Article de méthode

Détermination du taux de fécondation des oeufs de Bemisia tabaci , utilisant une Technique cytogénétique

DOI :

10.3791/59213

⸱

1 avril 2019

 , 
1Graduate Interdisciplinary Program in Entomology and Insect Science, University of Arizona, 2Department of Entomology, University of Arizona

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons une technique cytogénétique simple à l’aide de 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour déterminer le taux de fécondation et sex-ratio primaire du ravageur envahissantes haplodiploïdes Bemisia tabaci.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quelques espèces d’aleurodes suceurs de sève sont des ravageurs plus dommageables terrestres dans le monde entier en raison des dommages causés aux cultures qu’ils infligent et phytovirus qu'ils vector. Malgré de nombreuses études sur la biologie de ces espèces dans des environnements différents, un paramètre de clé cycle biologique, progéniture sex-ratio, a reçu peu d’attention, est encore important pour prédire la dynamique de la population. Le sex-ratio primaire (sex-ratio à la ponte) de Bemisia tabaci , n’a jamais été signalé mais peut être trouvé en déterminant le taux de fécondation des oeufs d’insecte haplodiploïdes. La technique consiste à le dechorionation des oeufs avec l’eau de Javel, une série d’étapes de fixation et l’application de la tache fluorescente générale de l’ADN, DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole, un colorant fluorescent de liaison à l’ADN), lier à pronucléus femelles et mâles. Nous présentons ici la technique et un exemple de son application, pour tester si une bactérie endosymbiotique, Rickettsia SP. nr. bellii, influencé le sex-ratio primaire de b. tabaci. Cette méthode peut aider dans l’étude de la population de mouches blanches, ou pour déterminer si l’attribution du sexe existe avec certains stimuli de l’environnement.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’étude de la répartition du sexe, ou l’investissement relatif chez les descendants mâles et femelles, est des pierres angulaires de l’écologie comportementale1,2,3. En plus de sa puissance pour tester des modèles adaptatifs de comportement, connaître la stratégie d’allocation de sexe d’un organisme peut améliorer les modèles de sa dynamique de population. Chez de nombreuses espèces, allocation de sexe est contrôlée par les mères. Pour déterminer l’allocation de sexe, il est important de déterminer le sex-ratio primaire ou la proportion des femelles au moment de la ponte. Bien que le rapport des sexes à l’émergence des adultes peut fournir des indices d’allocation de sexe, la mortalité différentielle développementale entre mâles et femelles juvéniles peut biaiser communément substantiellement le sex-ratio adult. Chez certaines espèces d’hyménoptères, l’ordre des insectes qui contient des fourmis, abeilles et guêpes, le sex-ratio primaire a été déterminé avec des analyses cytogénétiques, souillant les embryons pour afficher génétique ADN. Comme les hyménoptères sont haplodiploïdes, un œuf mâle naissant est haploïde et contient seulement le pronucleus femelle (n), tandis que naissantes œufs femelles sont diploïdes et contenant le pronucléus mâles et femelles (2n). Bien que Aleyrodidae, la famille sap qui se nourrissent des Hémiptères (Hemiptera) appelées mouches blanches, sont également haplodiploïdes, il n’a pas été un dosage établi pour trouver le sex-ratio primaire chez ces insectes. C’est peut-être surprenant étant donné l’intensité de l’étude des parasites graves peu cosmopolites dans cette famille et de l’importance du sex-ratio chez les interactions compétitives des aleurodes4,5,6,7 ,8,9,10 et dans la dynamique de la population en général. Aussi, chez les insectes haplodiploïdes sex-ratio sont sans contrainte par les systèmes de détermination sexuelle, prévoyant la possibilité de fécondation sélective et sex-ratio labile qui varient avec l' environnement2. Nous présentons ici une technique pour déterminer le sex-ratio primaire du complexe espèces d’aleurodes, connus collectivement comme les aleurodes de patate douce, b. tabaci. Ce nom d’une espèce englobe plus de 28 espèces dans le monde entier11et comprend certains des plus dommageables des ravageurs envahissants global12,13. L’application de cette technique pour déterminer les patrons d’allocation de sexe de b. tabaci et autre Aleyrodidae permettra une enquête plus rigoureuse de variables, telles que température, plante-hôte, des bactéries endosymbiotiques ou plante/aleurodes agents pathogènes, qui peuvent influencer les aleurodes sex-ratio primaire et dynamique de population des aleurodes.

Nous sommes pas au courant de toute technique de coloration à le œuf comparables pour b. tabaci. Le protocole est pratique par rapport aux méthodes de coloration utilisées pour les autres œufs d’insectes14 car il omet une nuit étape de fixation et, par conséquent, peut être complété en 3 h. Comme exemple d’une application, une bactérie endosymbiotique, Rickettsia SP. nr. bellii, est associé de partialité féminine dans nos lignes de laboratoire de b. tabaci Moyen Orient-Asie mineure 1 (MEAM1)15,16. En une seule ligne de laboratoire de MEAM1 de b. tabaci (« MAC1, » prélevés dans le centre agricole de Maricopa), nous testons si Rickettsia-fertilisent les femelles (R+) infectées plus d’oeufs que les femelles infectées (R-).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Remarque : Veiller à ce que tout le travail est effectué à la température ambiante dans un endroit bien ventilé ou sous une hotte aspirante. Tous les « gouttes » dans le présent protocole sont définies comme 5 – 20 µL, selon les préférences de l’opérateur.

1. première installation

  1. Permettre aux aleurodes femelles à pondent leurs oeufs sur les feuilles propres. Exemples d’arénas de la ponte des cages de clip ou de feuilles coupées pour s’adapter sur la gélose dans une boîte de pétri. Faire un trou couvrable dans la cage de clip ou le couvercle de la boîte de pétri pour insérer et retirer les adultes. Sinon, rapidement mettre un navire des adultes prélevés sur la glace et, ensuite, déposez-les sur la feuille. Limiter le temps entre la ponte et fixation de le œuf à pas plus de 60 min, afin d’assurer l’observation de la transition de sperme dans le pronucleus paternel dans les oeufs.
    Remarque : Œufs ne pas retirés de la feuille peuvent être élevés jusqu'à l’âge adulte pour enregistrer adultes sex ratios.
  2. Avant ou pendant la ponte de la mouche blanche, préparer une lame de microscope en le nettoyant avec du savon et l’eau, séchage il bien et puis qui s’étend d’un morceau de pellicule de paraffine sur une extrémité, en s’assurant que la surface de film de paraffine ne casse pas (Figure 1).
    Remarque : Le film de paraffine est hydrophobe et semi-opaque, permettant aux liquides de forme gouttes et d’oeufs pour être vu plus facilement.

2. Dechorionation

  1. Avec un verre de Pasteur, pipette, ajouter des gouttes de solution d’eau de Javel (hypochlorite de sodium 0,83 %) pour le film de paraffine.
    Remarque : Il est plus facile de garder une trace des oeufs si seulement 2 – 3 oeufs sont contenus dans chaque goutte. Sinon, pour gérer un certain nombre de gros oeuf, recueillir les oeufs en gouttes de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    Mise en garde : Eau de Javel est corrosif ; Portez des gants lorsque vous manipulez de Javel et ne pas inhalent.
  2. Retirez les aleurodes adultes de la feuille.
  3. Placez la feuille sous un microscope pour discerner les oeufs et collecter les œufs séparément et soigneusement avec une sonde fine. Pour faire une sonde, insérez une tige de nadel minuten à 45° ou à un angle de travail confortables dans un fondu de pipette (Figure 2).
  4. Transférer les oeufs à l’eau de javel ou PBS 1 x. Si vous utilisez la solution 1 PBS x, enlever le 1 x PBS avec un verre de Pasteur pipeter une fois tous les oeufs sont prélevés et, ajoutez ensuite l’eau de Javel aux œufs.
    Remarque : Lors de la collecte des œufs, soulevez lentement l’oeuf de sa base jusqu'à ce que le pédicelle est retiré de la feuille. Le pédicelle est collant, et le œuf communément collera à l’extrémité de la sonde jusqu'à ce qu’il est plongé dans l’eau de Javel.
    Remarque : Il est recommandé d’utiliser le verre séparée pipettes Pasteur pour tous les réactifs et les pipettes peuvent être modifiés avec la chaleur pour faire les pointes plus étroit et réduire le risque d’aspiration accidentellement les oeufs de la mouche blanche. Pour éviter les résidus éventuels et contamination, nettoyez les pipettes avec de l’eau désionisée après chaque utilisation.
  5. Attendez 10 min. S’il y a un intérêt dans l’embryogenèse dans les oeufs de plus de 1 h, laisser les oeufs dans l’eau de Javel pendant jusqu'à 15 minutes.
    Remarque : Pour les œufs qui sont vieux jusqu'à 1 h, 10 min est suffisant.

3. la fixation

Remarque : Ces étapes sont tirées d’un hyménoptère protocole17.

  1. Retirez l’eau de Javel (contenant les fragments de chorion) avec une pipette Pasteur en verre et jetez-le. Ajouter les gouttes d’acide acétique glacial avec un verre de Pasteur pipetter et attendent 3 min.
    Mise en garde : Procéder à cette étape sous une hotte aspirante. Acide acétique glacial est corrosif ; porter des gants lorsque manipulation d’acide acétique glacial et ne pas respirer, surtout en combinaison avec l’eau de Javel résiduelle.
  2. Retirer l’acide acétique glacial avec une pipette Pasteur en verre et ajouter des gouttes de solution de Clarke (3:1 d’éthanol absolu : acide acétique glacial) avec un verre de Pasteur pipeter. Patientez jusqu'à ce que la majeure partie de la solution se soit évaporée (ou 10 min max).
  3. Ajouter des gouttes d’éthanol à 70 % aux oeufs avec une pipette Pasteur en verre et attendre jusqu'à ce que la plupart de l’éthanol s’est évaporée (ou 10 min max).

4. coloration

  1. Supprimer toute éthanol résiduel avec une pipette Pasteur en verre et ajouter des gouttes de PBS 1 x aux œufs avec une pipette Pasteur en verre pour obtenir le pH proche de 7,0. Mettre la lame de microscope dans une chambre humide pour empêcher la dessiccation, par exemple, dans une boîte de pointe de pipette vide avec une serviette de papier humide à l’intérieur (Figure 3). Attendez au moins 30 min.
    Remarque : C’est le meilleur point si une pause est nécessaire, aussi longtemps que la chambre de l’humidité peut empêcher la dessiccation.
  2. Supprimer le PBS 1 x avec une pipette Pasteur en verre et ajouter des gouttes de 0,1 μg/mL DAPI, une tache fluorescent de l’ADN, avec un verre de Pasteur pipeter. Réglez la lame de microscope dans une chambre sombre humidité et attendre au moins 15 min.
    Mise en garde : Le DAPI est un irritant, donc le manipuler avec des gants.

5. lavage

  1. Retirez le DAPI avec une pipette Pasteur en verre.
  2. Ajouter des gouttes de 1 x TBST (5 x solution fabriqués à partir de 30 g de Tris, 43,8 g de NaCl, 5 mL de polysorbate 20 et 1,0 g de NaN3 [pH 7.5] et portée à 1 L avec de l’eau de la PCR grade) aux oeufs avec un verre de Pasteur pipeter. Attendre 5 min avant de retirer le 1 x TBST avec une pipette Pasteur en verre. Répétez cette étape 2 fois.

6. montage

  1. Après le lavage final, soigneusement pipette tous les oeufs du film de paraffine sur une partie propre de la lame de microscope. Retirez l’excès 1 x TBST ; puis, ajouter 20 µL de supports de montage (glycérol 80 % et 20 % 1 x TBST avec 2 % n-gallate de propyle) et placez une lame propre de la couverture sur le dessus les oeufs.
  2. Pour le stockage à long terme, sceller le coulisseau de couverture avec vernis à ongles transparent et, ensuite stocker la diapositive dans le noir à 2 ° C ou il découvre immédiatement sous un microscope à fluorescence.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour vérifier que Rickettsia affecte le taux de fécondation des femelles MEAM1 de b. tabaci , nous avons élevé Rickettsia-infecté (R+) ou non infecté (R-) b. tabaci sur les plantes de niébé (Vigna unguiculata) dans séparer les cages à 27 ° C, humidité relative de 70 % et une photopériode foncé h de lumière/8 h 16. R+ et R– quatrième stade larvaire les aleurodes ont été soigneusement retirés des feuill...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole est le premier à capturer le taux de fécondation ou sex-ratio primaire de b. tabaci. Le défi du présent protocole, c’est qu’il exige des chercheurs apprendre à gérer les oeufs de la mouche blanche rapidement, veiller à ce que pas plus de 1 h est écoulé depuis que les oeufs ont été pondus jusqu'à ce qu’ils sont fixés. Au cours d’expériences préliminaires, les oeufs qui ont été fixés à 3 h ou plus ponte étaient trop vieux pour observer la fécondation, la Syngamie avait eu lieu et divisions mitotiques ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette recherche a été financée par une subvention de NSF (DEB-1020460) à n235 et une subvention de l’USDA AFRI (2010-03752) à n235 Les auteurs remercient Brennan Zehr pour la coloration des oeufs de la mouche blanche avec beaucoup de compétence et Zen. Les auteurs remercient Mike Riehle permettant l’utilisation de son microscope à fluorescence pour l’imagerie. Les auteurs remercient Suzanne Kelly et Marco Gebiola pour les images de l’oeuf. Les auteurs remercient Suzanne Kelly et Jimmy Conway pour aider à des moments cruciaux au cours des expériences.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1x PBSN’importe quel
1x TBSTN’importe quellesolution 5x à base de 30 g de Tris, 43,8 g de NaCl, 5 mL de Tween-20 et 1,0 g de NaN3 pH 7,5 et ramenée à 1 L avec de l’eau de qualité PCR
Eau de JavelCloroxTout agent de Javel ménager fonctionnera tant qu’il peut être dilué à 0,83 % Hypochlorite
de sodium Vernis à ongles transparentN’importe quel
DAPI dilactateSanta Cruz Biotechnologysc300415
ÉthanolToutdilué à 70 % EtOH
Microscope fluorescentNikonNikon Eclipse 50i a été utilisé dans cette expérience, mais tout microscope fluorescent avec un filtre d’excitation de 340/380 nm et un grossissement d’au moins 4-10x peut être utilisé
Acide acétique glacialMallinckrodtUN2789
GlycérolN’importe quel
microscope WildUn microscope Wild M5A a été utilisé pour cette expérience, mais n’importe quel microscope où l’opérateur peut clairement voir les œufs d’aleurodes peut être utilisé
Couvercles de lames de microscopeToutes lesméthodes sont pour des couvercles de lames de 18 mm x 18 mm. Il faudra ajouter plus de supports de montage pour les couvertures de diapositives plus grandes.
Lames de microscopeN’importe quelle
broche de nadel MinutenBioQuip1208SALes broches de nadel Minuten sont facultatives pour le façonnage en sondes avec pointes de pipette
NaClN’importe quel
NaN3Any
n-propyl-gallateSigma/Santa Cruz BiotechnologyP3130/sc-250794
ParafilmPipettes Bemis
PasteurFisher Scientific13-678-20AFisherbrand Pipettes jetables en verre borosilicaté Pasteur 5,75 po. Un bec Bunsen peut également être nécessaire si l’opérateur souhaite allonger et rétrécir les pipettes
Eau de qualité PCRToutes
les pointes de pipetteToutespointes de pipette sont facultatives pour être façonnées comme des sondes avec des broches de nadel
minuscules Petite poire compte-gouttesToutDoit s’adapter sur la pipette Pasteur
TrisTout
Tween-20Tout
les

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Charnov, E. L. Sex ratio in spatially structured populations. The Theory of Sex Allocation. May, R. M. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 67-92 (1982).
  2. Godfray, H. C. J. Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).
  3. Bourke, A. F. G., Franks, N. R. Social Evolution in Ants. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1995).
  4. Pascal, S., Callejas, C. Intra- and interspecific competition between biotypes B and Q of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from Spain. Bulletin of Entomological Research. 94 (4), 369-375 (2004).
  5. Liu, S. -S., et al. Asymmetric mating interactions drive widespread invasion and displacement in a whitefly. Science. 318 (5857), 1769-1772 (2007).
  6. Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Mate discrimination in invasive whitefly species. Journal of Insect Behavior. 23 (5), 364-380 (2010).
  7. Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Plasticity in mating behaviour drives asymmetric reproductive interference in whiteflies. Animal Behaviour. 79 (3), 579-587 (2010).
  8. Tsueda, H., Tsuchida, K. Reproductive differences between Q and B whiteflies, Bemisia tabaci, on three host plants and negative interactions in mixed cohorts. Entomologia Experimentalis et Applicata. 141, 197-207 (2011).
  9. Wang, P., Crowder, D. W., Liu, S. -S. Roles of mating behavioural interactions and life history traits in the competition between alien and indigenous whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 102 (4), 395-405 (2012).
  10. Sun, D. -B., Li, J., Liu, Y. -Q., Crowder, D. W., Liu, S. -S. Effects of reproductive interference on the competitive displacement between two invasive whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 104 (3), 334-346 (2014).
  11. Liu, S. -S., Colvin, J., De Barro, P. J. Species concepts as applied to the whitefly Bemisia tabaci systematics: how many species are there? Journal of Integrative Agriculture. 11 (2), 176-186 (2012).
  12. Invasive Species Specialist Group. Global Invasive Species Database. , Available from: http://iucngisd.org/gisd/100_worst.php (2018).
  13. Gilbertson, R. L., Batuman, O., Webster, C. G., Adkins, S. Role of the insect supervectors Bemisia tabaci and Frankliniella occidentalis in the emergence and global spread of plant viruses. Annual Review of Virology. 2 (1), 67-93 (2015).
  14. Giorgini, M., et al. Rickettsia symbionts cause parthenogenetic reproduction in the parasitoid wasp Pingala soemius (Hymenoptera: Eulophidae). Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2589-2599 (2010).
  15. Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
  16. Cass, B. N., et al. Dynamics of the endosymbiont Rickettsia in an insect pest. Microbial Ecology. 70 (1), 287-297 (2015).
  17. Vavre, F., de Jong, J. H., Stouthamer, R. Cytogenetic mechanism and genetic consequences of thelytoky in the wasp Trichogramma cacoeciae. Heredity. 93 (6), 592-596 (2004).
  18. Cass, B. N., et al. Conditional fitness benefits of the Rickettsia bacterial symbiont in an insect pest. Oecologia. 180 (1), 169-179 (2016).
  19. Hunter, M. S., Asiimwe, P., Himler, A. G., Kelly, S. E. Host nuclear genotype influences phenotype of a conditional mutualist symbiont. Journal of Evolutionary Biology. 30, 141-149 (2017).
  20. Gottlieb, Y., et al. Inherited intracellular ecosystem: symbiotic bacteria share bacteriocytes in whiteflies. FASEB Journal. 22 (7), 2591-2599 (2008).
  21. Luan, J., Sun, X., Fei, Z., Douglas, A. E. Maternal inheritance of a single somatic animal cell displayed by the bacteriocyte in the whitefly Bemisia tabaci. Current Biology. 28 (3), 459-465 (2018).
  22. Guo, J. -Y., Cong, L., Wan, F. -H. Multiple generation effects of high temperature on the development and fecundity of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B. Insect Science. 20 (4), 541-549 (2013).
  23. Cui, X., Wan, F., Xie, M., Liu, T. Effects of heat shock on survival and reproduction of two whitefly species, Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci biotype B. Journal of Insect Science. 8 (24), (2008).
  24. Boykin, L. M. Bemisia tabaci nomenclature: Lessons learned. Pest Management Science. 70 (10), 1454-1459 (2014).
  25. Qin, L., Pan, L. -L., Liu, S. -S. Further insight into reproductive incompatibility between putative cryptic species of the Bemisia tabaci whitefly complex. Insect Science. 23 (2), 215-224 (2016).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Taux de fertilisation de l aleuroded chorionation des ufsmarquage nucl aire au DAPImicroscopie fluorescencesex ratio haplodiplo desex ratio primaireendosymbionte Rickettsiaprotocole de fixation des ufs

Articles connexes