez le milieu de culture sous la membrane insère dans chaque puits.
  2. Fixez les tranches de cervelet pendant 30 min en ajoutant 2 mL de 4 % PFA dans 1 x tampon au phosphate pH 7.4 sur les inserts de la membrane.
    Remarque : Le point de temps de fixation dépend du stade de myélinisation étudié : DIV 4 correspond à l’apparition de la myélinisation, DIV 7 tranches entièrement myélinisées. En cas de traitement de la LPC, DIV 9 correspond au pic de démyélinisation, 11 DIV à l’apparition de la remyélinisation et 14 DIV entièrement des tranches de remyelinated.
  3. Laver les inserts avec les tranches de trois fois avec du PBS 1 x 2 mL pendant 10 min.
  4. Séparer les tranches les inserts membrane sous le microscope binoculaire à l’aide d’un 25 x à 30 x, en poussant doucement à l’aide d’un scalpel ou un pinceau. Alternativement, pour éviter le risque d’endommager les tranches en les détachant de la membrane, utiliser un scalpel pour couper la membrane avec les tranches encore attachés.
  5. Transférer les tranches flottantes dans les puits d’une plaque de 4 puits contenant 1 x PBS, à l’aide d’un pinceau.
  6. Aspirer les PBS de chaque puits et incuber les tranches dans l’éthanol 100 % refroidis à-20 ° C pendant 15 à 20 min. Cette étape facilite la pénétration des anticorps dans des fibres myélinisées.
  7. Aspirer le 100 % d’éthanol et laver une fois brièvement avec 1 x PBS, puis deux fois dans du PBS 1 x pendant 10 min à température ambiante.
  8. Aspirer le PBS et incuber les tranches pendant 30 à 45 min avec une solution contenant 1 x PBS, 5 % NGS, 0,3 % de détergent non ionique à température ambiante pour bloquer les sites de fixation non spécifique anticorps.
  9. Aspirer la solution de blocage. Aucun lavage n’est nécessaire.
  10. Incuber les tranches du jour au lendemain avec l’anticorps primaires dilués en bloquant la solution à 4 ° C. Pour visualiser la myéline sur tranches organotypique cérébelleux, utilisez MBP (poulet, 1/150 ou souris IGg2b, Smi99, 1/200) ou PLP (Rat, hybridomes, 1/5 à 1/10) les anticorps.
    Remarque : Pour révéler l’expression de l’antigène plus d’un dans la même tranche, effectuez un double ou triple procédure de coloration (voir la Figure 1 par exemple). Pour effectuer l’incubation en même temps, assurer l’anticorps primaires sont produites chez les différentes espèces. Ensuite, utilisez leurs anticorps secondaires correspondants couplés à fluorophores différents (voir Table des matières pour nodal et paranodale marqueur18 anticorps).
  11. Le deuxième jour, lavez les tranches trois fois au PBS 1 x pendant 10 min.
  12. Incuber pendant 3h avec l’anticorps secondaires dilués en bloquant la solution (dilution 1/500) dans l’obscurité à température ambiante.
    Remarque : Optimisation du temps d’incubation et de dilution d’anticorps peut être nécessaire lorsque vous utilisez les autres anticorps que ceux décrits ici.
  13. Laver les tranches trois fois dans du PBS 1 x pendant 10 min dans l’obscurité.
  14. Sous un microscope binoculaire, monter les tranches sur une lame de verre. Déposer 100 µL de PBS 1 x sur la lame et transférer les tranches dans du PBS à l’aide d’un pinceau. Déplier les tranches si nécessaire et les aplatir sur la diapositive. Enlever tout excédent de PBS. Dans le cas où l’immunomarquage est exécutée avec les tranches encore attachés aux membranes, montez avec les tranches de la lamelle couvre-objet, avec la membrane sur la lame de verre.
  15. Déposez une goutte de milieu de montage directement sur la lamelle de verre et couvrir délicatement les tranches. Diapositives montées peuvent être conservés pendant plusieurs mois à 4 ° C dans l’obscurité.

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Résultats

Exemples de myéline représentant immunostainings en tranches de cervelet organotypique provenant de P9-P10 C57black6 sauvage (WT) (Figure 2 a), ainsi que les souris transgéniques PLP-GFP (Figure 2 b), ainsi que la coloration des cellules de Purkinje. Myéliniser de la substance blanche cérébelleuses tranches pistes région des tranches vers la périphérie de la folia et myélinisation des cellules de Purkinje est principalement obten...

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Discussion

Ici, nous détaillons un protocole pour générer un ex vivo modèle correspondant aux souris cérébelleux organotypiques, adapté de précédemment méthodes publiées15,16,19 et la myéline ultérieure immunomarquage de ces préparations. Cette stratégie offre la possibilité de visualiser les composants de la myéline avec une haute résolution dans les États sains et pathologiques.

Organotypiques cervelet de sour...

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Déclarations de divulgation

Aucun des auteurs ont des intérêts divergents ou conflits d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions le Dr Sean Freeman, Dr Nathalie Sol-Foulon et Dr Thomas Roux de précieux commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été financé par l’INSERM, ICM, ARSEP subventions R13123DD, ANR R17127DD (d’après JC) et bourses de recherche FRM, SPF20110421435 (d’après JC), FDT20170437332 (à M.T.). Nous remercions les installations de culture de cellule CELIS et l’icm. Plate-forme d’imagerie quant.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BME moyenThermoFisher Scientific41010026
Hank' s Solution saline équilibrée (10x HBSS)ThermoFisher Scientific14180046
GlutaMAX (100x)ThermoFisher Scientific35050038
Sérum de cheval inactivé par la chaleurThermoFisher Scientific26050088
Pénicilline&ndash ; Streptomycine (10.000 UI/mL)ThermoFisher Scientific15140122
Gey' s Solution saline équilibréeSigma AldrichG9779-500ML
Solution de D-glucose (45 %)Sigma AldrichG8769-100ML
Lysophosphatidylcholine (LPC)Sigma AldrichL4129-100MG
Paraformaldéhyde (PFA)Microscopie électronique Sciences15714
Éthanol absolu (100 % éthanol)VWR Chemicals20821.330Refroidi à -20° ; C
Triton® ; X-100Sigma AldrichX100-500ML
10 % Sérum de chèvre normal (NGS)ThermoFisher Scientific500622
Phosphate Buffer SolutionEuroMEDEXET330-ApH 7.4
Anticorps anti-GFP (polyclonal, poulet)Merck Millipore06-896Dilution 1/300
Anticorps anti-protéine basique de myéline (MBP) (polyclonal, poulet)Merck MilliporeAB9348Dilution 1/150
Anticorps anti-myéline basique (MBP) (monoclonal, souris IgG2b)Merck MilliporeNE1019Dilution 1/200
Anticorps anti-PLP (rat, hybride)Don du Dr K. Ikenaka ; Okasaki, JaponDilution 1/5 à 1/10
Canal antisodique, anticorps Pan (monoclonal, IgG1 de souris, clone K58/35)Sigma AldrichS8809Dilution 1/150
Anticorps anti-Caspr (polyclonal, lapin)Abcamab34151Dilution 1/500
Anticorps secondaires de chèvre conjugués à Alexa Fluor 488, 594, 647 ou 405ThermoFisher Scientific1/500
FluoromountSouthernBiotech0100-20
Hachoir à tissusMcIlwain
Lames de
Grands ciseauxF.S.T14101-14
Petits ciseauxF.S.T91500-09
Pince fine-droiteF.S.T91150-20
Pince courbée-fineF.S.T11297-00
Boîtes de culture cellulaire (60 mm et 100 mm)TPP
4, 6 puitsInserts
(0,4 µ ; m, 30 mm de diamètre)Merck MilliporePICM0RG50
Incubateur de37° ; C, 5 % CO2
Pointes de pipette à extrémité fineDutscher134000CL
Pointes de pipette à alésage largeThermoFisher Scientific2079G
Seringue stérileTerumo Europe20 ou 50 mL
Filtres à seringue stérilesTerumo Europe0.22 µ ; m
ScalpelSwann-Morton0510
Brosse
Lames de microscopeRS France76 mm x 26 mm x 1,1 mm
Lamelles en verreRS France22 mm x 22 mm Kimtech
Sciences Essuie-glacesKimberly-Clark Professional5511
Microscopebinoculaire
Dilution rasoirPlaques de culture de culture Millicell culture cellulaire

Références

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