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Article de méthode

Préparation des granules de Gushukang (GSK) pour les expériences in vivo et in vitro

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DOI :

10.3791/59171

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9 mai 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education, 4School of Rehabilitation Science, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

Dans cet article

Résumé

Cet article fournit un protocole détaillé pour la préparation d'une solution de travail de granules de Gushukang pour les études animales et de granule GSK contenant du sérum pour les expériences in vitro. Ce protocole peut être appliqué aux études pharmacologiques des plantes médicinales ainsi qu'aux prescriptions d'expériences in vivo et in vitro.

Résumé

La phytothérapie traditionnelle chinoise joue un rôle comme méthode alternative dans le traitement de nombreuses maladies, telles que l'ostéoporose postménopausique (POP). Les granules de Gushukang (GSK), une prescription commercialisée en Chine, ont des effets protecteurs osseux dans le traitement du POP. Avant l'administration au corps, une procédure standard de préparation est généralement nécessaire, qui vise à promouvoir la libération des constituants actifs à partir d'herbes premières et d'améliorer les effets pharmacologiques ainsi que les résultats thérapeutiques. Cette étude propose un protocole détaillé pour l'utilisation des granules GSK in vivo et in vitro essais expérimentaux. Les auteurs fournissent d'abord un protocole détaillé pour calculer les doses appropriées pour l'animal des granules pour l'enquête in vivo : pesée, dissolution, stockage, et administration. Deuxièmement, cet article décrit des protocoles pour le balayage de micro-CT et la mesure des paramètres d'os. La préparation des échantillons, les protocoles d'exécution de la machine à micro-CT et la quantification des paramètres osseux ont été évalués. Troisièmement, des granules GSK contenant du sérum sont préparés, et le sérum contenant des médicaments est extrait pour l'ostéoclastogenèse in vitro et l'ostéoblastogenesis. Les granules de GSK ont été administrés intragastriquement deux fois par jour aux rats pendant trois jours consécutifs. Le sang a ensuite été recueilli, centrifuge, inactivé et filtré. Enfin, le sérum a été dilué et utilisé pour effectuer l'ostéoclastogenèse et l'ostéoblastogenesis. Le protocole décrit ici peut être considéré comme une référence pour les études pharmacologiques des médicaments d'ordonnance à base de plantes, tels que les granules.

Introduction

La médecine traditionnelle chinoise (MTC) est l'une des approches complémentaires et alternatives importantes pour traiter l'ostéoporose1,2. La décoction d'eau est la forme de base et la plus couramment utilisée de la formule3. Cependant, des inconvénients existent également : mauvais goût, inconvénients pour le transport, courte durée de conservation et protocoles incohérents, limitant les utilisations ainsi que les effets curatifs. Pour éviter les inconvénients ci-dessus ainsi que de poursuivre de meilleurs effets, granules ont été développés et ont été largement utilisés4. Bien que de nombreuses études aient exploré les mécanismes pharmacologiques d'un ou de plusieurs composants efficaces des granules5,6,7, les mécanismes exacts et les processus pharmacologiques sous-jacents sont encore difficile à identifier. C'est parce que trop de composants efficaces d'un granule peuvent simultanément exercer des effets similaires ou opposés4. Par conséquent, le développement d'un protocole standard pour préparer les granules avant de livrer à l'organisme aurait non seulement un grand impact sur les résultats thérapeutiques, mais est également nécessaire pour les essais in vivo et in vitro.

En outre, les effets curatifs des granules dans la clinique sont difficiles à confirmer et à identifier exactement à l'aide d'études in vitro ou ex vivo, ce qui crée un défi parce que les mécanismes pharmacologiques sont trop complexes. Pour résoudre ce problème, la préparation du sérum contenant des médicaments a été proposée pour la première fois par Tashino dans les années 19808. Dès lors, de nombreux chercheurs ont appliqué le sérum contenant des médicaments à la phytothérapie, y compris les granules9,10,11. Actuellement, le choix du sérum contenant des médicaments pour les enquêtes in vitro est considéré comme une stratégie qui imite étroitement les conditions physiologiques.

Les granules de Gushukang (GSK) ont été développés pour traiter l'ostéoporose postménopausique (POP) basée sur la pratique clinique à la lumière de la théorie de TCM. Les granules de GSK empêchent la perte d'os dans les souris ovariectomized (OVX) in vivo, inhibent la résorption osteoclastic d'os, et stimulent la formation osteoblastic d'os4. Par conséquent, Li et coll.12 ont constaté que les granules de GSK ont des effets protecteurs osseux chez les souris OVX en améliorant les activités du récepteur du calcium pour stimuler la formation osseuse. Pour confirmer les effets os-protecteurs aussi bien que les effets pharmacologiques des granules de GSK, les auteurs fournissent ici une procédure détaillée pour la préparation des solutions de travail et du sérum de drogue (GSK granule). En outre, cet article décrit l'application des granules de GSK dans un modèle osteoporotic de souris OVX-induit et le sérum de granule-contenant de GSK pour l'osteoclastogenesis/osteoblastogenesis in vitro.

Les granules DE GSK sont composés de plusieurs herbes13,14 et peuvent être complètement dissous dans saline facilement. Par conséquent, saline sert de véhicule. Les souris opérées par Sham (Sham) et LES souris OVX ont été administrées le même volume de saline que les souris administrées par les granulés. Les doses équivalentes de granules GSK pour la souris ont été calculées sur la base de l'équation Meeh-Rubner15. Cette équation a non seulement l'avantage d'obtenir des doses sûres, mais garantit également des effets pharmacologiques15. Les trois doses de granules GSK ont été générées comme suit: (1) GSKL: OVX - granules GSK à faible dose, 2 g/kg/jour. (2) GSKM : OVX et granules GSK à dose moyenne, 4 g/kg/jour. (3) GSKH : OVX et granules GSK à forte dose, 8 g/kg/jour. Des souris dans les groupes gskL, GSKM et GSKH ont été administrées intragastriquement des granules de GSK. Le carbonate de calcium (600 mg/comprimé) avec vitamine D3 (125 unité/comprimé international), par exemple, dans un produit mature et commercialisé (p. ex., Caltrate [CAL]) pour le traitement et la prévention de l'ostéoporose, a été utilisé comme un contrôle positif.

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Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées avec l'approbation du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de Shanghai de TCM (SZY201604005).

1. Préparation et administration de la solution de travail GSK

  1. Calculez les doses équivalentes de granules GSK pour la souris.
    1. Calculer la surface du corps en fonction de l'équation Meeh-Rubner15: surface du corps k x (poids corporel2/3)/1000, où les valeurs K sont de 10,6 pour l'homme et de 9,1 pour la souris. En supposant un poids corporel humain de 70 kg, puis la surface du corps humain (m2) 10,6 x (702/3)/1000 - 1,8 m2. En supposant un poids corporel de la souris de 20 g (0,02 kg; p. ex., 1 mois, femelle, C57/BL6), puis surface du corps de la souris (m2) 9,1 x (0,022/3)/1000 à 0,0067 m2.
    2. En fonction de la surface corporelle calculée, calculez le rapport de transformation du corps pour l'homme et la souris. Humain : 70 kg/1,8 m2 et 39. Souris: 0.02 kg/0.0067 m2 '3. Granule GSK 20 g/70 kg x 39/3 et 3,72 g/kg 4 g/kg.
    3. Sur la base d'un poids corporel de 20 g par souris, calculez le dosage équivalent pour la souris : 4 g/kg x 0,02 kg et 0,08 g.
    4. Calculer trois doses équivalentes de granules GSK à partir de 20 souris par groupe et une intervention d'une durée de 3 mois (90 jours) : (1) GSKL (OVX - granules GSK à faible dose [2 g/kg/jour] : 0,04 g souris/jour x 20 souris x 90 jours , 72 g. (2) GSKM (OVX - granules GSK à dose moyenne [4 g/kg/ jour]): 0,08 g souris/jour x 20 souris x 90 jours , 144 g. (3) GSKH (OVX - granules GSK à forte dose [8 g/kg/jour]) : 0,12 g de souris/jour x 20 souris x 90 jours et 216 g.
      REMARQUE : Préparer 20 % de granules GSK supplémentaires dans la pratique pour compenser la perte.
  2. Calculer le volume de granule GSK par souris en fonction du poids corporel15: par exemple, volume (V) 0,24 mL/souris/jour.
    REMARQUE : Le volume pour l'administration intragastrique pour la souris est 0.12 mL/10 g.
  3. Peser 10 jours de trois doses de granules GSK. Pesez 8 g, 16 g et 24 g de granules GSK et servez respectivement de GSKL, GSKM et GSKH.
  4. Calculez la dose équivalente de carbonate de calcium avec la vitamine D3 (CAL) pour la souris en fonction de l'équation Meeh-Rubner15 comme dans les étapes 1.1.1 et 1.1.2: dosage CAL 2 comprimés/70 kg x 39/3 - 0,372 comprimé/kg 0,4 comprimé/kg.
  5. Sur la base d'un poids corporel de 20 g par souris (p. ex., 1 mois, femelle, C57/BL6), calculez la dose équivalente de CAL pour la souris : 0,4 comprimé/kg x 0,02 kg et 0,008 comprimé. Ensuite, calculez la dose équivalente de CAL à partir de 20 souris par groupe et une intervention d'une durée de 3 mois (90 jours): 0,008 comprimé x 20 x 90 x 14,4 comprimés. Peser 10 jours de CAL (1,6 comprimé).
  6. dissolution
    1. Placer 8 g de granules DE GSK dans un tube de 50 ml. Ajouter 48 ml de salin et secouer le tube pour dissoudre complètement.
      REMARQUE : La norme pour la dissolution complète est l'absence de sédiments. La dissolution complète peut être confirmée si une aiguille de gavage peut dessiner la solution de travail et l'expulser en douceur.
    2. Répétez l'étape 1.5.1 avec 16 g et 24 g de granules GSK.
    3. Placer 1,6 comprimé (10 jours) de CAL dans un tube de 50 ml. Ajouter 48 ml de salin et secouer le tube pour dissoudre complètement.
      REMARQUE : Les solutions de travail peuvent être stockées à -4 oC et préparées tous les 10 jours.
  7. Administration intragastrique
    1. Saisissez le dos de la souris (1 mois, femelle, C57/BL6) avec la souris tournée vers l'avant et assurez-vous qu'elle reste fermement dans cette position. Gardez la souris calme pendant 2 à 3 minutes avant l'administration.
      REMARQUE : Assurez-vous que le chercheur peut voir clairement l'avant de la souris. Portez des gants pour prévenir les morsures de souris, en particulier pour les nouveaux chercheurs.
    2. Placer l'aiguille de gavage (taille : #12, 40 mm) dans la solution de travail des granules GSK et dessiner 0,24 ml de la solution de travail.
    3. Mettre l'aiguille de gavage dans la souris par un côté de sa bouche jusqu'à ce que l'aiguille de gavage atteigne l'estomac.
      REMARQUE : Pour confirmer que l'aiguille du gavage a atteint l'estomac : (1) L'aiguille du gavage rencontre le sentiment de résistance. Pendant ce temps, la souris montre l'action de la déglutition avant que l'aiguille de gavage passe le rétrécissement physique de l'œsophage. (2) Injecter environ 0,5 ml de la solution de travail dans la souris et attendre 1 min. S'il n'y a pas de solution sortant de la souris, cela signifie que l'aiguille de gavage a atteint l'estomac.
    4. Injecter la solution de travail du granule GSK (0,24 ml/souris) dans l'estomac, puis extraire l'aiguille du gavage. Remettre la souris dans sa cage.
    5. Répétez l'étape 1.6.4 avec la solution CAL et injectez 0,24 mL de solution CAL par souris.
      REMARQUE : Le volume de la solution CAL est calculé comme à l'étape 1.2.

2. Numérisation micro-CT

  1. T (t) ibia ibia récolte et préparation
    1. Anesthésier la souris par voie intrapéritone avec 300 ml/100 g de 80 mg/kg de kétamine le lendemain de l'intervention de 90 jours. Utilisez une pincée d'aiguille des orteils pour confirmer si la souris est complètement anesthésié. Aucune réponse n'indique une anesthésie réussie. Puis tuer la souris avec la dislocation cervicale.
    2. Fixer la souris avec les bras et les jambes sur la mousse avec des bords.
    3. Couper la peau avec des ciseaux (taille: 8,5 cm) et des pinces (taille: 10 cm) des jambes de la proximale à l'extrémité distale, puis récolter les tibias.
    4. Immédiatement mettre les tibias dans 70% d'alcool éthylique et laver pendant 3 fois.
  2. Enveloppez le tibia gauche de la souris avec de la mousse éponge et mettez-le dans un tube d'échantillon (35 mm de diamètre, 140 mm de longueur).
    REMARQUE : Le long axe du spécimen doit être accompagné de celui du tube de l'échantillon. Assurez-vous que l'extrémité proximale des points de tibia vers le haut.
  3. Exécution de la machine de balayage micro-CT 80
    1. Démarrer la machine à scanner micro-CT 80 à température ambiante.
    2. Définiz le tube d'échantillon en micro-CT 80 et commencez la numérisation transversale avec les paramètres de numérisation suivants : taille du pixel 15,6 m, tension du tube 55 kV, courant tube 72 A, temps d'intégration 200 ms, résolution spatiale 15,6 m, résolution de pixels 15,6 m et matrice d'image 2048 x 2048.
      REMARQUE : L'os annuleux se distingue de l'os cortical par pré-scan. La zone de balayage du tibia est définie comme la zone d'os annulante de 5 mm au-dessous du plateau tibial à l'extrémité distale.
  4. Quantification du paramètre osseux
    1. Après avoir terminé la numérisation transversale, obtenir les images des tibias gauches.
    2. Fixer le seuil de densité à 245-1000. Utilisez le programme d'évaluation micro-CT V6.6 pour mesurer les paramètres osseux suivants : densités minérales osseuses (DB), volume osseux supérieur au volume total (BV/TV), nombre d'os trabecular (Tb.N), épaisseur d'os trabecular (Tb.Th), ainsi que séparation trabeculaire d'os ( Tb.Sp).

3. Préparation du sérum sanguin pour les expériences in vitro

  1. calcul
    1. Sur la base d'un poids corporel de rat de 0,2 kg (1 mois, femelle, Sprague-Dawley), calculer la dose de granule GSK: dosage humain / jour x poids corporel de l'homme x K / poids corporel du rat - 20 g / 70 kg/ jour x 70 kg x K (K 0,018) / 0,2 kg - 2 g/kg/ jour.
      REMARQUE : K est le coefficient de transformation pharmacologique entre l'homme et la souris15 (K - 0,018).
    2. Répétez l'étape 3.1.1 et calculez les doses suivantes.
      1. Calculer la dose de GSKL : 10 g/70 kg/jour x 70 kg x K/0,2 kg, 1 g/kg/jour.
      2. Calculer la dose de GSKM : 20 g/70 kg/jour x 70 kg x K/0,2 kg, soit 2 g/kg/jour.
      3. Calculer la dose de GSKL : 40 g/70 kg/jour x 70 kg x K/0,2 kg 4 g/kg/jour.
      4. Calculer la dose de CAL: 2 comprimés /70 kg/jour x 70 kg x K/0,2 kg - 0,2 comprimé/kg/jour.
    3. Calculer la dose totale de granule GSK et CAL.
      1. Calculer la dose totale pour GSKL: 1 g/kg/jour x 0,2 kg x 6 rats x 3 jours 3,6 g.
      2. Calculer la dose totale pour GSKM: 2 g/kg/jour x 0,2 kg x 6 rats x 3 jours , 7,2 g.
      3. Calculer la dose totale pour GSKH: 4 g/kg/jour x 0,2 kg x 6 rats x 3 jours 14,4 g.
      4. Calculer la dose de CAL 0,2 comprimé/kg/jour x 0,2 kg x 6 rats x 3 jours et 0,72 comprimé.
        REMARQUE : Un total de 10 ml de sérum contenant du granule GSK est nécessaire pour préparer un milieu de culture de 100 ml (20 % de sérum contenant du granule GSK). On s'attend à ce que chaque rat (6 rats/groupe) fournisse 1,5 à 2 ml de sérum contenant du granule de GSK après centrifugation.
    4. Calculer le volume des granules GSK appliqués par rat en fonction du poids corporel15: par exemple, volume (V) 2 mL/rat/jour.
      REMARQUE : Le volume pour l'administration intragastrique pour le rat est 0.1 mL/10 g.
  2. Peser 3 jours de trois doses de granules GSK. Pesez 3,6 g, 7,2 g et 14,4 g de granules GSK et servez respectivement GSKL, GSKM et GSKH. Peser 0,72 comprimé pour le groupe CAL.
  3. Placer 7,2 g de granules GSK dans un tube de 50 ml. Ajouter 36 ml de salin et secouer le tube pour dissoudre complètement. Répétez cette opération avec 3,6 g et 14,4 g de granules GSK.
  4. Répétez la section 1.6 pour l'administration intragastrique avec 2 mL de solution de travail GSK.
    REMARQUE : Administrer le même volume de salin (2 ml par rat) pour préparer le sérum et sert de groupe de contrôle vide pour les essais in vitro.
  5. Préparation du sérum contenant GSK
    1. Anesthésier les rats de 300 ml/100 g de 80 mg/kg de kétamine 1 h après la dernière administration de granules GSK. Utilisez une pincée d'aiguille des orteils pour confirmer si le rat est complètement anesthésié. Aucune réponse n'indique une anesthésie réussie.
    2. Exposer l'abdomen au fond du thorax des rats à l'aide de ciseaux d'opération droite après avoir incisé la peau et le péritoine.
      REMARQUE : L'instrument chirurgical doit être stérilisé à des températures élevées et à haute pression avant d'être utilisé. Le secteur chirurgical doit être stérilisé avec l'éthanol de 70% pendant la collecte de sang.
    3. Enlever le tissu conjonctif de l'aorte abdominale avec du papier de soie pour exposer clairement le vaisseau.
    4. Prélever le sang de l'aorte abdominale à l'aide d'une seringue de 10 ml et 22 G. Retirez ensuite l'aiguille et transférez le sang dans un tube stérile de 15 ml. Habituellement, 6 à 8 ml de sang peuvent être obtenus à partir d'un rat.
      REMARQUE : Chaque rat doit continuer à vivre lorsqu'il s'appuie sur du sang. Un indicateur est que l'aorte abdominale palpite quand le rat est vivant. Le rat est mort après la prise de sang.
    5. Maintenez le tube à la verticale à température ambiante pendant 30 à 60 minutes jusqu'à ce que le sang soit coagulé dans le tube. Ensuite, la centrifugeuse du tube à 500 à 600 x g pendant 20 min. Transférer tout le supernatant (sérum) d'un groupe (6 rats) à un tube stérile de 50 ml et secouer pour mélanger.
    6. Inactiver le sérum en couvant dans un bain d'eau de 56 oC pendant 30 min. Filtrer le sérum à l'aide d'un filtre à seringues hydrophiles en polyéthersulfone de taille pore de 0,22 m. Conserver à -80 oC pour une utilisation à long terme (moins d'un an).
      REMARQUE : Le sérum filtré peut être employé pour l'ostéoclastogenesis in vitro et l'ostéoblastogenesis.
  6. demande
    1. Ostéoclastogenèse in vitro
      1. Diluer les trois doses du sérum CONTENANT GSK (GSKL, GSKM, GSKH) au rapport de 1:4 avec le milieu minimum d'Aigle (-MEM) contenant de la L-glutamine, des ribonucléosides et des deoxyribonucleosides.
        REMARQUE : Assurez-vous que la concentration finale de sérum GSK-contenant pour l'ostéoclastogenesis in vitro et l'ostéoblastogenesis est 20%.
      2. Ajouter le sérum dilué contenant GSK (200 l/puits) de l'étape 3.6.1.1 aux macrophages de moelle osseuse (BMM) de 4 à 6 souris de 4 à 6 semaines C57BL/6 pour l'ostéoclastogénèse et stimuler les BMM avec le facteur de stimulation de la colonie macrophage (M-CSF, 10 ng/mL) et l'activateur des récepteurs pour le facteur nucléaire-B ligand (RANKL, 100 ng/mL) tel que décrit précédemment2.
    2. Ostéoblastogenesis in vitro
      1. Répétez l'étape 3.6.1.1.
      2. Ajouter le sérum dilué contenant GSK (2 mL/puits) aux cellules souches mésenchymales osseuses (BMSC) des souris C57BL/6 de 4 à 6 semaines pour produire de l'ostéoblaste tel que décrit précédemment16.

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Résultats

Les résultats de la micro-ToCont ont indiqué que les souris OVX présentaient une perte osseuse importante par rapport aux souris témoins salins (figure 1A). L'intervention (90 jours) des granulés GSK a considérablement augmenté la BMD, en particulier dans le groupe GSKM (figure 1B). Les paramètres de structure osseuse, tels que BMD, BV/TV, Tb.N, et Tb.Th, ont été quantifiés. Les traitements de granule de GSK ont mené à l'augmenta...

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Discussion

Granules d'agents TCM sont devenus l'un des choix communs pour les formulations ou les prescriptions. Les granules de GSK sont composés de plusieurs plantes médicinales basées sur des expériences cliniques ou la théorie de la MTC, et ils exercent de meilleurs effets curatifs avec moins d'effets secondaires4. Par rapport à la décoction de l'eau, les granules ont ces avantages : bon goût, commodité de livraison, stockage à long terme, protocole standard et effets curatifs cohérents, ainsi qu'une pro...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (81804116, 81673991, 81770107, 81603643, et 81330085), le programme pour l'équipe innovante, le ministère des Sciences et de la Technologie de la Chine (2015RA4002 à WYJ), le programme pour Équipe innovante, Ministère de l'éducation de la Chine (IRT1270 à WYJ), Shanghai TCM Medical Center of Chronic Disease (2017ZZ01010 à WYJ), Three Years Action to Accelerate the Development of Traditional Chinese Medicine Plan (ZY(2018-2020)-CCCX-3003 to WYJ), et projets nationaux clés de développement de la recherche (2018YFC1704302).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
&alpha ;-MEMHyclone
laboratories SH30265.018Pour la culture cellulaire
&bêta ;-GlycérophosphateSigmaG5422Ostéoblastogenèse
Caltrate (CAL)WyethL96625Intervention animale
C57BL/6 sourisSLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		Préparation Ainimalaléatoire
DexamethsomeSigmaD4902
Diméthyl sulfoxydeSigmaD2438Cellule congelée
Ethylène Diamine Acide tétraacétique (EDTA)Sangon Biotech60-00-4Échantillons traités
Sérum fœtal bovinGibcoFL-24562Pour la culture cellulaire
Gushukang granuleskangcheng entrepriseen chineZ20003255Prescription à base de plantes
Microscope optiqueOlympus BX50Olympus BX50Images pour l’ostéoclastogenèse
Acide L-ascorbique 2-phosphate sequinagneium slat hyclrateSigmaA8960-5GOstéoblastogenèse
MicroscopeLeicaDMI300BOsteocast et ostéoblaste imagine
M-CSFPeprotechAF-300-25-10Ostéoclastogenèse
&Mu ; icro-CTScanco
Medical AG		&mu ; Radiographie CT80 MicrotomographeOs Analyse structurelle
RANKLPeprotech11682-HNCHFOstéoclastogenèse
Sprague DawleySLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		Prélèvement aléatoirede sérum sanguin
Kit de phosphate acide résistant au tartrate (TRAP)Sigma-Aldrich387A-1KTColoration TRAP

Références

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