Article de méthode

Échelle du protéome Quantification d’homogénéité à l’échelle de la molécule unique d’étiquetage

DOI :

10.3791/59199

⸱

19 avril 2019

 ,  , 
1Laboratory for Cell Systems Control, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, RIKEN, 2Laboratoire de Biomatériaux et Bioimagerie, INSERM, 3PRESTO, Japan Science and Technology Agency

Dans cet article

Résumé

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Nous présentons ici un protocole pour évaluer l’homogénéité étiquetage pour chaque espèce de protéine dans un échantillon complexe des protéines à l’échelle de la molécule.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellule protéomes sont souvent caractérisées à l’aide de tests d’électrophorèse, où toutes les espèces de protéines dans les cellules sont non spécifiquement étiquetés avec un colorant fluorescent et sont repérés par un photodétecteur après leur séparation. Imagerie de fluorescence seule molécule peut fournir détection ultrasensible de protéines grâce à sa capacité de visualisation de molécules fluorescentes individuels. Toutefois, l’application de cette méthode d’imagerie puissante aux déterminations de l’électrophorèse est entravée par le manque de moyens pour caractériser l’homogénéité du marquage fluorescent de chaque espèce de protéines à travers le protéome. Ici, nous avons développé une méthode pour évaluer l’homogénéité d’étiquetage dans l’ensemble du protéome basé sur un test d’imagerie de fluorescence seule molécule. Dans notre mesure en utilisant un échantillon de cellules HeLa, la proportion de protéines marquées au moins un colorant, qui nous appelé « étiquetage occupation » (LO), était déterminé à gamme de 50 à 90 %, soutenant le potentiel élevé de l’application de l’imagerie de la seule molécule à analyse du protéome sensible et précis.

Introduction

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Analyse du protéome, qui vise à quantifier l’ensemble des molécules de protéines exprimées dans la cellule, est une approche utile dans les études biologiques et pharmaceutiques actuelles. Cette analyse s’appuie généralement sur la spectrométrie de masse, qui identifie les espèces de protéines issus des spectres générées par l’intermédiaire de protéines ionisation1,2,3. Une autre méthode d’analyse du protéome est l’électrophorèse, y compris l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE), l’électrophorèse capillaire et l’électrophorèse sur gel en deux dimensions (2D). Cette méthode repose sur le marquage fluorescent non spécifique de toutes les molécules de protéine dans les cellules analysées, suivies de la séparation par électrophorèse et de détection et de quantification de chaque espèce de protéine. Pour atteindre l’étiquetage requis des protéines non spécifiques, une stratégie consiste à utiliser des colorants fluorescents qui peuvent se lier aux protéines via des interactions électrostatiques et hydrophobes, comme le bleu de Coomassie et Sypro Ruby4,5,6 . Une autre stratégie consiste à utiliser le marquage covalent avec colorants contenant de l’ester N-hydroxysuccinimide (NHS) ou maléimide, qui peut lier par liaison covalente à des protéines par le biais de résidus communs tels que les amines primaires et thiols, respectivement7, 8.

Pendant ce temps, la sensibilité de détection de fluorescence est idéale pour l’analyse des protéines de faible abondance et un petit nombre de cellules. Imagerie de fluorescence des molécules simples est une des méthodes plus sensibles qui permet la détection des colorants fluorescents individuels et des protéines marquées in vitro et in vivo9,10,11,12, 13,14,15. Application de cette méthode d’imagerie pour l’analyse protéomique axée sur l’électrophorèse est prévue pour permettre des essais hautement sensibles et quantitatives en comptant les différentes protéines fluorescent marquées. Cependant, on ne sait si l’étiquetage avec les colorants fluorescents est assez homogène dans l’ensemble de toutes les molécules de protéines, et comment cette homogénéité est affectée par des espèces de protéines différentes (Figure 1). Mesures de solution simple en vrac peuvent être utilisées pour obtenir un rapport molaire de colorants fluorescents aux protéines appelées « efficacité de couplage »8 « étiquetage efficacité », mais cette propriété ne fournit pas d’information sur l’homogénéité de l’étiquetage des molécules de protéines.

Nous décrivons ici le protocole pour un dosage d’enquêter sur l’homogénéité d’étiquetage pour toutes les espèces de protéines dans la cellule (Figure 2)16. Les deux principales étapes de ce test sont l’imagerie et purification des protéines. Dans la première étape, toutes les protéines dans les cellules sont étiquetés fluorescent et biotinylés, puis extrait séparément à l’aide de l’électrophorèse sur gel suivie par électroélution. Dans la deuxième étape, les propriétés de fluorescence des molécules de protéines individuelles dans les échantillons extraits sont évaluées basées sur l’imagerie seule molécule. Partir de ces données, paramètres importants pour l’analyse de l’inventaire, tels que le pourcentage de protéines marquées avec un moins un colorant, qui nous appelons étiquetage occupation (LO)16, et le nombre moyen de colorants fluorescents lié à une molécule de protéine unique (n̄ colorant), peuvent être caractérisés. Dans le protocole, une procédure optimisée pour l’étiquetage du protéome de cellules HeLa avec colorant de Cyanine 3 (Cy3) base d’esters NHS est présentée à titre d’exemple et peut être modifiée avec d’autres procédures d’étiquetage selon les objectifs de recherche désiré.

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Protocole

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1. préparation de la cellule

  1. Cultiver des cellules HeLa dans un plat de 10 cm à 37 ° C moins de 5 % de CO2 dans Dulbecco de l’aigle modifié contenant 10 % sérum de veau fœtal.
  2. Prélever des cellules exponentiellement croissants que lorsqu’ils ont atteint 70 % confluence, suivant les instructions de ATCC17.
    1. Rincer les cellules avec 5 mL de 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (pH 7,4). Supprimer les PBS.
    2. Ajouter 1 mL d’acide de 0,1 % trypsine-tétraacétique (EDTA). Incuber 5 min à 37 ° C.
    3. Surveiller la progression de la dissociation cellulaire au microscope.
    4. Une fois que les cellules deviennent ronds et sont détachent du plat, ajouter 4 mL de milieu de croissance et briser l’agglomération de cellule en pipettant également.
    5. Compter le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules.
    6. Centrifuger à 150 g pendant 10 min dans un tube à centrifuger. Retirez le support et resuspendre le culot cellulaire avec 5 mL de solution de 1 PBS x (pH 7,4).
    7. Répétez l’étape 1.2.6. Remettre en suspension les cellules dans du PBS 1 x (pH 7,4) à une concentration finale de 106 cellules/mL avec le numéro de compte à l’étape 1.2.5.
      Remarque : La suspension cellulaire peut être aliquotés et congelés à-80 ° C pendant plusieurs mois. Répéter un cycle de gel/dégel devrait être évitée.

2. cellule lysis et marquage fluorescent

  1. Faire 10 mL de tampon de lyse (borate 0,1 M, de 1 % dodécylsulfate de sodium (SDS) et de 1 % Tween 20). Ajuster le pH 12 à l’aide de 2 M de NaOH.
    Attention : NaOH concentré est corrosif. Porter des lunettes et des gants appropriés lors de la préparation de cette solution.
    Remarque : Le tampon de lyse peut être stocké pendant une semaine à température ambiante.
  2. Mélanger 100 μL de lyser un tampon avec 1 μL de 1 M le dithiothréitol (DTT) et 4 μL de 50 % (3-[(3-cholamidopropyl)) diméthylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS).
  3. Mélanger 1 μL de la culture cellulaire (environ 1 000 cellules) avec le tampon de lyse mixte de l’étape 2.2. Homogénéiser la solution en pipettant également lentement pour éviter les bulles. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 5 min avec agitation douce. Re-homogénéiser la solution en pipettant également lentement.
  4. Ajouter 1 μL de 2 μg/mL colorant Cy3 NHS-ester. Homogénéiser la solution en pipettant également lentement pour éviter les bulles. Incuber pendant 5 min dans l’obscurité à température ambiante avec agitation douce.
    NOTE : Le pH élevé de ce tampon provoque la neutralisation des résidus de lysine dans les protéines, conduisant à une plus forte réactivité.
  5. Répétez l’ajout de 1 μL de 2 μg/mL colorant Cy3 NHS-ester. Homogénéiser la solution en pipettant également lentement pour éviter les bulles. Incuber pendant 10 min dans l’obscurité à température ambiante avec agitation douce.
    Remarque : Cette scène reproduit addition de colorant NHS-ester peut accroître l’efficacité étiquetage parce que certains de la teinture de Cy3 NHS-ester est hydrolysé et désactivé par le pH élevé de la mémoire tampon de réaction.
  6. Ajuster le pH 7,2 en ajoutant 100 μL de 0,8 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acide (HEPES)-NaOH pH 7,2 à étancher la réaction. Homogénéiser la solution en pipettant également lentement pour éviter les bulles.
  7. Ajouter 20 μL de 19 mg/mL biotine-(polyéthylène glycol (PEG))2-amine et 5 μL de 20 mg/mL 1-éthyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC). Homogénéiser la solution en pipettant également lentement pour éviter les bulles. Incuber pendant 1 heure dans l’obscurité à température ambiante avec agitation douce.
    Remarque : Cette étape biotinylation est nécessaire de fixer les molécules de protéines sur une lamelle de microscope à une densité fixe et avec aucun penchant pour les espèces de protéines.
  8. Retirez les réactifs de marquage n’a pas réagis et concentrer l’échantillon en utilisant une colonne de l’ultrafiltration avec 10 kDa coupure, suivant les instructions du fabricant.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. L’échantillon peut être stocké à-80 ° C pendant plusieurs semaines.

3. récupération et séparation de Proteome

  1. Ajouter 4 x tampon d’échantillon de SDS (200 mM Tris-HCl pH 6,8, SDS de 4 %, 4 % de glycérol et de 0,4 % de bleu de bromophénol).
    Remarque : Pour éviter d’endommager de colorant, l’échantillon de protéines ne doit pas être chauffé comme fait par SDS-PAGE standard et doit être conservé à température ambiante.
  2. Effectuer SDS-PAGE standard pour l’échantillon de protéine et une échelle moléculaire, à l’aide de 20 % gel d’acrylamide. Migrer de l’échantillon dans le gel à une tension constante (160 V) jusqu'à la migration avant sort juste le gel.
  3. Image du gel pour identifier l’emplacement des bandes protéiques (Figure 3).
  4. Découper les portions de gel, y compris les fractions de protéine d’intérêt à l’aide d’une lame tranchante, basée sur les endroits de la bande. Fractionnement à 16, 23, 55 et 120 kDa peaks et à 19 – 25, 25-32, 32 – 42, 42-54, 54-69, 69-97, 97-136 et 136 – 226 kDa régions sont affichées à la Figure 3.
  5. Extrait de protéines à l’aide d’un dialyseur par électroélution avec une taille de pore de 6 – 8 kDa, suivant les instructions du fabricant.
    Remarque : L’échantillon extrait peut être stockée à-80 ° C pendant plusieurs semaines.

4. préparation de lamelle de microscope

  1. Préparez 200 μL de tampon de l’avidine (pH 7,2, 10 avidine ng/mL et 2 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) de 5 mM HEPES-NaOH) pour chaque échantillon.
  2. Préparer les lamelles de 22 x 22 mm et 0,15 mm d’épaisseur. Exposer les lamelles couvre-objet pour plasma utilisant un plasma cleaner pendant 1 min pour nettoyer et activer leurs surfaces d’air.
  3. Enrober les lamelles couvre-objet avec avidine par enduction centrifuge 200 μL de tampon de l’avidine utilisant une coucheuse essorage pendant 5 secondes à 500 tr/min, suivi de 30 secondes à 1 000 tr/min. Incuber les lamelles pendant 15 min à température ambiante pour les laisser sécher.
  4. Préparer les lamelles couvre-objet pour l’échantillon de protéine.
    1. Diluer l’échantillon de protéines (à partir de 3.5) 100 fois dans 5 mM HEPES-NaOH de pH 7,2.
    2. Place 100 μl de l’échantillon dilué sur la surface au centre de la lamelle avidine-enduit (de l’étape 4.3).
    3. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 15 minutes.
  5. Préparer le contrôle positif.
    1. Place 100 μL de 10 ng/mL purifiée fluorescent biotine en lamelle pH 7,2 au centre de l’avidine enduit 5 mM HEPES-NaOH (de l’étape 4.3).
    2. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 15 minutes.
      Remarque : Ce contrôle positif lamelle offre la densité de l’avidine points de liaison, qui sert à calculer le LO.
  6. Préparer le contrôle négatif.
    1. Spin-manteau le plasma nettoyer lamelle couvre-objet avec 200 μL de 5 mM BSA HEPES-NaOH et 2 mg/mL (sans avidine).
    2. Incuber pendant 15 min à température ambiante pour sécher.
    3. Ajouter 100 μL de 10 ng/mL purifiée fluorescent biotine en 5 mM HEPES-NaOH de pH 7,2.
    4. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 15 minutes.
      Remarque : Cette lamelle de contrôle négatif fournit la quantité de liaisons non spécifiques de la biotine fluorescent à la lamelle sans avidine.
  7. Rincer chaque lamelle avec 200 μL d’eau distillée en pipettant également, sur les bords de la lamelle de manière à ne pas toucher au milieu de la lamelle avec la pointe. Répétez ce lavage trois fois.
    Remarque : Après l’aspiration de l’eau sur la lamelle couvre-objet, l’eau doit être placé immédiatement sur la lamelle couvre-objet pour l’empêcher de se dessécher complètement.
  8. Exposer le plasma d’air avec le même nombre de lamelles comme à l’étape 4.2.
  9. Placer la lamelle nettoyée sur la lamelle échantillon lié à l’étape 4.7 afin d’éviter le séchage.

5. l’observation en microscopie de fluorescence seule molécule

  1. Démarrage d’un microscope à fluorescence champ grand-angulaire ou évanescente.
    Attention : Direct ou rayonnement laser épars peut entraîner des yeux ou des dommages de la peau. Porter des lunettes de protection appropriées et recouvrez le trajet de la lumière laser.
    Remarque : Pour la configuration de microscope, veuillez vous référer à notre précédente publication16. En bref, un microscope à fluorescence champ grand-angulaire ou évanescente équipé d’une grande puissance 488 nm laser d’excitation, un objectif à grande ouverture numérique et une caméra de haute sensibilité peut être utilisé pour cette mesure. En outre, pour une mesure automatique, un stade d’échantillon translationnelle XY contrôlé par ordinateur, des volets mécaniques pour les excitations de laser et un système autofocus sont recommandés pour être installé.
  2. La valeur de la lamelle sur le microscope et trouver le focus.
  3. Effectuez un scan de tuile pour obtenir au moins 100 images.
    Remarque : L’illumination laser doit être contrôlée avec des volets mécaniques d’être exposés à l’échantillon uniquement lors de l’enregistrement des images avec l’appareil photo, afin de minimiser le Photoblanchiment. S’il y a beaucoup d’échantillons, mesure automatique en utilisant un programme informatique pour contrôler les périphériques du microscope est recommandé. Chaque image comprend généralement des taches seule molécule 100 – 500 lorsque vous utilisez un objectif de 60 x.

6. analyse et extraction d’informations de l’image

  1. Si l’image a inégalité en raison du modèle d’illumination laser, effectuer le traitement d’images pour le corriger18.
    1. Acquérir une image de référence en mesurant avec un échantillon de la lamelle couvre-objet composé des colorants uniformément répandue en utilisant une caméra définissant le même comme dans l’étape 5.3.
    2. Acquérir une image décalée en mesurant avec aucune excitation de laser en utilisant le même réglage de l’appareil.
    3. Soustraire à chaque valeur de pixel de chaque image de l’échantillon et l’image de référence avec la valeur de l’image décalée.
    4. Diviser chaque valeur des pixels dans les images d’exemple soustraite de la valeur à l’image de référence soustraites.
  2. Recueillir les images correctement reçues et supprimer l’arrière-plan de l’image.
    1. Supprimer les images contenant de gros agrégats fluorescents manuellement.
    2. Supprimer l’arrière-plan de l’image en appliquant l' algorithme de balles roulantes19 avec un rayon de la boule de 50 pixels à l’aide de ImageJ20.
    3. Netteté des images en soustrayant les images floues avec ImageJ (affiner en fonction de l’image).
  3. Trouver et analyser les taches de la molécule unique en images.
    1. Identifier les taches de la molécule unique avec le Yen seuil algorithme21 à l’aide de ImageJ.
    2. Filtrer les spots avec moins de deux pixels à exclure bruit sombre de la caméra et les taches plus de 20 pixels pour exclure les agrégations des protéines à l’aide de ImageJ (gestionnaire de retour sur investissement).
    3. Compter le nombre de places dans chaque image. À l’aide de l’éclairage, analyser les images corrigées (étape 6.1.4), total des intensités de pixels pour chaque tache à l’aide de ImageJ.
  4. Calculer le taux d’occupation étiquetage (LO) à l’aide de la formule suivante :
    LO = (nombre de chefs d’accusation dans l’échantillon / nombre de chefs d’accusation dans le contrôle positif) x 100
  5. Calculer le nombre moyen de colorants fluorescents lié à une molécule de protéine unique (colorantden̄).
    1. Analyser un histogramme des intensités de chaque tache.
      Remarque : L’histogramme a généralement plusieurs pics, et chaque sommet représente un nombre différent de molécules de colorant lié à une protéine. Le premier, deuxième et troisième pic dans l’histogramme correspond à des molécules 1, 2 et 3, respectivement.
    2. Calculer l’intensité moyenne de l’histogramme. Aussi calculer l’intensité maximale du pic premier en appliquant un raccord gaussien.
    3. Calculer n̄colorant en divisant l’intensité moyenne avec le pic d’intensité.

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Résultats

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Figure 4 représente les données d’image raw pour les fractions de différents poids moléculaires des protéines des cellules HeLa lysat, ainsi que les témoins positifs et négatifs. Bien que l’échantillon de protéine et positif contrôlent pièce 100 – 500 places par image, contrôle négatif affiche aucun ou quelques taches, montrant que le protocole inhibe suffisamment non-spécifiques des colorants à la surface de la lamelle couvre-objet. Spot intensité histogramm...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article décrit un protocole afin de quantifier l’homogénéité étiquetage de chaque espèce de protéines marquées dans les cellules après la séparation avec SDS-PAGE (étape 3). La méthode de séparation peut être substituée avec d’autres méthodes comme la chromatographie en phase liquide ou électrophorèse capillaire, permettant la séparation et le fractionnement des protéines cellulaires à haute résolution, tout en nécessitant un équipement spécial23. La méthode étiquetage du NHS-ester dans le pro...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent les intérêts financiers concurrents suivants : RIKEN a déposé une demande de brevet sur ces résultats avec S.L. et Y.T. nommé comme des coïnventeurs.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient Masae Ohno et Kazuya Nishimura de conseils et d’assistance expérimentale. Ce travail a été soutenu par PRESTO (JPMJPR15F7), Japan Science and Technology Agency, subventions pour jeunes chercheurs (A) (24687022), contestant la recherche exploratoire (26650055) et la recherche scientifique sur les domaines innovants (23115005), la Japan Society for la Promotion de la Science et par des subventions de la Takeda Science Foundation et la fondation du mémorial Mochida à usage médical et la recherche pharmaceutique. S.L. reconnaît le soutien du programme RIKEN International programme Associate (IPA).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
22x22x0.15 mmlamelle VWR470019-004
488 nm Laser argonCoherentInnova 70C
488 nm miroir dichroïqueSemrockFF495-Di03
488 nm filtre anti-émissionSemrockFF02-520/28
560 nm filtre dichroïqueSemrockDi02-R561
560 nm filtre anti-émissionSemrockFF02-617/73
560 nm laserà fibre MBP CommunicationsF-04306-2
60x lentille d’immersion dans l’huileOlympusPLAPON 60x
AvidinNacalai-tesque03553-64
Biotin-PEG-amineThermo Scientific21346
Biotinylated Alexa Fluor 488Nanocs
BorateNacalai-tesque
BSASigma-AldrichA9547
CHAPSDojindoC008-10
Cy3 NHS-ester dyeGE HealthcarePA13101
Dialyzer  ; - D-tube, 6-8 kDaMerck Millipore71507-M
DMEMSigma-Aldrich
DTTNacalai-tesque14112-94
EDCNacalai-tesque
Caméra EMCCDAndorIiXon 897
Microscope à fluorescence EpiOlympusIX81
Visionneuse de gelGE HealthcareImageQuant LAS 4000
Mélange de pénicilline, streptomycine et amphotérécineGibco
Nettoyeur plasmaDiener Electronic
SDSWakoNC0792960
Taille de la colonne de purification 10KMerck MilliporeUFC5010
Tween 20Sigma-AldrichP9416

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Fluorescence mol cule uniquehomog n it du marquage prot iquetaux d occupation du marquages paration par SDS PAGEmarquage par colorant fluorescenttechnique de d p t par centrifugation spin coatingconcentration par ultrafiltrationmicroscopie champ largehistogramme d intensit des spots

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