Isoler la maligne et cellules B Non-Malignant de lck:eGFP poisson-zèbre

Résumé

Poisson zèbre transgéniques lck:eGFP express GFP fortement dans les lymphocytes T et ont été utilisés pour étudier le développement des lymphocytes T et la leucémie aiguë lymphoblastique. Cette ligne permet aux cellules d’étude B, qui expriment lck aux niveaux inférieurs. Ce protocole décrit la purification de cellules de B malignes et bénignes du poisson-zèbre de lck:eGFP .

Résumé

Poisson zèbre (Danio rerio) sont un puissant modèle pour étudier le développement des lymphocytes. Comme les mammifères, d. rerio possèdent un système immunitaire adaptatif qui inclut des lymphocytes B et T. Études de poisson-zèbre lymphopoïèse sont difficiles parce que les anticorps reconnaissant d. rerio marqueurs de surface cellulaire ne sont généralement pas disponibles, ce qui complique l’isolement et la caractérisation de populations de lymphocytes différents, y compris la lignée B cellules. Des lignées transgéniques avec expression fluorophore lignée spécifiques sont souvent utilisées pour contourner ce problème. La ligne transgéniques lck:eGFP a été utilisée pour étudier le développement des lymphocytes T d. rerio et a également été utilisée pour le développement des lymphocytes T modèle et de la leucémie lymphoblastique aiguë (lla-T). Bien que les poissons de lck:eGFP ont été largement utilisées pour analyser la lignée T, ils n'ont pas servi à étudier des cellules B. Récemment, nous avons découvert que beaucoup de poisson-zèbre B cellules exprime également lck, quoiqu’à des niveaux inférieurs. En conséquence, les cellules de lck:eGFP B expriment même faibles niveaux de GFP. Fondé sur cette conclusion, nous avons développé un protocole pour purifier les cellules de la lignée B de lck:eGFP poisson-zèbre, dont nous présentons ici. Notre méthode explique comment utiliser un trieur de cellules fluorescentes-activé (FACS) pour purifier les cellules de B de lck:eGFP poisson ou les lignes associées, telles que double-transgéniques rag2:hMYC; LCK:eGFP poissons. Dans ces lignes, cellules B, cellules de B particulièrement immatures, GFP expresse aux niveaux bas mais détectable, leur permettant d’être distingué de lymphocytes T, qui expriment la GFP hautement. B cellules peuvent être isolées de la moelle osseuse, thymus, rate, sang ou d’autres tissus. Ce protocole prévoit une nouvelle méthode pour purifier les cellules B d. rerio , permettant des études axées sur des sujets comme le développement des lymphocytes B et lymphocytes B malignes.

Introduction

Poisson zèbre offrent des attributs puissants, tels que la manipulation génétique, forte fécondité, translucidité optique et un développement rapide qui facilitent l’étude du développement des vertébrés en utilisant des approches génétiques. Ces avantages, ainsi que les caractéristiques partagées de l’hématopoïèse téléostéens et chez les mammifères, font d. rerio idéal pour l’analyse in vivo de la lymphopoïèse et lymphocyte function, depuis leur première apparition chez les larves tout au long de l’âge adulte. Développement de sang chez le poisson zèbre s’appuie sur des processus génétiques bien conservées qui sont partagés avec les mammifères, et ceux-ci por....

Protocole

Toutes les procédures impliquant le poisson-zèbre ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) à l’University of Oklahoma Health Sciences Center.

1. isoler Non-malignes B et les Lymphocytes T de transgéniques lck:eGFP poissons

1. Anesthésier les poissons à l’aide de 0,02 % de tricaïne (MS-222) dans l’eau du système de poissons.
2. Examiner les poissons de 2 à 6 mois pour thymi fluorescent, qui se trouvent dans l’aspect dorsomédian de la cavité branchiale de poissons zèbres et autres téléostéens¹⁴. Utiliser un microscope à épifluorescence (470....

Résultats

Nous avons utilisé la cytométrie de flux pour analyser et FACS pour isoler la GFP^lo et GFP^Salut cellules du thymus, moelle des reins et la rate de lck:eGFP zebrafish transgénique. Analyse des poissons âgés de 3 mois a révélé que le thymus contenaient principalement des lymphocytes GFP⁺ . Cellules GFP⁺ étaient largement confinées à la porte lymphoïde précédemment décrite par Traver Al.¹⁷. Deux populations distinct.......

Discussion

Nous avons mis au point et fournir un protocole visant à isoler les cellules de B de lck:eGFP zebrafish transgénique, ajoutant cela à d’autres modèles de d. rerio lignée B étiquettes^3,4. Étonnamment, l’identification des GFP^lo B cellules dans cette rangée est passé inaperçue depuis sa description en 2004. Généralement, lck est considéré comme spécifique à la cellule T⁶, mais des études récentes trouven.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
35 et micro ; m mesh	Sefar Technologie de filtrage	7050-1220-000-13
5 mL Polystyrène tube à fond rond avec capuchon de filtre	Falcon Corning Brand	352235
50 mL Tube conique	VWR international	525-0448
AZ APO 100 Microscope fluorescent	Nikon
Cytoflex	Beckman Coulter
DS-Qi1MC camara	Nikon
Ethyl 3-aminobenzoate méthansésulfonate ; MS-222	Sigma	E-10521
FACSJazz	BD Biosciences
Sérum fœtal bovin	Thermo Fisher	10437028
FlowJo v10.2	FlowJo, LLC
em>lck :eGFP			Voir Langeneu et al., 2004
Logiciel NIS Elements	Nikon	Version 4.13
Péniciline-Streptomycine	Sigma	P4333
Homogénéisateurs de microtubes à pilons Microscopie	électronique Sciences	64788-20
Transfert de plastique Pippetes
rag2 :hMYC-ER			Voir Gutierrez et al., 2011
RPMI Media 1640 1x	Life Technologies	11835-030

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