Contrôle de Cluster cellule 3D initial dans un dispositif hybride Gel Cube modèle répétable Formations

Summary

Nous présentons une procédure pour contrôler la forme de grappe de cellule initiale dans une matrice extracellulaire 3D pour obtenir une formation de modèles reproductibles. Un dispositif cube contenant deux hydrogels différentes est utilisé pour atteindre multidirectionnel d’imagerie pour la formation de tissu motif.

Abstract

L’importance des cultures in vitro de 3D est nettement soulignée dans la culture de cellules/tissus. Toutefois, l’absence de répétabilité expérimentale est l’un des ses restrictions. Quelques résultats reproductibles de la formation détériore l’analyse les mécanismes sous-jacents à l’auto-organisation. Réduire la variation dans des conditions de culture initiale, comme la densité cellulaire et la distribution de la matrice extracellulaire (ECM), est cruciale pour améliorer la répétabilité d’une culture 3D. Dans cet article, nous démontrons une procédure simple mais robuste pour contrôler la forme de grappe de cellule initiale dans une matrice extracellulaire 3D pour obtenir des formations modèle hautement reproductible. Un micromold avec une forme désirée a été fabriqué à l’aide de la photolithographie ou un processus d’usinage, et il forma une poche 3D dans l’ECM contenue dans un cube de gel hybride (HGC). Très concentrée de cellules ont été ensuite injectés dans la poche pour que la forme des cellules cluster mis en correspondance avec la forme du moule fabriqué. Le HGC indépendant autorisés multidirectionnel le balayage par sa rotation, qui a permis d’imagerie à haute résolution et la capture de la structure du tissu entier même si une lentille de grossissement faible a été utilisée. Les cellules épithéliales bronchiques humaines normales ont été utilisés pour démontrer la méthodologie.

Introduction

L’importance d’une culture 3D, qui mieux imite des milieux biologiques que ne le fait une culture 2D, est nettement soulignée dans la culture de cellules/tissus^1,2,3. L’interaction entre les cellules et la matrice extracellulaire (ECM) fournit des indices importants au sujet de la morphogenèse^4,5. Nombreuses formations tissulaires peuvent apparaître uniquement dans des environnements 3D, comme le pliage processus^6,7, invagination⁸et for....

Protocol

1. fabrication de dispositif de cube pour le gel hybride

1. Préparer un cadre de cubes en polycarbonate (PC) à l’aide d’un procédé d’usinage ou une imprimante 3D. La taille de la trame de la PC dépend de la taille de l’échantillon. Dans cette étude, nous avons utilisé un cadre de 5 mm de chaque côté afin que les branches avaient suffisamment d’espace pour s’allonger au cours de la mise en culture.
2. Poser le cadre de la PC sur une lame de verre préalablement refroidi ou une autre surface lisse dans une glacière (< 0 ° C) (Figure 1 a).
3. Ajouter 12 µL d’agarose préchauffé de 1,5 % (p/v) de la face supérieure de l’arm....

Results

Normal humain (NHBE) les cellules épithéliales bronchiques ont été utilisés pour démontrer la méthode illustrée et contrôler la géométrie de la cellule collective initiale pour obtenir la forme d’un cylindre et une forme de prisme, respectivement dans un environnement ECM. Les résultats d’imagerie multidirectionnels obtenus par contraste de phase comme phalloïdine coloration d’une forme de cylindre (Figure 4 aB) et la forme de prisme (

Discussion

La méthode présentée dans cet article est simple et peut s’effectuer sans le matériel de haute technologie. Parallèlement, un résultat de contrôle précis cell cluster forme dans l’espace 3D d’hydrogel peut être obtenu. Après le contrôle initial, les cellules peuvent croître dans la HGC autant qu’ils sont cultivés sur un plat. L’imagerie multidirectionnelle s’effectue en faisant tourner l’échantillon avec la HGC en utilisant n’importe quel système de microscopie, et il améliore considérablement la qualité d’image. Le choi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plaque à 12 puits	Corning  ; Inc.	3513
Acétate de 2-méthoxy-1-méthyléthyle	FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.	130-10505	PGDEC, CAS : 108-65-6  ;
4 % de paraformaldéhyde	FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.	161-20141	CAS : 30525-89-4
Agarose, basse température de gélification  ; BioReagent	Sigma-Aldrich	A9414
Alexa fluor 488 phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
AZ1512	Merck
BEGM bullet kit	Lonza	CC-3170	Milieu spécialisé pour cellules NHBE
d’albumine sérique bovine (10 %)	Sigma-Aldrich	A1595
EGM-2 bullet kit	Lonza	CC-3162	Milieu spécialisé pour les cellules endothéliales
Lipidure	NOF co.		Matrice
membrane basale réduite du facteur de croissance	Matrigel Corning  ; Inc.	354230
Sérum de chèvre normal (10 %)	Thermo Fisher Scientific	50197Z
Cellules épithéliales bronchiques humaines normales	Lonza	CC-2541
SILPOT 184 W/C	Dow Corning Co.	3255981	Résine de base et catalyseur pour PDMS
SUEX D300		DJ MicroLaminates, Inc	Photorésine négative épaisse (épaisseur : 300 mm)
Triton X-100 (1 %)	Thermo Fisher Scientific	HFH10
Trypsine-EDTA (0,25 %)	Thermo Fisher Scientific	25200056
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416