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Article de méthode

Inoculation de cellules de carcinome épidermoïde chez les souris pour tumeur immunitaire profilage et évaluation de réponse traitement suffit

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DOI :

10.3791/59195

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22 avril 2019

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1Department of Radiation Oncology, University of Colorado Denver - Anschutz Medical Campus, 2Department of Anesthesiology, University of Colorado Denver - Anschutz Medical Campus, 3Division of Radiology, University of Colorado Denver - Anschutz Medical Campus

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici une méthode reproductible pour le développement d’un modèle murin d’orthotopique du carcinome épidermoïde tête et du cou. Les tumeurs démontrent cliniquement pertinentes caractéristiques histopathologiques de la maladie, y compris nécrose, une différenciation pauvre, métastases nodales et infiltration immunitaire. Souris de tumeur-roulement développent des symptômes cliniquement pertinentes y compris la dysphagie, déplacement de la mâchoire et la perte de poids.

Résumé

Tête et cou carcinome épidermoïde (HNSCC) est une maladie débilitante et mortelle avec une prévalence élevée de récidive et d’échec du traitement. Pour développer des stratégies thérapeutiques mieux, compréhension tumeur micro-environnementales des facteurs qui contribuent à la résistance au traitement est important. Une entrave majeure à la compréhension des mécanismes de la maladie et améliorer la thérapie a été un manque de lignées de cellules murines qui ressemblent à la nature agressive et métastatique du HNSCCs humains. En outre, une majorité de modèles murins emploient des implantations sous-cutanées des tumeurs qui n’ont pas des caractéristiques physiologiques importantes de la région tête et cou, y compris haute densité vasculaire des vaisseaux lymphatique et flora muqueux résident. Le but de cette étude est d’élaborer et de caractériser un modèle orthotopique de HNSCC. Nous utilisons deux lignées cellulaires murins génétiquement distincts et tumeurs établies dans la muqueuse buccale de souris. Nous optimisons les méthodes de digestion de tumeur collagènase-basé pour la récupération optimale de cellules uniques de tumeurs établies. Les données présentées ici montrent que les souris développent des tumeurs fortement vascularisés qui métastaser dans les ganglions lymphatiques régionaux. Unicellulaire multiparamétriques cytometry masse analyse révèle la présence de diverses populations immunitaires avec des cellules myéloïdes, représentant la majorité de toutes les cellules immunitaires. Le modèle proposé dans la présente étude a des applications en biologie du cancer, immunologie tumorale et développement préclinique de nouveaux médicaments. La ressemblance du modèle orthotopique de caractéristiques cliniques de la maladie humaine fournira un outil de traduction accrue et améliorée des patients.

Introduction

HNSCC est la malignité cinquième plus courante dans le monde, avec plus 600 000 patients diagnostiqués chaque année1. Malgré un traitement agressif impliquant la chimiothérapie et la radiothérapie (RT), le taux global de survie (OS) pour HNSCC les patients sans infection par le virus du papillome humain (VPH) reste inférieure à 50 % après 5 ans2. Ceci est en grande partie attribué à un micro-environnement tumeur très complexes comme les tumeurs peuvent provenir de plusieurs sites anatomiques distinctes au sein de la région tête et cou, dont la muqueuse buccale, la langue, le plancher de la bouche, cavité buccale, cavité nasale, du pharynx, oropharynx et l’hypopharynx. En outre, la région de la tête et du cou est fortement vascularisée et contient près de la moitié de tous les ganglions lymphatiques dans le corps de3. Une majorité d’études portant sur la tête et du cou biologie tumorale s’appuient sur des modèles de tumeurs dans la région du flanc. Ces modèles peuvent offrir de mieux comprendre les mécanismes intrinsèques tumeur, mais le manque du microenvironnement natif de la tête et du cou peut avoir un impact significativement le potentiel translationnel de telles conclusions. Une méthode qui a été utilisée pour induire des tumeurs par voie orale est par l’exposition à la substance cancérogène 9,10-diméthyl-1, 2-benzanthracène (DMBA)4. Toutefois, cette méthode est associée à une longue procédure, induit des tumeurs chez les rats et les hamsters, mais pas chez les souris et les tumeurs qui en résulte ne possèdent pas beaucoup des caractéristiques histologiques différenciée frs5,6. Taux au sein et entre les lots d’abonnement de l’introduction de le carcinogen4-nitroquinoléine 1-oxyde (4-onq), un dérivé de la quinolone soluble dans l’eau, a donné lieu à des tumeurs par voie orale de souris lorsqu’il est appliqué par voie orale, mais a également souffert de longues durées d’exposition (16 semaines) et un nombre limité souris7,8,9. Afin de développer des modèles cliniquement pertinents, plusieurs groupes a utilisé des modèles issus du génie génétique impliquant la manipulation d’oncogènes de pilote ou de gènes suppresseurs de tumeur, dont TP53, TGFB, KRAS, HRAS et SMAD410. Ces modèles peuvent donnent un aperçu des tumeurs avec des gènes connus pilote mais ne pas récapituler l’hétérogénéité complexe de HNSCCs humaines.

Dans ce travail, nous démontrons la possibilité d’effectuer une intramuqueuse inoculation de cellules de carcinome épidermoïde chez la souris. Cellules inoculées se développent dans les tumeurs agressives dans la semaine suivant l’injection. Semblable à HNSCCs humains, les tumeurs métastaser vers les ganglions lymphatiques régionaux. Nous caractériser les caractéristiques cliniques et histologiques de la maladie et permettent de mieux comprendre le microenvironnement immunitaire de la tumeur. Nous proposons que ce modèle orthotopique de HNSCC a des applications en biologie du cancer, immunologie tumorale et les études précliniques. Mécanismes d’évasion immunitaire, la progression tumorale, résistance au traitement et les métastases représentent les zones d’importance clinique qui peut être résolu en utilisant le modèle proposé.

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Protocole

Toutes les procédures d’animaux ont été effectuées conformément à un agréé animaux soin et l’utilisation Comité (IACUC) protocole institutionnel de l’Université du Colorado à Denver (protocole # 00250).

1. Culture de cellules de tumeur

Remarque : Les lignées de cellules B4B8 et LY2 ont servi à produire des tumeurs HNSCC orthotopique : cellules tumorales B4B8 provenaient de kératinocytes muqueuse cancérogène transformées (à partir de souris BALB/C)11. Cellules tumorales LY2 provenaient de métastases ganglionnaires d’un BALB/C spontanément transformé des kératinocytes ligne (Pam 212)12,13. Les deux lignées cellulaires ont été gracieusement fournies par Dr Nadarajah Vigneswaran (UTHealth, Houston, TX, é.-u.).

  1. Utiliser moyen (DMEM) F/12 de l’aigle modifié de Dulbecco additionné de 10 % sérum fœtal (SVF) et réactif aux antimicrobiens 1 % pour l’entretien de ligne de cellule. Maintenir ces lignées de cellules dans un incubateur stérile à 37 ° C et 5 % de CO2. Cellules devraient être utilisées pour l’inoculation avant dépassant 15 passages.
  2. Plaque de 2 x 106 à 4 x 106 cellules en flacons de culture cellulaire 175 cm2 .
    Remarque : S’assurer que les cellules sont inférieures à 90 % anastomosé à éviter d’induire une réponse au stress.
  3. Lorsque les cellules sont 70 % anastomosé (~ 48 h), enlever le ballon de l’incubateur et laver les cellules 3 x avec froide solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
  4. Détacher les cellules du flacon à l’aide de trypsine de 0,25 %, assez pour couvrir la surface de la plaque.
    1. Pour cela, diluer 4 mL de trypsine dans une fiole de2 175 cm contenant 70 % de cellules confluentes. Incuber les cellules avec la trypsine pendant 3 à 4 min dans l’incubateur de culture de cellules à 37 ° C et 5 % de CO2.
    2. Visualiser les cellules sous microscope pour s’assurer que le détachement de la cellule.
    3. Ajouter 12 mL de support de DMEM F/12 contenant FBS pour neutraliser l’activité de la trypsine.
  5. Aspirer la suspension cellulaire et le placer dans un tube conique de 50 mL.
  6. Agiter le tube contenant les cellules en inversant x-4 3 x.
  7. Vous pouvez également mélanger une quantité de 10 µL de suspension cellulaire à 10 µL de bleu de Trypan dans un tube de microcentrifuge et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Déterminer la viabilité cellulaire en soustrayant le nombre de cellules de bleu Trypan-positives du nombre total de cellules et diviser par le nombre total de cellules.
  8. Centrifuger la suspension de cellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C.
  9. Remettre en suspension les cellules en DMEM sans sérum et sans antibiotique à un volume approprié afin que 1 x 106 cellules sont présentes dans 50 µL de médias.
    Remarque : Se fondant sur l’agressivité de ligne cellulaire in vivo (déterminée empiriquement), 1 x 106 cellules par site d’injection par souris a été jugée appropriée pour les cellules B4B8 et LY2.
  10. Placez le flacon contenant la suspension cellulaire sur la glace.
  11. Placer la matrice préalablement décongelés membrane basale sur la glace.
    Remarque : La matrice de la membrane basale a été décongelée pendant une nuit à 4 ° C.

2. cellule Injection à des souris

  1. Préparer un mélange de 1:1 de matrice de membrane de cellules : sous-sol (50 µL).
  2. Ajouter des cellules d’abord ; puis, peu à peu pipetter la matrice de la membrane basale. Éviter d’introduire des bulles d’air. Veiller à ce que le mélange se fait immédiatement avant l’injection de l’animale. Ajoutant des cellules à membrane basale matrice pendant une période prolongée de temps peut entraîner dans la cellule de décantation dans le mélange de la matrice, ce qui rend le mélange difficile de serrer rigoureusement. Cela entraînera une variabilité considérable dans la taille de la tumeur entre les souris.
  3. Mélanger doucement. S’assurer que toutes les étapes impliquant la matrice sont effectuées sur la glace. Matrice de la membrane basale se polymérisent à température ambiante.
  4. Préparer les seringues pour l’inoculation.
  5. Charger des seringues à insuline 0,5 mL (23 G) avec 100 µL de la solution de matrice de membrane cellulaire/sous-sol.
  6. Garder les seringues sur la glace pour éviter la polymérisation de matrice de membrane basale.
  7. Anesthésier souris en les plaçant dans une chambre avec l’isoflurane et oxygène (2,5 %).
  8. S’assurer que les souris sont profondément anesthésiés avant d’effectuer l’injection (en assurant une absence de réponse à une pincée d’orteil).
  9. Introduire l’aiguille dans la région buccale droite ou gauche. Cela s’effectue par le biais de l’espace ouvert de chaque côté de la bouche.
  10. Veiller à ce que langue de la souris n’est pas de la manière.
    Remarque : Il est facile de pousser la langue, qui se traduira dans les tumeurs de la langue. Remuer la langue vers le côté opposé si nécessaire.
  11. Conserver la seringue parallèle à la région buccale à l’intérieur de la cavité buccale.
  12. Lorsque vous êtes prêt à injecter, retirer la seringue et introduire doucement la seringue à un angle de 10°.
  13. Injecter 100 µL de la suspension de matrice de membrane cellulaire/sous-sol sur une période de 5 s.
  14. Tenir la seringue en place pour une supplémentaire de 5 s pour s’assurer que tout le matériel est injecté.
    Remarque : Pour souris retrouve contrôle, injecter un mélange de sérum et de la matrice (comme décrit ci-dessus) sans les cellules tumorales.
  15. Retirer la seringue doucement.
  16. Continuer la procédure ci-dessus avec les souris restants.
  17. Prévoir 1 semaine jusqu'à ce que les tumeurs commencent à apparaître exagérément (50-200 mm3 pour les cellules B4B8 et LY2).

3. souris surveillance

  1. Effectuer la première mesure à l’aide d’étriers à 1 semaine après l’injection de cellules tumorales. Pour calculer le volume de la tumeur à l’aide d’étriers externes, déterminer le plus grand diamètre longitudinal (longueur) et le plus grand diamètre transverse (largeur) et utiliser la formule ellipsoïdal mis à jour le14,15.
    figure-protocol-1
  2. Continuer d’effectuer des mesures régulières étrier pour le volume des tumeurs (1 x x-2 par semaine à intervalles réguliers).
  3. Mesurer le poids de l’animal afin d’évaluer les effets de la croissance tumorale sur l’alimentation.

4. tumeurs de récolte

  1. Une fois atteint le point de terminaison expérimentale, euthanasier les animaux à l’aide de mesures appropriées (p. ex., CO2 asphyxie, décapitation ou dislocation cervicale).
    Remarque : Dans cette étude, le point de terminaison a été atteint si les souris est devenu moribonds (avec une perte de poids de > 15 % de leur poids initial, un manque de toilettage, cachexie) et/ou si la taille de la tumeur a atteint 1 000 mm3.
  2. Commencer la dissection de l’animal en créant une longue incision par le biais de la ligne médiane dans la région du cou.
    1. Pince émoussée permet de saisir la peau et des ciseaux pour couper la peau.
  3. Insérer les ciseaux doucement sous la peau recouvrant la tumeur et créer des poches d’air en poussant les ciseaux dans l’ensemble et dans la peau.
  4. Une fois que la peau est suffisamment détachée de la tumeur, identifier les ganglions lymphatiques de drainage (DLNs) et d’accise eux afin d’éviter que le tissu tumoral confondu par la présence de ganglions lymphatiques.
    Remarque : Les grosses tumeurs peuvent atteindre ou couvrir le rad. Selon le type d’analyse effectuée, l’isolement des ganglions intactes est essentiel pour éviter tout débordement des cellules immunitaires dans la tumeur, qui se traduira par les résultats de titrage de l’inclinaison.
  5. Couper à travers les frontières de la tumeur jusqu'à détache le volume entier.

5. tumeur de traitement pour les Applications en aval

  1. L’examen histologique en aval, placer les tumeurs dans du formol 10 % à la température ambiante. Pour éviter tout overfixation, remplacez le formol avec l’éthanol à 70 %. Pour l’analyse en cytométrie en flux, traiter les tumeurs comme décrit ci-dessous.
    Remarque : Les tissus peuvent être conservés dans du formol pendant 72 h avant l’overfixation peut devenir problématique pour certains types de coloration.
  2. Couper la tumeur en 1 à 2 mm-petits morceaux à l’aide d’une lame de rasoir stérile ou des ciseaux pointus.
  3. Placer les morceaux de tumeur coupés dans un tube conique de 50 mL avec la collagénase III (4 250 unités par exemple), DNase I (0,1 mg par exemple) et inhibiteur de la trypsine (1 mg par exemple).
  4. Incuber à 37 ° C pendant 30 min avec agitation toutes les 10 min.
    Remarque : Les échantillons peuvent être placés dans un sac refermable, stérilisé à 90 % d’éthanol et placé dans un incubateur de culture cellulaire.
  5. Après 30 min, ajouter 20 mL de Hank équilibré de solution saline (HBSS) et un essorage à 300 x g pendant 5 min.
    Remarque : HBSS est composé de chlorure de potassium, chlorure de sodium, bicarbonate de sodium, phosphate dibasique de sodium, phosphate de sodium monobasique et le glucose.
  6. Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 2 à 3 mL de tampon de lyse des globules rouges (gr). Pipetter rigoureusement.
    Remarque : Tampon de lyse RBC est composé de chlorure d’ammonium, bicarbonate de sodium et disodique.
  7. Incuber pendant 2 min à température ambiante.
    Remarque : Une incubation plus longue peut être toxique pour les autres populations de cellules.
  8. Ajouter 20 mL de HBSS pour neutraliser l’effet de tampon de lyse.
  9. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
  10. Resuspendre le culot dans 10 mL de HBSS.
  11. Passer la solution à travers une drisse de nylon 70 µm et centrifuger à 300 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant.
  12. Répétez les étapes 5,8 – 5,10 et passez la suspension cellulaire par une drisse nylon de 40 µm pour assurer que tous les débris supplémentaires sont supprimé à la suspension.

6. cellule de coloration et d’Acquisition de données

  1. Resuspendre le culot dans 1 mL de HBSS.
  2. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisées, comme indiqué au point 1.7
  3. Déterminer le nombre total de cellules et la concentration appropriée pour la coloration.
    Remarque :     la concentration cellulaire idéal pour la coloration de cytométrie en flux est 1 million de cellules. Par exemple, si la coloration est effectuée dans une plaque à 96 puits et il y a 10 millions de cellules, remettre en suspension l’échantillon de 1 mL et plaque 100 µL pour 1 million de cellules par puits.
  4. Ajouter Fc bloc (CD16/CD32) à une concentration de 1/100 afin d’éviter la liaison nonantigen spécifique des immunoglobulines aux récepteurs FcγIII et FcγII. Incuber 5 min à température ambiante.
    1. Centrifuger et resuspendre le culot dans 100 µL de cellule d’écoulement cytometry coloration tampon (composé d’une solution saline contenant 5 % FBS, EDTA de 2 % et 1 % HEPES).
  5. Effectuer la surface de la cellule de coloration selon les instructions fournies par le fournisseur (en ajoutant chaque anticorps à la dilution appropriée). Incuber pendant 60 min à température ambiante.
    1. Centrifuger et resuspendre le culot dans 100 µL de HBSS. Répéter 2 x pour se débarrasser de l’excès anticorps.
  6. Exécutez des échantillons sur un cytomètre de flux approprié.
    1. Si l’analyse des marqueurs intracellulaires (par exemple, foxp3), effectuer perméabilisation de la cellule et de coloration selon les instructions du fournisseur.

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Résultats

L’évaluation in vitro de la prolifération cellulaire LY2 et B4B8 ont montré que les deux lignées cellulaires ont fois doublement similaires (21 h et 23 h, respectivement). In vivo, les deux lignées cellulaires forment une masse unique, visible et palpable dans la semaine suivant l’inoculation (Figure 1 a). Dans des souris porteuses de tumeurs LY2, la mâchoire a été déplacée de 3 semaines en raison de la charge tumorale (Figure 1 a

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Discussion

Une analyse rigoureuse et la caractérisation du microenvironnement tumoral représentent une stratégie importante pour la compréhension des mécanismes de développement de tumeurs, de progression et de métastases et pour le développement de thérapies efficaces. Cancer de la tête et du cou est une maladie complexe qui peut provenir de plusieurs sites anatomiques dans la région de la tête et du cou. Un obstacle majeur à la compréhension des mécanismes de la maladie et améliorer la thérapie a eu un manque de lignées de cellul...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Collagénase IIIWorthington Biochemical Corp.
DNase IWorthington Biochemical Corp.
Fc Block (CD16/32)BD Biosciences553141  ; Cloner 2.4G2  ;
Tampon de coloration par cytométrie en fluxeBioscience00-4222-26
HBSSThermoFisher Scientific14175079sans calcium, sans magnésium, sans
phéno rouge Cytomètre de masse Helois FluidigmNA
Matrigelmembrane matrix Corning  ;CB-40234B
Scanner IRMBrukerNA7,4 Tesla
Tampon de lyse RBCBioLegend420301
Inhibiteur de la trypsineWorthington Biochemical Corp.
LS004183LS006328LS002830

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