Les rats utilisés dans cette étude ont reçu des soins quotidiens selon les directives de l’AVMA pour l’euthanasie des animaux : 2013 édition16. Le Comité de l’urbanisme à l’Université du Wisconsin-Madison et d’institutionnels animalier évalué et approuvé ce protocole expérimental avant le début du projet.
1. les animaux
- Utilisez les rats mâles Sprague-Dawley non consanguines, pesant environ 350 g.
2. préparation de Bone Morphogenetic protéine-2 (rhBMP-2) imbibé d’éponge échafaudages
NOTE : Préparation de l’échafaudage doit se produire juste avant l’implantation dans le fémur (voir étape 6.14).
- Suivez les instructions du fabricant pour l’utilisation d’une trousse de greffe établi rhBMP-2 OS contenant une éponge de collagène, lyophilisée rhBMP-2 et l’eau stérile pour reconstitution17. Maintien de la stérilité, reconstituer la rhBMP-2 avec l’eau stérile à une concentration de 1,5 mg/mL.
- À l’aide de ciseaux stériles et un dirigeant stérile, couper l’éponge rhBMP-2 collagène trempé à remodeler pour s’adapter à une 5 mm x 3 mm x 3 défaut de mm.
- À l’aide d’une seringue, répartir la solution rhBMP-2 sur l’éponge de collagène afin qu’il soit absorbé.
3. préparation du dispositif de fixation externe personnalisée
Remarque : Voir la Figure 1 a pour la liste plus complète des dimensions.
- Couper en aluminium stock (type 6061, 0,088" épaisseur) de la feuille à deux pièces (1.4" x 6") à l’aide d’une scie sauteuse ou tout autre outil approprié.
- Monter une pièce dans la machine de fraisage et, à l’aide d’un moulin de foret de carbure de 90°-point 1/8", coupez quatre rainures « V » (profondeur de 0,035") dans la longueur. Laisser l’autre morceau gratuit de coupes.
- Couper des plaques individuelles de 0.3" largeur des deux pièces (Figure 1 b). Mesurer et percer les trous de vis pour 4-40 fils. Tapoter la plaque avec des rainures de « V » avec le fil 4-40. Percer la plaque sans rainures pour une perceuse de corps #4 vis.
- Poncer les deux pièces à coins arrondis et à réduire le poids (Figure 1).
- Visser les pièces ainsi que de 4-40, 18-8 inox bouchon vis à tête ronde (0,25") afin que les cannelures soient à égalité contre la plaque ordinaire (Figure 1)
4. analgésie et procédure anesthésique
- Induire l’anesthésie en plaçant le rat dans la chambre d’induction offrant 4 L O2/min avec 4 % isoflurane.
Attention : Personnel de recherche doit éviter l’inhalation de gaz anesthésique et maintenir la bonne hotte et ventilation dans le laboratoire.
- Retirer le rat de la chambre après que le rat perd le réflexe de redressement, fixez une extrémité conique et placez à la dose d’entretien de l’anesthésie par le nez (O2 débit à 2-3 L/min et 0,8 % isoflurane).
- Placez le rat sur le coussin chauffant ou la lumière-réchaud pour éviter l’hypothermie.
- Confirmer la profondeur adéquate de l’anesthésie par pincement de l’orteil ou le réflexe palpébral.
- S’applique à lubrification aux yeux pour éviter le dessèchement de la cornée.
- Livrer une injection sous-cutanée de la buprénorphine à libération prolongée (1 mg/kg) sur le tronc/dos du rat, loin du site chirurgical, à fournir une analgésie jusqu'à 3 jours après la chirurgie.
5. aseptique préparation et antibiotiques préventifs
- Raser la zone autour de hindleg à l’aide de la 13ème côtes, le pied, la ligne médiane dorsale et la ligne médiane ventrale comme marges.
- Zone de broussailles rasé à l’aide de 2 x 2 compresses imbibées de polyvidone iodée 10 % suivie par 70 % EtOH (4 fois chacun en alternance).
- Administrer une injection intramusculaire de céfazoline (20 mg/kg) dans les quadriceps du dispositif.
- Administrer l’enrofloxacine (0,25 mg/ml) dans l’eau potable pendant 7 jours après l’opération pour une protection antibiotique continue.
- Placez des rats sur les aliments médicamenteux (p. ex., Uniprim) pour la durée de l’étude pour prévenir les infections des voies broche.
- Appliquer double onguent antibiotique à l’interface de peau ou de broches une fois par jour pendant 3 jours après l’opération.
Remarque : Évitez d’aucune broche de fixation externe ou serrez relâchement qui peut contribuer au développement d’une infection.
6. intervention chirurgicale
Remarque : Assurez-vous un concertée aux efforts afin de maintenir un champ stérile et l’espace de travail et de suivre la technique stérile tout au long de l’intégralité de l’affaire.
- Étendre les jambes rasée drapé fenêtrée, collant transparent et banc chirurgicale couverture en serviettes stériles pour créer un champ stérile.
- Palper le fémur et utiliser une lame #15 pour créer une incision de la face antérolatérale à travers la peau qui s’étend de la rotule au grand trochanter au fémur proximal.
- Soigneusement inciser le carénage latéral de la jambe le long du septum intermusculaire pour séparer le muscle vaste externe du quadriceps antérieurement les ischio-jambiers vers l’arrière jusqu'à ce que le fémur latéral est exposé. Préserver l’insertion de fessier tendon abducteur sur le grand trochanter.
- Effectuer une dissection de tissus mous circonférentielle atraumatique prudent et exposer le fémur à son milieu diaphyse commençant sur la surface latérale. Pour ce faire, utiliser une lame #15 pour couper délicatement le muscle à l’os sous-jacent en gardant la lame parallèle contre le contour de la surface osseuse. Utiliser un ascenseur périostique pour soulever le muscle à l’OS exposé comme il est disséqué et continuer autour de la tige fémorale jusqu'à 7 à 10 mm de la diaphyse central a été effacé des tissus mous sur toutes les parties à se préparer à l’ostéotomie.
Remarque : Éviter de blesser le paquet vasculo-nerveux fémoral médial.
- Insérez les quatre fils de Kirschner (k) de 1,0 mm : 2 proximale et distale dans le fémur perpendiculaire sur le fémur latéral, 2 dirigé droit latéral à médial. S’assurer que toutes les broches s’engager les deux cortex (bicorticales) pour une stabilité suffisante (Figure 2 a).
- Commencer d’abord, avec la tige distale plus juste au niveau de l’épicondyle latéral. Place jig flush sur le fémur distal latéral et insérez un extrémité filetée 1,0 k-fil.
- Maintenant la position du gabarit sur l’os, identifier où la broche plus proximale pénétrera dans l’OS basé sur les trous du gabarit. Une fois que la position est déterminée, soigneusement inciser parallèle aux fibres du tendon fessier que nécessaires pour créer un petit écart dans le tissu pour la goupille de proximal à passer à travers, minimisant ainsi les dommages iatrogènes au tendon. Percer un 1,0 mm non filetée k-fil dans cet intervalle, assurant encore une fois que la goupille s’enclenche les deux cortex (Figure 2 b).
- Maintenir la position de la jig au contact de l’os et percer deux 1,0 mm fileté Kirschner, une de chaque côté du site du défect futures. S’assurer que les broches s’engage les deux cortex (Figure 2).
- Placez le fixateur externe bar niveau 1 cm au-dessus de la peau et vissez, blocage de la barre en place. Couper les longueurs excédentaires broche (Figure 2D).
- Préparer l’ostéotomie (création de défaut) en plaçant un rétracteur incurvé, petit autour du fémur antérieur et postérieur pour protéger les tissus mous environnants, les muscles et paquet vasculo-nerveux. Utilisant un oscillant sagittale ~ 5 mm lame de scie, avec beaucoup de prudence créer un défaut segmentaire de 5 mm par le biais de la diaphyse du milieu. Appliquer une lumière, une pression uniforme avec la scie afin d’éviter d’inutile fracture (Figure 2E).
- Appliquer de petites quantités d’irrigation (température ambiante 0,9 % du sérum physiologique (NS)) selon les besoins, tout en créant des défauts afin d’éviter une nécrose thermique de l’os.
- Rincer la plaie à l’aide de 10 mL de la Nouvelle-Écosse après avoir créé le défaut.
- Administrer 0,1 mL d’une bupivacaïne 0,25 % d’épinéphrine (1 : 200, 000) sur la plaie comme analgésique et vasoconstricteur.
- Insérer l’échafaud (5 x 3 x 3 mm) d’éponge de collagène ou rhBMP-2 imbibé d’éponge (à partir de l’étape 2) dans le vice. Chaque échafaudage doit être dimensionné de manière appropriée pour couvrir la longueur et le volume du défaut, aidant l’éponge restent en position.
Remarque : À ce stade, complexes d’ARNm peuvent préparer et injectés décrites aux étapes 7.1-7.3 ci-dessous si vous effectuez l’imagerie bioluminescence.
- Fermer le plan musculaire en utilisant le modèle simple interrompu avec suture résorbable 4-0. Fermer la couche de la peau, l’utilisation du modèle en cours d’exécution sous-cuticulaires avec suture résorbable 4-0 et colle pour combler les lacunes autour les broches qui dépasse de la peau.
- Enlever le rat de la coiffe, restant sur le coussin chauffant et surveiller en permanence jusqu'à ce que le rat est en mesure de maintenir constamment une posture verticale. À ce stade, placer dans une cage propre pour récupérer.
7. préparation des ARNm complexé et imagerie de bioluminescence
NOTE : Transfection avec des complexes de l’ARNm doit être effectuée pendant l’opération 1 jour avant l’imagerie luminescence. Utiliser des techniques stériles lors de la manipulation des ARNm.
- Mix 10 µL d’ARNm codant pour Gaussia luciférase (stock concentration de 1 µg/µL) avec 30 µL de l’agent de transfection lipidique.
- Prévoir les complexes d’ARNm-lipides pour former en incubant pendant au moins 5 min à température ambiante. L’agent de transfection lipidique se condense les molécules d’ARNm, les stabiliser et améliorer l’efficacité de transfection.
Remarque : Si les complexes ne sont pas utilisés immédiatement, rangez-les dans la glace pour un maximum de 1 h.
- À l’aide d’une pipette µL 20 équipé avec pointes filtrées, injecter la moitié du volume des complexes d’ARNm à l’extrémité distale et proximale du défaut, respectivement.
- Le lendemain, 3 min avant l’imagerie, anesthésier le rat l’inhalation isoflurane comme précédemment décrit dans l’étape 4.1.
- Positionner le rat dans in vivo d’imagerie chambre équipé d’un cône de nez prestation entretien isoflurane (0,8 % isoflurane, O2 taux de livraison de 2 à 3 L/min).
- Injecter la coelenterazine remis en suspension dans une solution saline à la dose de 4 mg/kg de poids corporel à proximité de la défectuosité.
- Acquisition d’images de bioluminescence in vivo d’imagerie (IVIS) selon instructions18 les directives du fabricant.
8. imagerie protocole
- Après le calibrage de la machine radiographique simple, un système de rayons x19, anesthésier rat l’inhalation isoflurane comme décrit précédemment (voir étape 4.1) et positionner le rat dans un cône de nez à l’inhalation isoflurane (0,8 % isoflurane, O2 taux de livraison de 2 à 3 L/min) pour une radiographie du fémur antéro-postérieure (AP).
- Alors que le rat est en décubitus sternal, avancer le membre postérieur chirurgical vers l’avant, la flexion au niveau des hanches et étouffer la commune. Flex de l’articulation du Grasset à environ 90°. Bande du côté plantaire de la patte vers le bas, à proximité de la paroi du corps. Position du tibia vers l’avant du fémur afin d’éliminer la possibilité de superposer les os. Pour fournir la légère abduction de la hanche, placez une éponge translucide (environ 15 mm d’épaisseur) dans la région de l’aine. Obtient alors une image (crânienne-caudale) antéro-postérieur du fémur.
- Répétez ce point de vue radiographique fémur AP immédiatement après la chirurgie, 4 et 12 semaines. Utiliser le ruban adhésif et la gaze pour positionner convenablement les extrémité de l’animal pour l’imagerie cohérente et de qualité.
- Enlever le rat de la coiffe et surveiller en permanence jusqu'à ce que le rat est en mesure de maintenir constamment une posture verticale. Ensuite, remettre dans la cage.
9. histologique procédure
- Euthanasier des rats dans une chambre avec l’inhalation de CO2 selon AVMA normes éthiques16.
- Suite à l’euthanasie, se raser le membre postérieur, enlever la peau de l’extrémité du dispositif et équipe du fémur au niveau des hanches. Retirez soigneusement tous les tissus mous du fémur du dispositif (y compris tous les muscles, tendons et ligaments). Laisser seule une mince couche de muscles qui entourent le site de défaut pour protéger la région de guérison contre les dommages accidentels au cours de la dissection.
- Placez le fémur chez 10 % formol tamponné neutre, à température ambiante pendant 3-4 jours pour permettre la fixation. Garder un formol 15:1 rapport de volume tissulaire. Changez la solution une fois le processus de fixation au milieu.
- Détartrer le fémur dans une solution pH 6,5 15 % éthylènediaminetétraacétique acide (EDTA) pendant 3 à 4 semaines. Recueillir la série radiographies pour déterminer le point de terminaison de décalcification.
- Coupent le fémur longitudinalement avec une coupe d’antérieur postérieur dans le plan longitudinal. Soumettre pour enrobage de paraffine standard et l’hématoxyline et éosine (H & E) de la coloration des tissus.
- Envoyer des diapositives H & E à un orthophoniste pour une évaluation histologique.