Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Un nouveau modèle de Enteroid épithéliales humaines d’entérocolite nécrosante

7.4K vues

⸱

DOI :

10.3791/59194

⸱

10 avril 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Northwestern University, 2Division of Pediatric Surgery, Ann & Robert H. Lurie Children's Hospital of Chicago

Dans cet article

Résumé

Enteroids sont en train de devenir un nouveau modèle dans l’étude des maladies humaines. Le protocole décrit comment simuler un modèle enteroid de l’entérocolite nécrosante humain utilisant lipopolysaccharide (LPS) traitement d’enteroids produit du tissu néonatal. Enteroids recueillis montrent des modifications inflammatoires semblables à ceux vus dans l’entérocolite nécrosante humaine.

Résumé

L’entérocolite nécrosante (NEC) est une maladie dévastatrice chez le nouveau-né. Il se caractérise par plusieurs altérations physiopathologiques de l’épithélium intestinal humain, conduisant à une augmentation de la perméabilité intestinale, avec facultés affaiblies de restitution et a augmenté la mort cellulaire. Bien qu’il existe de nombreux modèles animaux de l’entérocolite Nécrosante, réponse à des blessures et des interventions thérapeutiques peut-être être très variable entre les espèces. En outre, il est éthiquement difficile d’étudier la physiopathologie de la maladie ou de nouveaux agents thérapeutiques directement sur des sujets humains, en particulier les enfants. Par conséquent, il est hautement souhaitable d’élaborer un nouveau modèle de NEC à l’aide de tissus humains. Enteroids y a 3 dimensions organoïdes dérivées de cellules épithéliales intestinales. Elles sont idéales pour l’étude des interactions physiologiques complexes, la signalisation cellulaire et de la défense de l’hôte-pathogène. Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent un protocole cette enteroids humaine de cultures après isoler des cellules souches intestinales des patients devant subir une résection de l’intestin. Les cellules des cryptes sont cultivées dans des milieux contenant des facteurs de croissance favorisant la différenciation dans le natif de types différentes cellules de l’épithélium intestinal humain. Ces cellules sont cultivés dans un mélange synthétique, collagène de protéines qui servent comme un échafaudage, imitant la membrane basale extra-cellulaires. Ainsi, enteroids développer apicale-basolatérale polarité. L’administration concomitante du lipopolysaccharide (LPS) dans les médias provoque une réaction inflammatoire dans l’enteroids, menant à histologique, génétiques et altérations d’expression de protéines similaires à celles observées chez les humain NEC. Un modèle expérimental de NEC à l’aide de tissus humains peut fournir une plateforme plus précise pour les médicaments et traitements tests avant les essais chez l’homme, nous nous efforçons d’identifier un remède pour cette maladie.

Introduction

Enteroids humains sont un ex vivo système de culture 3 dimensions généré à partir de cellules souches isolées de cryptes intestinales des échantillons de tissu intestinal humain. Ce modèle révolutionnaire a été lancé par Hans Clevers et coll. en 2007 suite à la découverte de Lgr5 + des cellules souches dans les cryptes de l’intestin grêle dans la souris1. Leur travail a jeté les bases pour l’établissement d’un ex vivo la culture épithéliale intestinale de plusieurs types de cellules qui pourraient être repiquées sans modifications génétiques ou physiologiques importantes2. Depuis cette découverte, enteroids ont servi comme un nouveau modèle pour étudier la physiologie digestive normale et la physiopathologie des maladies intestinales telles que les maladies inflammatoires de l’intestin, interactions hôte-pathogène et la médecine régénérative,2.

L’utilisation d’enteroids comme un ex vivo de modèle pour l’étude de la physiopathologie intestinale présente plusieurs avantages sur les autres techniques. Pour les dernières décennies, les modèles animaux et lignées cellulaires dérivées de cancer intestinal immortalisées ont servi à étudier la physiologie intestinale3,4,5. Single-cell cultures ne représentent pas la diversité des types de cellules présents dans l’épithélium intestinal normal, manquant ainsi une cellule à la diaphonie et segment-spécificité dans l’expression de la protéine, la signalisation et la maladie induite par l’agent pathogène6. Enteroids les cellules souches se différencient en les principaux types de cellules épithéliales comme les entérocytes, cellules de Paneth, cellules caliciformes, cellules entéroendocrines et plus3. Ils présentent la polarité, assure les fonctions de transport épithélial et permettant un segment intestinal spécificité6. Étant donné qu’enteroids peut récapituler les multiples types de cellules de l’épithélium intestinal humain, ils sont capables de surmonter cette limitation reconnue des systèmes basés sur les cellules de cancer. Au fil du temps, dérivés de lignées cellulaires sont sous-cloné et d’évoluent pour exposer une plus grande diversité d’expression et la localisation protéine3. Au contraire, les enteroids peuvent être repiquées sans modifications génétiques ou physiologiques importantes2. Bien qu’il existent de nombreux modèles animaux pour NEC, réponse à des blessures et des interventions thérapeutiques peut-être être très variable entre les espèces. En raison de ces limitations, produits thérapeutiques dérivés de modèles animaux ne parviennent pas à 90 % du temps lorsqu’il est testé dans des essais humains en raison de différences dans la toxicité ou l’efficacité3. Enteroids servir de modèles précliniques prometteurs qui peuvent surmonter ces insuffisances, conduisant à une meilleure compréhension de la physiopathologie intestinale complexe et donc plus efficace et rentables des innovations thérapeutiques. Il y a aussi des éléments de preuve récente que l’âge des tissus qui ont un enteroid est généré reste biologiquement importants7. Il s’agit d’un détail particulièrement important pour notre modèle puisque les enteroids sont générés à partir du tissu néonatal, ainsi maintenir la pertinence physiologique aux patients avec NEC.

L’utilité d’enteroids comme modèles de maladies humaines continue à se développer, dans l’espoir de trouver des remèdes aux conditions graves et profondes. L’entérocolite nécrosante (NEC) est une maladie dévastatrice intestinale des nouveaux-nés que se caractérise par une nécrose intestinale et fréquemment conduit à la perforation de la paroi intestinale, septicémie et mort8. En raison de la physiopathologie complexe et multifactorielle de l’entérocolite Nécrosante, le mécanisme exact de la maladie n'a pas encore été complètement élucidé ; Cependant, une augmentation de la perméabilité intestinale a été clairement impliquée dans le processus de la maladie8. Étant donné que l’étude de NEC et agents thérapeutiques potentiels est éthiquement difficile sur des sujets humains, en particulier les enfants, il est hautement souhaitable d’utiliser un modèle d’enteroid biologiquement pertinente de NEC à l’aide de tissus humains néonatale. Jusqu’ici, les enteroids ont un rôle limité dans l’étude de l’entérocolite Nécrosante. Ce protocole décrit l’utilisation d’enteroids provenant d’échantillons de tissu intestinal humain comme un roman ex vivo de modèle pour l’étude de l’entérocolite nécrosante.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Approbation du Conseil d’examen de l’établissement a été obtenue (CISR #2013-15152) pour la collecte d’échantillons de tissus de patients devant subir une résection de l’intestin à Ann et Robert H. Lurie Children Hospital de Chicago, Chicago, Illinois. Tous les protocoles ont été effectuées conformément aux lignes directrices nationales et institutionnelles et règlements pour le bien-être de l’humanité. Consentement parental éclairé écrit était requise et obtenu avant le prélèvement des échantillons dans tous les cas.

1. préparation du réactif

  1. Préparer la solution mère de milieux de Culture pour la collection de tissus entiers : 1 L de Dulbecco modifié Eagle (DMEM), 110 mL de fœtale Bovine sérique (FBS), 11 mL de pénicilline-streptomycine (concentration finale de 1 %) et 1,1 mL d’insuline stérilisée par filtration (concentration finale de 0,1 %). Stocker la solution-mère à 4 ° C.
  2. Préparer la chélation tampon #1 : 30 mL de milieu de Culture (comme décrit au point 1.1), 600 µL de 0,5 M d’acide Tétraacétique (EDTA) (concentration finale 10 mM), 300 µL de gentamicine (concentration finale de 1 %) et 60 µL d’amphotéricine B (concentration finale de 0,2 %). Stocker la solution-mère à 4 ° C.
  3. Préparer la chélation tampon #2 : 30 mL de milieu de Culture (comme décrit au point 1.1), 300 µL de 0,5 M EDTA (concentration finale de 5mM), 300 µL de gentamicine (concentration finale de 1 %) et 60 µL d’amphotéricine B (concentration finale de 0,2 %). Stocker la solution-mère à 4 ° C.
  4. Préparer les milieux de Minigut humaine : 41,4 mL de DMEM/F-12, 5 mL de FBS (derniers 10 %), 500 µL de pénicilline-streptomycine (concentration finale 1 %), 500 µL de L-glutamine (concentration finale 1 %), 500 µL de gentamicine (concentration finale 1 %), 100 µL de l’amphotéricine B (final concentration 0,2 %), 500 µL de 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonique (HEPES) (concentration finale 10 mM), supplément de 500 µL de 100 x N-2 et 1 mL de 50 x B-27 supplément moins de vitamine A pour un volume total de 50 mL. Solution stock de la boutique à-20 ° C.
  5. Préparer les humains Minigut Media Complete : 10 mL d’humain Minigut Media (préparée en 1.4), 10 µL de 100 µg/mL Wnt3a (concentration finale 100 ng/mL), 10 µL de 100 µg/mL caboche (concentration finale 100 ng/mL), 10 µL de 1 mg/mL R-Spondin (concentration finale 1 µg/mL) , 10 µL de 500 µg/mL de facteur de croissance épidermique (EGF) (concentration finale 50 ng/mL), 10 µL de 1 M N-acétylcystéine (concentration finale de 1 mM), 10 µL de 10 mM Y-27632 (concentration finale 10 µM), 10 µL de 500 µM A-83 (concentration finale 500 nM), 10 µL de 10 mM (final SB202190 concentration de 10 µM), 100 µL de 1 M Nicotinamide (concentration finale 10 mM) et 1 µL de 100 µM [leu] 15-gastrine 1 (concentration finale 10 nM). Volume total 10 mL. Stocker la solution-mère à 4 ° C.
    Remarque : Des solutions doivent être utilisées sous 48 h.

2. crypte Isolation et le placage du tissu entier

  1. Au moment de la collecte dans la suite du dispositif, placer l’échantillon de tissu intestinal petit humain dans de Dulbecco froid Phosphate Buffered Saline (SPD). Laver l’échantillon au SPD froid jusqu’au clair de selles et de sang. Stocker l’échantillon à 4 ° C dans un milieu RPMI 1640 jusqu’au moment de l’isolement de la crypte.
    Remarque : Les tissus ne peuvent être stockés plus de 24h.
    1. S’assurer que l’échantillon est clair de selles et de sang. À l’aide de ciseaux de dissection délicate, enlever tout excès graisses ou chirurgicales agrafes etc.. Peser l’échantillon.
      Remarque : Viser une pièce environ 0,75 à 2,5 g.
  2. Couper l’échantillon en morceaux de 0,5 cm et placer dans 30 mL de tampon de chélation #1 (tel qu’établi à l’étape 1.2).
    1. Agiter à basse vitesse pendant 15 min à 4 ° C.
    2. Tissu filtrer sur un tamis de cellule 100 µm et jeter les traversent.
  3. Ajouter le tissu à 30 mL de tampon de chélation #2 (tel qu’établi à l’étape 1.3).
    1. Agiter à basse vitesse pendant 15 min à 4 ° C.
    2. Filtre tissu à travers un tamis de cellule de 100 µm et jeter les traversent.
  4. Décongelez les 500 mL de matrice de la membrane basale sur la glace pour une utilisation à l’étape 2.8.
  5. Ajouter des tissus à 10 mL de DMEM froid dans un tube conique de 50 mL et agiter vigoureusement à la main pendant 10 s.
    1. Filtrer à travers un tamis de cellule de 100 µm et recueillir le débit à travers (étiquette #1). Maintenir le tube #1 sur la glace.
    2. Ajouter des tissus pour un autre 10 mL de DMEM froid dans un tube conique séparé 50 mL et agiter vigoureusement à la main pendant 10 s.
    3. Filtrer à travers un tamis de cellule de 100 µm et recueillir les flux à travers (label #2).
    4. Répéter deux fois jusqu'à ce qu’il y a quatre tubes coniques avec accréditives (tubes étiquetés #1-4).
  6. Filtre tube #1 solution à travers un 100µm cellule crépine et transfert traversent dans tube conique 15 mL (étiquette #1). Répétez de #2 à 4.
    1. Centrifuger 15 mL tubes #1-4 à 200 x g pendant 15 min à 4 ° C.
  7. Dans la hotte à flux laminaire, retirez le surnageant de tubes #1-4 et jetez-le. Ne pas perturber le nuage des tissus immédiatement au-dessus de la pastille, même si cela signifie laisser certains surnageant.
    1. Mélanger ensemble en pipettant également, lentement, le culot avec les restes du surnageant dans les tubes #1-4.
    2. Transférer le mélange des tubes #1-4 dans un tube conique unique de 2 mL.
    3. Centrifuger le tube conique à 200 x g pendant 20 min à 4 ° C.
  8. Retirez le surnageant et resuspendre le culot dans 500 µL de matrice de la membrane basale.
    Remarque :     garder la matrice de la membrane basale sur glace en tout temps et travailler rapidement pour les prochaines étapes. Ce produit polymérise très rapidement à la température ambiante.
    1. Appliquer 50 µL de spécimen/basement membrane matrice suspension au centre d’un puits dans une plaque 24 puits. Elle devra figurer en forme de dôme.
      Remarque : Utilisation de pointes de pipette réfrigérés favorise transfert plus lisse de la suspension, réduisant au minimum la polymérisation.
    2. Répéter 9 fois pour remplir 10 puits de totales.
  9. Placer la plaque 24 puits à 37 ° C, 5 % CO2 incubateur pendant 30 min permettre la polymérisation.
  10. Ajouter 500 µL de Human Minigut Media complet (tel qu’établi à l’étape 1.5) dans chaque puits. Remplacer tous les 2 jours.
  11. Recueillir des enteroids après 5-10 jours, quand le bourgeonnement est visualisé. Voir les étapes 4 et 5 pour obtenir des instructions de la collection.

3 induction of Experimental NEC

  1. Ajouter 10 µL de 5 mg/mL de lipopolysaccharides (LPS) à 500 µL de Human Minigut Media complet (tel qu’établi à l’étape 1.5) dans chaque puits au jour 0. Remplacer tous les 2 jours jusqu'à la collection.

4. préparation pour l’enrobage de paraffine

  1. Retirez délicatement les médias.
    1. Ajouter 1 mL de PBS et pipetez doucement haut et bas pour dissoudre la matrice de la membrane basale avec soin ne pas pour lyser les enteroids.
    2. Centrifuger PBS/enteroid mélange à < 300 x g pendant 5 min à pellet et supprimer les PBS.
  2. Ajoutez 4 % paraformaldéhyde à difficulté à température ambiante pendant 1 h.
  3. Centrifuger à < 300 x g pendant 5 min pour pellet, puis supprimer les PBS.
    1. Laver délicatement avec 1 mL de PBS et centrifuger à < 300 x g pendant 5 min pour pellet, puis supprimer les PBS.
    2. Répétez l’étape 4.3.1.
  4. Faire fondre un volume suffisant du tissu traitement gel (environ 300 µL) en plaçant la quantité désirée dans un tube conique et le réchauffement dans un incubateur bain sec à 65 ° C pendant 3 à 10 min jusqu'à ce que liquide.
    1. Ajouter le tissu traitement gel au culot et mélanger doucement.
    2. Sur un lamelle couvre-objet, placez un petit anneau de clonage.
    3. Pipeter le tissu mélange de gel et enteroid de traitement dans un anneau de clonage monté sur un lamelle couvre-objet.
  5. Laisser le tissu mélange de gel et enteroid à se solidifier à 4 ° C pendant 1 h de traitement.
    1. Submerger la bague de clonage avec mélange solidifié dans l’éthanol à 70 % en préparation pour l’enrobage de paraffine.

5. Enteroid Collection d’ARN et de protéine d’Extraction

  1. Retirez doucement humaine Minigut Media complet de chaque puits.
  2. Ajouter 1 mL de PBS et pipetez doucement haut et bas pour dissoudre la matrice de la membrane basale. Veillez à ne pas dissocier l’enteroids.
    1. Placer PBS/enteroid mélange dans un tube conique stérile de 2 mL.
    2. Centrifuger à < 300 x g pendant 5 min granuler.
    3. Retirez délicatement le PBS, en prenant soin de ne pas pour enlever l’enteroids.
  3. Répétez l’étape série 5.2 deux fois plus.
  4. Congeler à-80 ° C jusqu’au moment de la protéine ou extraction de l’ARN.
  5. Effectuer le gène expression protéique isolement et de l’enteroids en utilisant bien établie qRT-PCR et les techniques Western Blotting.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Immédiatement après l’ensemencement, les cryptes intestinales fraîchement isolés apparaissent sous forme de tiges allongées. Dans les heures, l’enteroid aura une apparence ronde (Figure 1a). Au cours des prochains jours, l’enteroids va commencer formant des sphères comme on le voit dans la Figure 1b. En herbe doit avoir lieu entre 5-10 jours (Figure 1c

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Ce roman ex vivo enteroid intestinal humain modèle sert d’une méthode utile pour l’étude du dysfonctionnement de la barrière intestinale dans l’entérocolite nécrosante (NEC). Les méthodes de traitement enteroid présentées ici ont été adaptés des travaux précédent du DRS Misty Good, Michael Helmrath et Jason Wertheim10,11,12.

Détails qui entoure l’ensemble prélèvement tissulaire et le calendrier de l’i...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le National Institute of Health Institute, de diabète et Digestive et rénale maladie Grant (K08DK106450), le Jay Grosfeld le prix de l’Association américaine de chirurgie pédiatrique de C.J.H.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
4 % ParaformaldéhydeThermoFisherAAJ19943K2
A-83R& D Tocris2939/10
Amphotéricine BThermoFisher15290026
supplément B-27 moins vitamine AThermoFisher17504-044
Matrice de membrane basale (Matrigel)CorningCB-40230C
DMEM/F-12ThermoFisherMT-16-405-CV
Dulbecco' s Eagle Medium modifié (DMEM)ThermoFisher11-965-118
Dulbecco' s Solution saline tamponnée au phosphate (DPBS)ThermoFisher14190-144
Facteur de croissance épidermique (EGF)SigmaE9644-.2MG
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)SigmaEDS-500G
Sérum fœtal de bovin (FBS)Gemini Bio-Pro100-125
GentamicineSigmaG5013-1G
GlutaMAX ( L-glutamine)ThermoFisher35050-061
InsulineSigmaI9278-5mL
[leu] 15-gastrin 1SigmaG9145-.1MG
Lipopolysaccharide (LPS)SigmaL2630-25MG
N-2 supplémentThermoFisher17502-048
N-2-hydroxyéthylpipérazine-N-2-éthane sulfonique (HEPES)ThermoFisher15630-080
N-acétylcystéineSigmaA9165-5G
NicotinamideSigmaN0636-100G
NogginR& D Systems INC6057-NG/CF
Pénicilline-StreptomycineThermoFisher15140-148
Saline tamponnée au phosphate (PBS)SigmaP5368-5X10PAK
RPMI 1640 MediumInvitrogen11875093
R-SpondinPEPROTECH INC120-38
SB202190SigmaS7067-5MG
Gel de traitement tissulaire (Histogel)ThermoFisher22-110-678
Wnt3aR& D Systems INC5036-WN-010
Y-27632SigmaY0503-1MG

Références

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  2. Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).
  3. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).
  4. Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).
  5. Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).
  6. In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).
  7. Senger, S., et al. Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC). Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
  8. Moore, S. A., et al. Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis. Journal of Pediatric Surgery. 51 (12), 1907-1913 (2016).
  9. Neal, M. D., et al. A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).
  10. Lanik, W. E., et al. Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation. Journal of Visualized Experiments. (132), 56921(2018).
  11. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), 52483(2015).
  12. Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).
  13. Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).
  14. Neal, M. D., et al. Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier. The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).
  15. Sodhi, C. P., et al. Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice. Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).
  16. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Ent ro des humainsmod le d ent rocolite n crosantecellules souches intestinalesisolation des cryptestraitement au LPSmatrice de membrane basalemilieu pour mini intestin humainr cepteur Toll like 4analyse par qRT PCRWestern blot
Un nouveau modèle de Enteroid épithéliales humaines d’entérocolite nécrosante
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.