Isoler la maligne et cellules B Non-Malignant de lck:eGFP poisson-zèbre

Résumé

Poisson zèbre transgéniques lck:eGFP express GFP fortement dans les lymphocytes T et ont été utilisés pour étudier le développement des lymphocytes T et la leucémie aiguë lymphoblastique. Cette ligne permet aux cellules d’étude B, qui expriment lck aux niveaux inférieurs. Ce protocole décrit la purification de cellules de B malignes et bénignes du poisson-zèbre de lck:eGFP .

Résumé

Poisson zèbre (Danio rerio) sont un puissant modèle pour étudier le développement des lymphocytes. Comme les mammifères, d. rerio possèdent un système immunitaire adaptatif qui inclut des lymphocytes B et T. Études de poisson-zèbre lymphopoïèse sont difficiles parce que les anticorps reconnaissant d. rerio marqueurs de surface cellulaire ne sont généralement pas disponibles, ce qui complique l’isolement et la caractérisation de populations de lymphocytes différents, y compris la lignée B cellules. Des lignées transgéniques avec expression fluorophore lignée spécifiques sont souvent utilisées pour contourner ce problème. La ligne transgéniques lck:eGFP a été utilisée pour étudier le développement des lymphocytes T d. rerio et a également été utilisée pour le développement des lymphocytes T modèle et de la leucémie lymphoblastique aiguë (lla-T). Bien que les poissons de lck:eGFP ont été largement utilisées pour analyser la lignée T, ils n'ont pas servi à étudier des cellules B. Récemment, nous avons découvert que beaucoup de poisson-zèbre B cellules exprime également lck, quoiqu’à des niveaux inférieurs. En conséquence, les cellules de lck:eGFP B expriment même faibles niveaux de GFP. Fondé sur cette conclusion, nous avons développé un protocole pour purifier les cellules de la lignée B de lck:eGFP poisson-zèbre, dont nous présentons ici. Notre méthode explique comment utiliser un trieur de cellules fluorescentes-activé (FACS) pour purifier les cellules de B de lck:eGFP poisson ou les lignes associées, telles que double-transgéniques rag2:hMYC; LCK:eGFP poissons. Dans ces lignes, cellules B, cellules de B particulièrement immatures, GFP expresse aux niveaux bas mais détectable, leur permettant d’être distingué de lymphocytes T, qui expriment la GFP hautement. B cellules peuvent être isolées de la moelle osseuse, thymus, rate, sang ou d’autres tissus. Ce protocole prévoit une nouvelle méthode pour purifier les cellules B d. rerio , permettant des études axées sur des sujets comme le développement des lymphocytes B et lymphocytes B malignes.

Introduction

Poisson zèbre offrent des attributs puissants, tels que la manipulation génétique, forte fécondité, translucidité optique et un développement rapide qui facilitent l’étude du développement des vertébrés en utilisant des approches génétiques. Ces avantages, ainsi que les caractéristiques partagées de l’hématopoïèse téléostéens et chez les mammifères, font d. rerio idéal pour l’analyse in vivo de la lymphopoïèse et lymphocyte function, depuis leur première apparition chez les larves tout au long de l’âge adulte. Développement de sang chez le poisson zèbre s’appuie sur des processus génétiques bien conservées qui sont partagés avec les mammifères, et ceux-ci portent le système immunitaire adaptatif. En outre, les mécanismes moléculaires qui régissent le développement lymphoïde sont remarquablement conservées entre les mammifères et poissons zèbres¹.

Depuis 2 décennies, transgénique d. rerio lignes cette étiquette spécifique sang lignages et lignées mutantes déficientes dans ces lignées ont été créées par^2,3,4,5. L’une d'entre elles, la lignée transgénique lck:eGFP , utilise le promoteur zebrafish lymphocytaire protéine tyrosine kinase (lck) pour piloter la GFP expression⁶. Ce gène, qui est fortement exprimé par les précurseurs de la lignée T et les lymphocytes T matures, permet in vivo par FACS⁷de suivi du développement des lymphocytes de T thymiques et ex vivo purification de cellules de la lignée T. Auparavant, nous avons utilisé cette ligne dans un écran de mutagenèse ENU avance-génétique pour identifier des mutants de lignée germinale sujettes à T-ALL et d’étudier les phénomènes génétiques somatiquement acquis liés à lymphocytes T oncogenèse^8,9.

Récemment, notre laboratoire a prorogé l’utilité du poisson-zèbre de lck:eGFP . Double-transgéniques rag2:hMYC (MYC humain), lck:eGFP D. rerio qui sont connus pour développer lla- ¹⁰, nous avons découvert que lignée B se produisent également¹¹. Contrairement au T-ALL dans ce modèle, qui réagissent en couleurs vives en raison de la forte expression de la GFP, B-ALL sont faiblement fluorescentes en raison de faibles niveaux GFP, permettant aux poissons avec B-ALL à distinguer nettement de celles avec T-ALL par microscopie à fluorescence. Cette expression différentielle de la GFP permet aussi la séparation des cellules^lo B-ALL GFP de GFP^Salut FACS¹¹des cellules T-ALL. En outre, faible lck expression n’est pas unique à poisson zèbre B-ALL, comme humains B-tout aussi express faibles niveaux de LCK^11,12. De même, les cellules normales de lignée B de d. rerio, les souris et les humains expriment aussi des faibles niveaux de lck/Lck/LCK, avec des cellules B immatures ayant la plus haute expression^11,13. Sur une base par cellule, cellules de la lignée B en lignes de poisson-zèbre ou un dérivé lckeGFP expriment 1-10 % autant GFP comme les lymphocytes T. Ces GFP^lo cellules express caractéristique ARNm de lymphocytes B tels que pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighzet autres et peut être purifié de la moelle osseuse, thymus, la rate ou périphérique ¹¹de sang. Donc, les deux B-T-lignée et cellules peuvent être isolées du poisson-zèbre de lckeGFP et dans le cas de rag2hMYC, les lckeGFP animaux, les cellules B et T-ALL ainsi¹¹.

Ici, nous présentons notre protocole efficacement FACS-purifier non malignes cellules B de lck:eGFP poisson-zèbre et bénignes ou malignes des cellules de B de rag2hMYC; LCK:eGFP poissons, à l’aide de divers tissus de source. Ces cellules peuvent même être quantifiées par cytométrie en flux sans isolement de FACS, si vous le souhaitez. Découverte d’expression faible lck - et par conséquent, faible expression de la GFP-par B cellules ouvre de nouvelles portes de possibilités expérimentales de lckeGFP poisson-zèbre, tels que les études sur le développement de cellules in vivo B. Ainsi, cette lignée transgénique, pour la première fois en 2004, a nouvelle vie alors que nous cherchons à utiliser pour glaner des nouvelles perspectives relatives à l’immunité adaptative de poisson-zèbre.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le poisson-zèbre ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) à l’University of Oklahoma Health Sciences Center.

1. isoler Non-malignes B et les Lymphocytes T de transgéniques lck:eGFP poissons

1. Anesthésier les poissons à l’aide de 0,02 % de tricaïne (MS-222) dans l’eau du système de poissons.
2. Examiner les poissons de 2 à 6 mois pour thymi fluorescent, qui se trouvent dans l’aspect dorsomédian de la cavité branchiale de poissons zèbres et autres téléostéens¹⁴. Utiliser un microscope à épifluorescence (470/40 onde d’excitation et d’émission 525/50 filtre) pour détecter la GFP.
3. Préparer à l’avance 50 mL de stérilisée par filtration 1 x Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) contenant 1 % fœtale bovine sérique et 1 % la pénicilline-streptomycine (tri médias). Médias tri inutilisés peuvent être stockés à 4 ° C pendant 2 mois.
4. Euthanasier le poisson en le plaçant dans un bécher contenant 0,2 % Tricaïne pendant environ 5 min, suivie d’immersion de bain de glace. Confirmer la mort par la cessation du mouvement operculaire (gill).
5. Placer le poisson euthanasié dans une boîte de Pétri et disséquer les organes lymphoïdes d’intérêt, en utilisant le microscope à fluorescence à disséquer la GFP⁺ thymi¹⁴et paramètres de microscopie de champ lumineux de disséquer la moelle osseuse et la rate de rein¹⁵. Les résultats présentés ici ont été obtenus à l’aide de 3 mois poissons. Proportion de lymphocytes et de chiffres absolus varient selon l’âge et le génotype (voir pour plus de détails).
6. Placer chaque organe découpé dans un tube de 1,5 mL contenant 500 µL de froid tri médias.
7. Homogénéiser le tissu sur la glace à l’aide d’un homogénéisateur de micro-tube de pilon.
8. Passez tissu homogénéisé à travers un filtre de maille de 35 µm pour générer une suspension monocellulaire. Garder les cellules sur la glace jusqu'à l’analyse.

2. isoler les Lymphocytes malignes de Double-transgéniques rag2:hMYC ; lck:eGFP poisson-zèbre

1. Commençant à 2-4 mois, écran au microscope de rag2:hMYC; LCK:eGFP pêchez modèles anormaux de GFP.
   Remarque : les cellules B sont GFP^lo dans le fond de lck:eGFP , alors B-ALL nécessite pratique de reconnaître ; T-ALL est évidente, parce que les cellules T sont GFP^Salut. En conséquence, l' rag2:hMYC, lck:eGFP ligne double-transgéniques a deux phénotypes : brillamment fluorescent T-ALL, qui habituellement proviennent du thymus et s’étendent dans le corps et faiblement fluorescentes B-ALL.
   1. À l’aide d’un microscope à fluorescence, écran les poissons à l’aide des paramètres « faible exposition » (200 ms, 2,4 x gain) pour identifier les lumineux T-ALL (Figure 1 a) et « exposition élevée » (1,5 s, gain x 3,4) pour identifier dim B-ALL (Figure 1 a). Contrôles WT et poissons pré leucémique ont GFP localisée uniquement dans le thymus (Figure 1 b).
2. Une anesthésie et d’examiner le poisson comme décrit aux points 1.1, 1.2.
3. Classer le poisson basé sur la mesure de la fluorescence GFP, à l’aide d’un système simple de trois catégories :
   Remarque : Niveau 1 : Fluorescence apparaît comme une tumeur thymique avec seulement limitée diffusion locale.
   Niveau 2 : Fluorescence apparaît au-delà du thymus, impliquant < 50 % du corps.
   Niveau 3 : Fluorescence dépasse 50 % du corps.
4. Séparez les poissons avec l’ensemble de ceux sans cancer. Surveiller des leucémiques poissons (c.-à-d. sans tumeurs GFP⁺ ) une fois tous les mois pour le développement de tout nouveau. Par ~ 9 mois, tous les rag2:hMYC, lck:eGFP poissons développent T-ALL, B-ALL, ou les deux.
5. Pour tout T - ou B cellule d’isolement, sélectionnez niveau 3 poissons (tous impliquant > 50 % du corps), qui produisent plus de 2 x 10⁶ toutes les cellules et généralement beaucoup plus.
6. Euthanasier le poisson comme à l’étape 1.4.
   Remarque : Il existe deux méthodes pour obtenir toutes les cellules : corps entier homogénéisation et un lavage péritonéal technique¹⁶. Les méthodes diffèrent dans le nombre absolu de cellules recueillies pour le tri, et ainsi, les montants des FACS fois requis et coût (voir pour plus de détails).
7. Pour chaque méthode, tout d’abord placer le poisson euthanasié dans une boîte de Pétri et à l’aide d’une lame de rasoir, retirez la tête y compris la région du thymus. Cela peut être traitée séparément, si vous le souhaitez, ou utilisés pour la coloration histologique.
8. Méthode de lavage péritonéal
   1. À l’aide d’une pipette P1000, laver la cavité péritonéale de poisson avec 500 µL de froid tri médias, collecte des cellules et des médias dans un tube de 5 mL.
   2. Avec une pointe de nouvelle pipette, injecter un µL de 200-300 supplémentaires de médias tri froid dans la cavité du corps. Puis, à l’aide de l’embout de la pipette, appliquez une légère pression sur le corps de poisson pour extruder les cellules dans la cavité du corps. Recueillir ce média et ajouter dans le tube de 5 mL.
   3. Répétez l’étape 2.8.2 2 à 3 fois. Garder les cellules recueillies dans le tri des médias sur la glace.
   4. Filtrer la suspension cellulaire mais un maillage de 35 µm filtrer avant écoulement cytometry/FACS et garder les cellules sur la glace jusqu'à l’analyse.
9. Homogénéisation de l’ensemble du corps
   1. Après avoir enlevé la tête de poisson, placer le corps dans un tube de 1,5 mL contenant 200 µL de tri médias.
   2. Homogénéiser le corps à l’aide d’un homogénéisateur de micro-tube de pilon.
   3. Ajouter une supplémentaire 300 µL de froid tri médias. Filtrer la suspension cellulaire si un filtre de maille de 35 µm. Ajouter des éléments multimédias tri selon les besoins pour laver toutes les cellules à travers le filtre, jusqu'à ce que seulement les débris tissulaires reste sur le filtre. Garder les cellules sur la glace jusqu'à l’analyse.

3. par cytométrie en flux analyse des Lymphocytes B normaux ou maligne

1. Définissez la cytométrie et/ou des FACS paramètres selon le guide du fabricant.
2. Acquérir le nombre désiré d’événements pour caractériser au départ l’échantillon. Analyser 1 x 10⁴ à 5 x 10⁴ événements avant le tri à la détermination des portails spécifiques pour les étapes suivantes de tri.
   1. Déterminer les portes : définir des lymphocytes et l’ancêtre portes de cellule à l’aide de forward scatter (FSC) et les paramètres de diffusion (SSC) de côté, à l’exclusion des débris cellulaires (Figure 2 a- C)¹⁷. FSC et SSC correspondent à la taille/diamètre de la cellule et la granularité, respectivement.
      Remarque : GFP^–, GFP^loet GFP^Salut cellules diffèrent de 10 à 100-fois en fonction de leur intensité de fluorescence GFP, rendant la séparation de ces populations simples (Figures 2-5). Mort en direct-discrimination peut être évaluée à ce stade, à l’aide de propidium iode (PI) ou 7-aminoactinomycine D (7-Abdellah) viabilité coloration. Des expériences antérieures avec PI démontrent généralement > viabilité de 95 % des cellules GFP⁺ après FACS.
   2. Exclure les doublets de la cellule, selon les paramètres de la machine de FACS utilisé.
   3. Intérieur des portes lymphoïdes ou précurseur, déterminer le nombre et le pourcentage de cellules GFP⁺ .
3. Utiliser la phycoérythrine (PE) et l’intensité de la GFP, définir les porte pour GFP^– vs GFP^lo vs^Salut cellules GFP.
   Remarque : Cellules B pièce dim fluorescence GFP et cellules T montrent des GFP lumineux en lignes de lck:eGFP . Nombreux organes lymphoïdes ou des échantillons de tumeur contiennent les deux populations de GFP⁺ . Lignée B cellules/B-ALL sont GFP^lo et T-lignée lla/T-cellules sont GFP^Salut. Définir gates faire la distinction entre GFP^–, GFP^loet^hi cellules GFP et recueillir ces populations séparément (Figure 2 a-C, Figure 3 a-C, Figure 4 a et Figure 5 a).
4. Le tri de chaque population de cellules dans des tubes en polypropylène différents 15 mL contenant 2 mL de tri médias ou directement dans des tubes de différentes 1,5 mL contenant un tampon approprié pour des analyses plus poussées (p. ex., ARN, ADN ou extraction de protéine, allo-greffe, etc.).
5. Garder les cellules purifiées sur la glace avant d’approfondir les analyses.

Résultats

Nous avons utilisé la cytométrie de flux pour analyser et FACS pour isoler la GFP^lo et GFP^Salut cellules du thymus, moelle des reins et la rate de lck:eGFP zebrafish transgénique. Analyse des poissons âgés de 3 mois a révélé que le thymus contenaient principalement des lymphocytes GFP⁺ . Cellules GFP⁺ étaient largement confinées à la porte lymphoïde précédemment décrite par Traver Al.¹⁷. Deux populations distinct...

Discussion

Nous avons mis au point et fournir un protocole visant à isoler les cellules de B de lck:eGFP zebrafish transgénique, ajoutant cela à d’autres modèles de d. rerio lignée B étiquettes^3,4. Étonnamment, l’identification des GFP^lo B cellules dans cette rangée est passé inaperçue depuis sa description en 2004. Généralement, lck est considéré comme spécifique à la cellule T⁶, mais des études récentes trouven...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
35 et micro ; m mesh	Sefar Technologie de filtrage	7050-1220-000-13
5 mL Polystyrène tube à fond rond avec capuchon de filtre	Falcon Corning Brand	352235
50 mL Tube conique	VWR international	525-0448
AZ APO 100 Microscope fluorescent	Nikon
Cytoflex	Beckman Coulter
DS-Qi1MC camara	Nikon
Ethyl 3-aminobenzoate méthansésulfonate ; MS-222	Sigma	E-10521
FACSJazz	BD Biosciences
Sérum fœtal bovin	Thermo Fisher	10437028
FlowJo v10.2	FlowJo, LLC
em>lck :eGFP			Voir Langeneu et al., 2004
Logiciel NIS Elements	Nikon	Version 4.13
Péniciline-Streptomycine	Sigma	P4333
Homogénéisateurs de microtubes à pilons Microscopie	électronique Sciences	64788-20
Transfert de plastique Pippetes
rag2 :hMYC-ER			Voir Gutierrez et al., 2011
RPMI Media 1640 1x	Life Technologies	11835-030

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