Préparation et Immunostaining des cérébelleux Myélinisantes Organotypiques

Résumé

Nous présentons ici une méthode pour préparer organotypique cultures tranche de cervelet de souris et de la gaine de myéline, la coloration par immunohistochimie approprié pour enquêter sur les mécanismes de la myélinisation et remyélinisation du système nerveux central.

Résumé

Dans le système nerveux, la myéline est une structure complexe membranaire générée par myélinisantes glial cells, les axones des cellules et facilite la conduction électrique rapide. Altération de la myéline s’est avérée de se produire dans diverses maladies neurologiques, où elle est associée à des déficits fonctionnels. Ici, nous fournir une description détaillée d’un ex vivo modèle composé de tranches de cervelet organotypique souris, qui peuvent être maintenues en culture pour plusieurs semaines et encore être étiquetés de manière à visualiser la myéline.

Introduction

Les neurones sont des cellules hautement polarisées, qui forment un compartiment somato-dendritique qui reçoit les entrées de son environnement et un axone qui assure la génération et la propagation des impulsions électriques à d’autres cellules. Propagation rapide et en temps opportun de l’information est essentielle au bon fonctionnement du système nerveux. Chez les vertébrés, elle est facilitée par la myélinisation, qui permet d’augmenter la vitesse de conduction axonale¹. La myéline est une structure spécialisée, formée par des couches compactées de membrane de plasma généré par les cellules gliales myélinisantes, à savoir les oligodendrocy....

Protocole

Tous les travaux impliquant des animaux respecté les politiques institutionnelles et aux lignes directrices établies par l’UPMC, INSERM et Français et communautaire européen, la Directive 86/609/CEE.

1. préparation du milieu de Culture et de la Culture insère (Hands-on temps ≈ 10 à 15 min)

Remarque : Effectuez cette étape dans une hotte à flux culture en conditions stériles

1. Préparation de 40 mL de milieu de culture, qui se compose de 50 % afro-Caribéens, équilibré de Solution de 25 % Hank saline (1 x), 25 % inactivés par la chaleur cheval sérum, additionné de dérivé de glutamine 2 mM, 1....

Résultats

Exemples de myéline représentant immunostainings en tranches de cervelet organotypique provenant de P9-P10 C57black6 sauvage (WT) (Figure 2 a), ainsi que les souris transgéniques PLP-GFP (Figure 2 b), ainsi que la coloration des cellules de Purkinje. Myéliniser de la substance blanche cérébelleuses tranches pistes région des tranches vers la périphérie de la folia et myélinisation des cellules de Purkinje est principalement obten.......

Discussion

Ici, nous détaillons un protocole pour générer un ex vivo modèle correspondant aux souris cérébelleux organotypiques, adapté de précédemment méthodes publiées^15,16,19 et la myéline ultérieure immunomarquage de ces préparations. Cette stratégie offre la possibilité de visualiser les composants de la myéline avec une haute résolution dans les États sains et pathologiques.

Organotypiques cervelet de sour.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BME moyen	ThermoFisher Scientific	41010026
Hank' s Solution saline équilibrée (10x HBSS)	ThermoFisher Scientific	14180046
GlutaMAX (100x)	ThermoFisher Scientific	35050038
Sérum de cheval inactivé par la chaleur	ThermoFisher Scientific	26050088
Pénicilline&ndash ; Streptomycine (10.000 UI/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
Gey' s Solution saline équilibrée	Sigma Aldrich	G9779-500ML
Solution de D-glucose (45 %)	Sigma Aldrich	G8769-100ML
Lysophosphatidylcholine (LPC)	Sigma Aldrich	L4129-100MG
Paraformaldéhyde (PFA)	Microscopie électronique Sciences	15714
Éthanol absolu (100 % éthanol)	VWR Chemicals	20821.330	Refroidi à -20° ; C
Triton® ; X-100	Sigma Aldrich	X100-500ML
10 % Sérum de chèvre normal (NGS)	ThermoFisher Scientific	500622
Phosphate Buffer Solution	EuroMEDEX	ET330-A	pH 7.4
Anticorps anti-GFP (polyclonal, poulet)	Merck Millipore	06-896	Dilution 1/300
Anticorps anti-protéine basique de myéline (MBP) (polyclonal, poulet)	Merck Millipore	AB9348	Dilution 1/150
Anticorps anti-myéline basique (MBP) (monoclonal, souris IgG2b)	Merck Millipore	NE1019	Dilution 1/200
Anticorps anti-PLP (rat, hybride)	Don du Dr K. Ikenaka ; Okasaki, Japon		Dilution 1/5 à 1/10
Canal antisodique, anticorps Pan (monoclonal, IgG1 de souris, clone K58/35)	Sigma Aldrich	S8809	Dilution 1/150
Anticorps anti-Caspr (polyclonal, lapin)	Abcam	ab34151	Dilution 1/500
Anticorps secondaires de chèvre conjugués à Alexa Fluor 488, 594, 647 ou 405	ThermoFisher Scientific		1/500
Fluoromount	SouthernBiotech	0100-20
Hachoir à tissus	McIlwain
Lames de
Grands ciseaux	F.S.T	14101-14
Petits ciseaux	F.S.T	91500-09
Pince fine-droite	F.S.T	91150-20
Pince courbée-fine	F.S.T	11297-00
Boîtes de culture cellulaire (60 mm et 100 mm)	TPP
4, 6 puits	Inserts
(0,4 µ ; m, 30 mm de diamètre)	Merck Millipore	PICM0RG50
Incubateur de			37° ; C, 5 % CO2
Pointes de pipette à extrémité fine	Dutscher	134000CL
Pointes de pipette à alésage large	ThermoFisher Scientific	2079G
Seringue stérile	Terumo Europe		20 ou 50 mL
Filtres à seringue stériles	Terumo Europe		0.22 µ ; m
Scalpel	Swann-Morton	0510
Brosse
Lames de microscope	RS France		76 mm x 26 mm x 1,1 mm
Lamelles en verre	RS France		22 mm x 22 mm Kimtech
Sciences Essuie-glaces	Kimberly-Clark Professional	5511
Microscope			binoculaire

Dilution rasoirPlaques de culture de culture Millicell culture cellulaire