Article de méthode

Un modèle d’Interface humaine hémato-encéphalique pour étudier les passages barrière de pathogènes ou de médicaments et de leurs Interactions avec le cerveau

DOI :

10.3791/59220

⸱

9 avril 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut Pasteur, CNRS UMR 3569, Unité de Neuroimmunologie Virale, 2Institut Pasteur, Unité d’Epidémiologie et de Pathophysiologie des Virus Oncogènes, Université Sorbonne Paris Cité/Paris Diderot, 3Institut Pasteur, PFIA, DTPS

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici un protocole décrivant la mise d’un cellulo en BBB (hémato-encéphalique)-culture polyester membrane poreuse Minibrain insérer le système afin d’évaluer le transport des biomolécules ou des agents infectieux à travers un BBB humain et leur impact physiologique sur les neurones voisins.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le précoce dépistage de médicaments du système nerveux sur un pertinent et fiable en modèle BBB cellulo pour leur pénétration et leur interaction avec la barrière et le parenchyme du cerveau est encore un besoin non comblé. Pour combler cette lacune, nous avons conçu un 2D dans modèle de cellulo, le BBB-Minibrain, en combinant un polyester membrane poreuse culture insert BBB modèle humain avec un Minibrain formé par une tri-culture de cellules du cerveau humain (les neurones, les astrocytes et les cellules microgliales). Le BBB-Minibrain nous a permis de tester le transport d’un candidat-médicament neuroprotecteur (p. ex., Neurovita), à travers la BHE, afin de déterminer le ciblage spécifique de cette molécule aux neurones et de montrer que la propriété neuroprotectrice de la drogue a été préservée après la drogue avait traversé la BHE. Nous avons également démontré que le BBB-Minibrain constitue un modèle intéressant pour détecter le passage de particules virales à travers la barrière des cellules endothéliales et surveiller l’infection de la Minibrain de particules virales neuro-invasive. Le BBB-Minibrain est un système fiable, facile à manipuler pour les chercheurs formés dans les techniques de culture de cellules et prédictive des phénotypes des cellules cérébrales après traitement ou une insulte. L’intérêt de tels tests cellulo serait double : introduction atténuant les étapes tôt dans le développement de médicaments d’une part et la réduction de l’utilisation d’autre part l’expérimentation animale.

Introduction

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Le cerveau est séparé de la circulation systémique par une structure non perméable qui limite les échanges entre le parenchyme du cerveau et le sang, appelée la barrière sang - encéphalique (BHE). Composée principalement de cellules endothéliales cérébrales, la BHE dynamiquement interagit avec les astrocytes, la microglie périvasculaires et neurones du parenchyme cérébrales voisines. Les trois grandes fonctions de la BHE sont la création et le maintien de l’homéostasie ionique pour les fonctions neuronales, alimentation du cerveau avec les éléments nutritifs et protection contre les lésions toxiques ou l’entrée d’agents pathogènes1,2, qui contribuent à le maintien de l’homéostasie du cerveau et ses fonctions3. Cette barrière est tellement efficace que seulement peu de médicaments peut croiser le BBB4,5. À l’heure actuelle, les méthodes disponibles pour prédire si une molécule passerez la BHE et diffuse dans le cerveau se composent d’ex vivo études sur le suivi d’image matérielle, autopsie du cerveau de volontaires humains par IRM (imagerie par résonance magnétique) ou PET (positon emission tomographie par ordinateur) ou pharmacodynamique et pharmacocinétiques études précliniques dans animaux6,7,8. Ces techniques et les modèles ont des limites, telles que la résolution limitée du PET et la faible sensibilité de MRI6,8, la difficulté de quantifier les molécules (c'est-à-dire, les molécules d’anticorps basé par exemple) que mal pénétrer le cerveau7et pour la préclinique étudie leur coût élevé et la station balnéaire de l’expérimentation animale.

Le dernier point est important parce que, selon des 3R règles, (remplacement, réduction et raffinement d’une expérimentation animale), les administrations réglementaires ont demandé que les chercheurs développent toute urgence alternative scientifiquement exacte à l’animal expérimentation9,10,11,12,13,14,15.

Au cours des dernières décennies, plusieurs modèles in vitro de BHE ont été proposées16,17,18 en cultivant sur filtre à membrane insère des cellules endothéliales de différentes espèces comme la souris, rat, bovines et porcines. Dans l’espèce humaine est, la disponibilité rare et difficile des cellules primaires a incité les chercheurs à développer des modèles humains, basés sur les cellules endothéliales immortalisées cerveau ou de cellules souches humaines issues de19,20, 21. Ces obstacles sont bon substituts in vitro de BHE à condition qu’ils expriment des marqueurs de cellules endothéliales, marqueurs de jonction serrée, transporteurs d’efflux, solutés transporteurs, récepteurs et répondre aux stimuli endothéliales 20. Quelques modèles BBB à l’aide d’inserts de membrane filtre recouvertes de cellules endothéliales et autres types de cellules (astrocytes, neurones ou péricytes22,23,24) ont été dosés. L’objectif de ces cultures co devait augmenter les caractéristiques physiques de BBB en profitant de la sécrétion de facteurs solubles par les astrocytes/neurones ou des péricytes.

Néanmoins, aucun de ces modèles inclut le parenchyme du cerveau pour étudier et prévoir le destin d’un candidat-médicament une fois qu’il a passé la barrière. Par conséquent, notre objectif était de construire un cellulo en interface hémato-encéphalique, le BBB-Minibrain, en combinant un modèle BBB et une culture de cellules cérébrales mixte dans un seul kit. Le BBB-Minibrain utilise un système de culture consistant en un filtre poreux inséré dans un puits d’une plaque de culture cellulaire multipuits. Le filtre est recouvert de cellules hCMEC/D3, une lignée de cellules endothéliales de cerveau humain qui a fait ses preuves très fiable BBB dépistage des drogues25,26,27, pour former la BHE. Le Minibrain, qui est une culture de coopération différenciée des neurones humains et astrocytes dérivés de la NTera/Cl2.D1 cellulaire ligne28,29 mélangés avec la lignée de cellules microgliales humaines CHME/Cl530 au ratio correspondant à la la microglie vs ratios de neurone-astrocytes du cerveau31, est cultivé dans la partie inférieure de la plaque bien.

Outre l’étude de passage de la drogue à travers la BHE et leur devenir dans le parenchyme, l’interface hémato-encéphalique dans cellulo modèle pourrait être un outil puissant pour traiter l’entrée d’agents pathogènes dans le cerveau (neuroinvasiveness), la dispersion dans le cerveau (neurotropisme) et la toxicité (neurovirulence) ils peuvent exercer sur les cellules de parenchyme de cerveau. Les études de Neurovirulence et neuroinvasiveness auraient bénéficier le développement d’un système efficace en cellulo modèle et est souvent préférable de remplacer les modèles animaux. À l’aide de la trousse de BBB-Minibrain32, nous avons démontré le phénotype neuro de rares mutants viraux accumulées dans la souche de virus neurotrope Français du Virus de la fièvre jaune (c.-à-d., FNV-VFJ33,34) utilisée pour préparer un arrêtée vaccin VFJ vivant et le passage d’une biomolécule neuroprotectrices et neuroregenerative appelé Neurovita (appelée NV dorénavant dans le manuscrit)35. Parce que NV ni naturellement traverse la membrane cellulaire, ni le BBB, NV a été fusionnée avec la partie variable (HHV) d’un anticorps de la seule chaîne de lamas qui traverse les membranes biologiques, y compris la BHE et fonctionne comme une cellule pénétrant la molécule (CPM)36. La propriété CPM de VHH semble dépendre le point isoélectrique et la longueur de la VHH37.

Ceci en cellulo test devrait permettre de trier les molécules qui pourraient potentiellement traverser la BHE avant exécution de pharmacocinétique et de l’analyse pharmacodynamique chez les animaux et, idéalement, dans le même temps d’être en mesure de prédire leur comportement dans le système nerveux parenchyme. Ce système est biologiquement pertinente et facile à installer et à gérer par des professionnels bien formés dans la cellule culture26,29,30,38. L’intérêt de tels tests cellulo serait double : réduire les coûts des essais précliniques d’une part et réduire l’utilisation de l’expérimentation animale en revanche.

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Protocole

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1. travaux de culture de Ntera/CL2 de cellules. D1 à préparer une co-culture de hNeurons post-mitotiques et hAstrocytes (NT2-n/a)

NOTE : Ceci est la composante de la Minibrain (Figure 1).

  1. Cultivant la Ntera/Cl2.D1
    1. Retirer un flacon de cellules congelées réservoir d’azote liquide. Rester sur la glace.
    2. Décongeler les cellules rapidement dans un bain-marie à 37 ° C.
    3. Transférer les cellules dans un tube de 15 mL contenant 10 mL de milieu DMEM F12 complet (milieu d’Eagle modifié de Dulbecco : médium F-12 mélange nutritif) additionné de 10 % sérum fœtal (SVF), 2 mM de glutamine, 100 UI de pénicilline et 100 µg streptomycine (c.-à-d., terminer Moyen de F12 DMEM).
    4. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à température ambiante (RT). Dissocier le culot dans 2 mL de milieu DMEM F12 complet.
    5. Transférer dans une fiole de vitroplants T75 en polystyrène avec un traitement spécifique pour les cellules adhérentes sensibles (T75Cell+) contenant 13 mL de milieu DMEM F12 complet.
    6. La culture de cellules dans un incubateur maintenu à 37 ° C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité jusqu’au confluent de 90 % (soit environ 5 jours). Moyen de changement tous les 2-3 jours.
  2. Repiquage de la Ntera/Cl2.D1 et l’amplification
    1. Retirez le support de la fiole.
    2. Rincer la monocouche cellulaire avec 10 mL de solution saline tampon au phosphate (PBS) additionnée de Ca2 + et Mg2 +.
    3. Rincer la monocouche cellulaire avec 10 mL de solution d’EDTA (conservée à la droite).
    4. Ajouter 3 mL de solution de trypsine-EDTA (0,05 % trypsine, 0,02 % EDTA) et incuber pendant 2 min à température ambiante.
    5. Agiter le flacon et assurez-vous que les cellules sont détachent de la surface en plastique.
    6. Ajouter 10 mL de milieu DMEM F12 complet pour inactiver la trypsine, transfert dans un tube de 15 mL et centrifuger pendant 5 min à 200 x g à température ambiante.
    7. Dissocier le culot avec 10 mL de milieu complet et utiliser 1 mL pour inoculer chaque nouveau flacon contenant 14 mL de milieu DMEM F12 complet.
      NOTE : Trente flacons T75 cellule+ sont requises pour chaque différenciation.
    8. Incuber les flacons à 37 ° C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité jusqu’au confluent de 90 %.
  3. Différenciation des NTera/Cl2.D1 en co-culture humaine neuron-astrocyte
    NOTE : Ceci est la principale composante de la Minibrain.
    1. Au jour 0, dissocier les cellules avec la trypsine-EDTA comme indiqué au point 1.2 et dissocier le culot de chaque fiole avec 2 mL de milieu DMEM F12 complet.
    2. Ajouter 1 mL de la suspension cellulaire (correspondant à 5 x 106 cellules) dans 60 boîtes de pétri en plastique de 85 mm de diamètre contenant 11 mL de milieu DMEM F12 complet.
      Remarque : Les cellules n’attachera pas au plastique et regroupent à forme pseudo neurospheres (voir la photo dans le panneau inférieur de la Figure 1). Incuber les boîtes de 60 pétri à 37 ° C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité pendant une journée.
    3. Au jour 1, ajouter 1 mL de milieu DMEM F12 complet additionné de 130 µM d’acide tout-Trans rétinoïque (ATRA) par boîte de pétri (concentration finale ATRA 10 µM) et remettez les boîtes à 37 ° C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité pendant 24 h.
    4. Au jour 2, transfert très soigneusement le support contenant sphères de cellule de chaque Petri Dish dans un tube de 50 mL et centrifuger pendant 10 min à 50 g et RT. dissocier soigneusement le culot lâche avec 13 mL de milieu DMEM F12 complet additionné de 10 µM ATRA et ajouter th e 13 mL dans un diamètre de 85 mm nouvelle boîte de pétri.
      Remarque : Sur les différents passages, il est extrêmement important de maintenir la densité de sphères aussi élevée que la densité obtenue au jour 2 (c'est-à-dire, autour d’une densité de 70 %). Par conséquent, si la densité de la sphère est abaissant, réduire le nombre total des boîtes de pétri selon le nombre de cellules.
    5. Répétez la procédure ci-dessus (étape 1.3.4) 4, 6 et 8 jours.
    6. Au jour 10, répétez la procédure ci-dessus, mais les sphères s’ajoute les fioles T75 cellule+ au lieu de boîtes de pétri. Ajouter les cellules d’une boîte de pétri pour un flacon de T75 cellulaire+ .
    7. À 11 jours, 13, 15 et 17, changer le milieu utilisé avec 14 mL de F12 de DMEM complet additionné de 10 µM ATRA.
    8. Au jour 19, changer de moyen de 14 mL de milieu DMEM F12 complet, sans ATRA par flacon.
    9. Au jour 20, dissocier les cellules avec la trypsine/EDTA comme suit doucement.
      1. Pour chaque flacon de T75 cellulaire+ , rincer les cellules avec 10 mL de PBS additionné de Ca2 + et Mg2 +; incuber les cellules avec 4 mL d’EDTA pendant 5 min à température ambiante.
      2. Enlever soigneusement l’EDTA et ajouter 2 mL de trypsine-EDTA et incuber à 7 min à RT. agiter doucement le flacon et ajouter soigneusement 8 mL de milieu DMEM F12 complet.
      3. Centrifuger 10 min à 160 x g et RT. dissocier le culot cellulaire en 13 mL de milieu DMEM F12 complet et transfert dans une fiole de cellule T75+ .
        NOTE : La dissociation très douce avec la trypsine-EDTA permettra de récupérer l’ATRA différenciés de cellules des cellules tératocarcinome original, qui sont très attachés à la vaisselle en plastique.
    10. Au jour 21, retirez le support et les cellules mortes. Ajouter 14 mL de milieu DMEM F12 complet additionné de 5 % FBS, 2 mM de glutamine, la pénicilline 100 UI, 100 µg streptomycine et 0,5 µM de AraC (Cytosine-β-D-arabinofuranoside) (toutes les 5 % FBS DMEM F12-AraC).
    11. À 23 jours, 25 et 28, remplacer utilisé médium avec 14 mL de 5 % FBS DMEM F12-AraC.
    12. À 29 jours jusqu'à 49 (tous les deux jours), remplacer utilisé médium avec 14 mL de milieu DMEM F12 complet additionné de sérum de veau fœtal 5 %, 2 mM de glutamine, 100 UI de pénicilline, 100 µg streptomycine, 5 µM de FudR (5-fluoro-2' désoxyuridine) et 10 µM Urd (Uridine) (complet 5 % FBS DMEM F12-FudR-Urd).
    13. À jour 50, moyen de remplacement utilisé avec 14 mL de milieu DMEM F12 complet additionné de 5 % FBS, 2 mM de glutamine, 100 UI de pénicilline, 100 µg streptomycine et 10 µM Urd (toutes les 5 % FBS DMEM F12-Urd).
    14. 51 jours jusqu'à 95 (deux fois par semaine), remplacer utilisé médium avec 14 mL complet 5 % FBS DMEM F12-Urd.
      Remarque : Les cellules peuvent être utilisés pour des expériences de jour 51 mais pas plus tard que jour 95. L’utilisation de traitements de série avec des inhibiteurs de la mitose permet de récupérer une population pure de co-culture de hNeuron post-mitotique et hAstrocytes (NT2-n/a).
    15. Pour amorcer les cellules, procédez avec douce trypsinisation comme pour 20 jours.

2. cellule culture travail des microglies humaines cellules CHME/Cl5

NOTE : Ceci est la composante microgliale de la Minibrain (Figure 1).

  1. Cultivant les microglies humaines cellules CHME/Cl5
    1. Retirer un flacon de cellules congelées dans le réservoir d’azote liquide. Rester sur la glace.
    2. Décongeler rapidement dans un bain-marie à 37 ° C.
    3. Transférer les cellules dans un tube de 15 mL contenant 10 mL de milieu DMEM F12 complet additionné de sérum de veau fœtal 5 %, 2 mM de glutamine, 100 UI de pénicilline et 100 µg streptomycine (c.-à-d. milieu complet 5 % FBS DMEM F12).
    4. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à RT. dissocier le culot avec 2 mL de milieu de FBS DMEM F12 complet 5 %.
    5. Transférer dans un ballon T75 cellule+ 13 mL de milieu de FBS DMEM F12 complet 5 %.
    6. Cellules de culture à 37 ° C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité jusqu’au confluent de 90 %. Moyen de changement tous les 2-3 jours.
  2. Repiquage des cellules microgliales humaines CHME/Cl5
    1. Enlever moyen du flacon.
    2. Rincer la monocouche cellulaire avec 10 mL de PBS additionné de Ca2 + et Mg2 +.
    3. Rincer la monocouche cellulaire avec 10 mL de solution d’EDTA (conservée à la droite).
    4. Ajouter 3 mL de solution de trypsine-EDTA et incuber pendant 2 min à température ambiante.
    5. Agiter le flacon et assurez-vous que les cellules sont détachent de la surface en plastique.
    6. Ajouter 10 mL de milieu de FBS DMEM F12 complet 5 % pour inactiver la trypsine, transfert dans un tube de 15 mL et centrifuger pendant 5 min à 200 x g et RT.
    7. Dissocier le culot avec 10 mL de milieu complet et utiliser 1 mL pour inoculer chaque nouveau flacon contenant 14 mL de milieu de FBS DMEM F12 complet 5 %.
    8. Incuber les flacons à 37 ° C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité jusqu’au confluent de 90 %.

3. culture de travail avec le hCMEC/D3 pour enrober les insertions poreuses et préparer les BBB

  1. Culture de cellules endothéliales humaines hCMEC/D3 (Figure 2)
    1. Diluer le type j’ai rat collagène à 01:30 par pure eau stérile (grade de culture cellulaire).
    2. Transférer 10 mL dans une fiole de cellule T75+ et incuber pendant 2 heures dans un incubateur d’humidité de 95 % de 37 ° C et 5 % de CO2 .
    3. Enlever la solution de collagène et remplacez-le par 15 mL de milieu de cellules endothéliales additionné de 10 mM de l’HEPES (appelé milieu cellulaire endothéliale complet).
    4. Retirer un flacon de cryo de cellules dans le réservoir d’azote liquide. Rester sur la glace.
      Remarque : Les cellules ont été cultivés, et un lot de semences a été effectué comme indiqué par le fabricant. La lignée cellulaire est couvert par un accord de transfert de matériel biologique. Les cellules sont obtenus au passage 25 et ne doivent pas être utilisés au-delà de passage 35.
    5. Décongeler rapidement dans un bain-marie à 37 ° C.
    6. Transférer les cellules dans le flacon de T75 cellulaire+ et renvoyer le ballon à 37 ° C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité pendant 2 à 4 h.
    7. Retirez délicatement le support sans perdre ni enlever les cellules. Rincer les cellules une fois avec 10 mL de milieu cellulaire endothéliale complet.
    8. Ajouter 15 mL de milieu de cellules endothéliales complet.
    9. Cellules de culture à 37 ° C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité jusqu’au confluent de 100 % (pas moins de 4 jours) sans changer le support.
  2. Repiquage hCMEC/D3 afin de préparer l’insertion de la BHE
    1. Enduire un nouveau flacon de T75 cellulaire+ ou insère avec le type j’ai Rat collagène tel que décrit ci-dessus (étape 3.1).
    2. Retirez le support de la fiole. Rincer la monocouche cellulaire avec 10 mL de PBS additionné de Ca2 + et Mg2 +.
    3. Ajouter 2 mL de solution de trypsine-EDTA et incuber 5 min à 37 ° C.
    4. Agiter le flacon et s’assurer que les cellules sont complètement détachés de la surface en plastique.
    5. Ajouter 4 mL de milieu de cellules endothéliales complet pour inactiver la trypsine.
    6. Avec une pipette en plastique de 5 mL, mécaniquement se dissocient les cellules en aspirant et en aspergeant la suspension cellulaire tout en gardant la pipette 5 mL au fond de la fiole au moins 5 fois.
    7. Compter les cellules et utilisation de 5 x 104 cellules/insérer pour une culture de membrane bien polyester 12 inserts insert et 2 x 106 cellules pour un flacon de T75 cellulaire+ . Préparer également trois filtres sans cellules pour les expériences de PELy (c.-à-d., perméabilité de cellules endothéliales à Lucifer jaune voir paragraphe 4.2) avec les inserts de culture de membrane de Polyester.
    8. Incuber les flacons ou insertions à 37 ° C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité jusqu’au confluent de 100 %.
    9. Ne modifiez pas le support pour flacon T75 cellulaire+ jusqu'à un nouveau passage. Au contraire pour BBB sur la culture de la membrane polyester inserts : changement moyen 2 et 4 jours, utilisez le BBB pour les expériences au jour 6.

4. construction et contrôle de la qualité de la BBB-Minibrain (Figure 2)

  1. Mise en place d’un Polyester de BBB-Minibrain culture de membrane insérez périphérique (Figure 2 b)
    1. Cultiver les cellules hCMEC/D3 sur 12 bien Polyester culture membrane insérer des filtres pour 6 jours sur un milieu cellulaire endothéliale avant de les utiliser pour l’expérience.
    2. Recouvrir une plaque 12 puits avec poly-D-lysine (1 mL/puits, 10 µg/mL, 4 h à RT) puis la laminine (1 mL/puits, 1 µg/mL, du jour au lendemain à RT).
    3. Retirer la laminine et ajouter 1 mL de milieu de cellules endothéliales additionné de 5 % SVF (moyenne de 5 % des cellules endothéliales).
    4. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité.
    5. Doucement, trypsinize le NT2-s/o (comme indiqué au point 1.3.9) et CHME/Cl5 (comme indiqué au point 2.2) et dissocier les granules cellulaires avec support complet de cellules endothéliales.
    6. Compter les cellules, mix 3,6 x 105 NT2-s/o et 0,4 x 105 CHME/Cl5 cellules/puits et plaque bien graine le 12.
    7. À T = 24 h (24 h après l’ensemencement) : changer le milieu utilisé avec milieu frais complet cellules endothéliales (cellules Minibrain et des cellules endothéliales) et transférer le filtre à insérer la culture hCMEC/D3 Polyester membrane sur le dessus des cellules Minibrain. Incuber à 37 ° C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité le BBB-Minibrain.
      Remarque : Le BBB-Minibrain sera ensuite composé d’une couche de cellules endothéliales humaines hCMEC/D3 sur filtre isoler le compartiment Luminale (ou compartiment de « sang ») et d’une culture mixte de cellules humaines hNT2-s/o et hCHME/Cl5 (Minibrain) au bas de la définition bien le compartiment d’abluminal (ou compartiment « cerveau ») (Figure 2 b).
  2. Validation de la perméabilité endothéliale de la BBB-Minibrain (contrôle de la qualité) (Figure 2)
    1. Préparer le tampon de transport (TB), qui est un tampon HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) avec Ca2 + et Mg2 + additionné de pyruvate de sodium HEPES et 1 mM de 10 mM.
    2. Préparer 12 assiettes bien avec 1,5 mL de tampon de transport / puits.
    3. À T = 0, rendre frais tampon transport additionné de 50 µM jaune Lucifer (LY-TB).
    4. Inverser chaque filtre à l’envers pour enlever avec précaution le milieu sans affecter la barrière cellulaire endothéliale.
    5. Placer le filtre sur la plaque bien 12 rempli et ajouter 0,5 mL de LY-TB.
    6. Incuber les boîtes dans un incubateur à 37° C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité.
    7. À T = 10 min de transfert, les filtres sur les nouveaux cas de tuberculose rempli 12 assiettes bien et garder le compartiment abluminal de la première plaque pour la lecture de l’OD.
    8. À T = 25 min, répétez l’étape 4.2.7.
    9. À T = 45 min, arrêter le transport en enlevant les filtres des plaques. Garder abluminal et compartiments luminales des mesures OD.
    10. Transfert dans un sombre 96 plaques bien les échantillons : 10 µL avec 190 µL TB pour le LY-TB et les compartiments luminales, 200 µL de l’échantillon pour les compartiments d’abluminal.
    11. Mesurer la fluorescence de la LY-TB présents dans les différents échantillons à λ428 nm λ535 nm (longueur d’excitation et d’émission des ondes respectivement).
    12. Calculer la perméabilité endothéliale (Pe) vers LY-TB (PeLY) selon Siflinger-Birnboim, A et coll. (1987),39 et Da Costa, A et coll. (2018)34 en utilisant la formule :
      1/EP = (1/PSt) – (1/PSf) et PeLY= PSe/S.
      NOTE : PSf est la perméabilité du filtre sans cellules, PSt est la perméabilité du filtre avec cellules, PSe est la perméabilité du temps monocouche endothéliale la surface de la monocouche, S est la surface de la monocouche (pour un filtre bien 12 = 1,12 cm2 ), PeLY est exprimée en cm/min. Pour hCMEC/D3 le PeLY devrait se situer entre 0,7 et 1,2 x 10-3 cm/min en fonction principalement de la FBS utilisés dans les expériences. Important : un PeLY supérieure à 1,2 signifie que le BBB n’est pas assez serré et quelques fuites peuvent être observés. Jetez ces obstacles.

5. utilisation de BBB-Minibrain pour mettre en évidence la présence de particules virales neuro-invasive dans un échantillon de vaccin fièvre jaune Virus, le virus neurotrope Français, VFJ-FNV 34 (Figure 3)

  1. Passage de BBB et la multiplication du virus de la fièvre jaune dans le Minibrain
    1. Utilisez le BBB-Minibrain préparé comme indiqué au point 4.1.7 24h avant l’ajout du virus ; Remplacez le support par support de cellules endothéliales BF 2 %.
      Remarque : Il est très important éviter de changer le support juste avant l’ajout du virus. Changer le milieu peut activer les cellules endothéliales humaines et transitoirement ouvrir la barrière qui permettra le passage du virus. Ici, le milieu est changé 24h avant de commencer l’expérience.
    2. À T = 0, ajouter Plaque 3500 du unités formant (PFU) de VFJ-FNV dilué dans 50 µL de 2 % moyenne de cellules endothéliales FBS très soigneusement sur le dessus du compartiment luminal. Le contrôle BBB-Minibrain est inoculé avec 50 µL de milieu de cellules endothéliales de FBS de 2 % sans virus. Déterminer PeLY compagnon bien.
    3. Incuber le BBB-Minibrain dans un incubateur à 37 ° C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité.
    4. Après 24h, retirez le dispositif de filtre membrane polyester culture insertions et déterminer PeLY, échantillon 1 mL du compartiment abluminal et titrer le virus tel que décrit par A. da Costa et coll. (2018)34. Remplacez le milieu par milieu de cellules endothéliales frais 2 % FBS.
    5. Incuber à 37 ° C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité le BBB-Minibrain.
    6. Après 72 h, goûter le milieu du compartiment abluminal et titrer le virus et/ou d’extraire l’ARN des cellules Minibrain pour l’analyse de l’expression génique tel que décrit par A. da Costa et coll. (2018)34.
  2. Amplification des variantes neurotropes VFJ-FNV sur les cellules de Minibrain de passages serial
    1. Utilisation Minibrain cellules enduites de 12 plaques de puits (c.-à-d. les étapes 4.1.6 et 4.1.7).
    2. Lors du point 0 h, ajouter 3 500 Plaque formant des unités de VFJ-FNV dilué dans 50 µL de milieu de cellules endothéliales BF 2 % très soigneusement sur le dessus des cellules (compartiment Luminale).
    3. Après 1 h, supprimez le milieu avec l’inoculum de virus et remplacez-les par un milieu frais 2 % FBS cellules endothéliales.
    4. Après 48 h, 500 µL de milieu de culture de l’échantillon et infecter des cellules fraîches de Minibrain
    5. Après 120 h, 500 µL de milieu de culture de l’échantillon et infecter des cellules fraîches de Minibrain.
    6. Après 192 h, sauver le milieu de culture (= stock de virus enrichie) et extraire l’ARN des cellules Minibrain pour l’analyse de l’expression génique tel que décrit par A. da Costa et coll. (2018)34.

6. utilisation du BBB-Minibrain pour étudier le passage de BBB et ciblant les cellules cérébrales d’une biomolécule

  1. Transport à travers la BHE d’un neurone ciblant la biomolécule
    1. Utiliser le Minibrain-BBB préparé comme décrit étape 4.1.7.
    2. Le moment 0 h, ajouter la biomolécule (dans l’exemple fourni dans la section résultats, 58.75 ng/BBB des molécules cellulaires perméants NeuroTag-NV ont été ajoutés par BBB-Minibrain insérer.
    3. Incuber à 37 ° C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité le BBB-Minibrain.
    4. Après 24h, retirez le dispositif de filtre membrane polyester culture insertions et déterminer PeLY, puis colorer les cellules Minibrain pour hNeurons de neurofilaments Nf200 et détecter la présence de la biomolécule dans le Minibrain (dans l’exemple fourni dans le résultat section, NeuroTag-NV a été détectée à l’aide d’un anticorps dirigé contre le streptocoque-Tag qu'il contient35,40.)
  2. Transport à travers la BHE d’une biomolécule neuroregenerative et dosage neuroprotecteurs ultérieures dans la Minibrain après que la biomolécule a traversé le BBB
    1. Utiliser le Minibrain-BBB préparé comme indiqué au point 4.1.7.
      Remarque : Pour les molécules ciblant uniquement les neurones, les cellules de Minibrain peuvent être remplacés par les cellules (NT2-N) de neurones seulement38.
    2. Le moment h 0, ajouter 58.75 BBB-ng/Minibrain bien des cellules perméants NV molécules (forme active CPM-NeuroTag-NV, inactifs forme CPM-NeuroTag-NVΔ) décrit par C. Prehaud et coll. (2014)35.
    3. Incuber le BBB-Minibrain dans un incubateur à 37 ° C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité.
    4. Après 4 h, faire des blessures d’individu avec une aiguille d’injection (26GX1/2 ", 12-4.5, Terumo, Belgique) sur les cellules Minibrain. Faire au moins 10 rayures sur chaque individu bien. Déterminez bien PeLY sur le compagnon.
    5. Incuber le BBB-Minibrain dans un incubateur à 37 ° C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité.
    6. Après 8 h, remplacer le support dans le compartiment d’abluminal par un milieu frais cellulaire endothéliale complet.
      Remarque : Il est important de remplacer le support à cette étape car la blessure des cellules Minibrain peut conduire à la mort des cellules, puis la libération des composés cytotoxiques.
    7. Incuber le BBB-Minibrain dans un incubateur à 37 ° C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité.
    8. Après 48 h, colorent les cellules pour la régénération axonale de hNeurons tel que décrit par C. Prehaud et coll. (2013)40.

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Résultats

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Le BBB-Minibrain est un cellulo in experimental modèle d’interface hémato-encéphalique.

Le BBB-Minibrain est configuré sur le système d’insertion de culture membrane polyester pour imiter un sang au niveau supérieur et un habitacle de cerveau au niveau inférieur de l’interface sang-cerveau (Figure 2 aB). Il se compose d’un compartiment luminal avec les cellules endo...

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Discussion

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Dans cet article nous montre comment construire un cellulo en interface hémato-encéphalique, le BBB-Minibrain, en combinant un modèle BBB et une culture de mélangé cerveau cellules cérébrales (Minibrain) dans un seul kit. Ce système est biologiquement pertinente, facile à installer et à gérer pour les expérimentateurs bien formés en culture cellulaire.

Comme pour tout autre modèle in vitro de BHE, on obtiendrait des résultats fiables si drastique contrôle de l’étanchéité de la barrière est app...

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Déclarations de divulgation

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La propriété intellectuelle du système était les brevets référencés dans 32, 35 et 38.

Remerciements

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Cette étude a été financée par des subventions internes de l’Institut Pasteur, y compris une subvention Incitative (PTR 435) et par une subvention accordée « Contrat de Soutien à la Recherche » par Sanofi Pasteur à l’Institut Pasteur. A. da Costa a été appuyée par la subvention de Sanofi-Pasteur et Florian Bakoa est récipiendaire d’une bourse de doctorat fournie par l’ANRT (Association Nationale de la Recherche et de la Technologie). Nous sommes reconnaissants au Pr Pierre-Olivier Couraud et Dr Florence Miller pour discussions utiles.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaques 12 puitsCorning3336
5-fluoro-2' déoxyuridineMerck-Sigma AldrichF0503
85mm Boîte de PétriSarstedt83-3902-500
Anti-NF200Merck-Sigma AldrichN4142
&beta ;-mercapto-ethanolMerck-Sigma AldrichM3148
CHME/Cl5Unité ; de Neuroimmunologie ViraleSur demande au Dr Lafon
CMCCalbiochem217274
Cytosine &beta ;-D-arabinofuranosideMerck-Sigma AldrichC1768
Dark 96 plaques de puitsCorning3915
DMEM F12Thermofisher Scientific31330-038
DMSOMerck-Sigma AldrichD2650
Endogro IVMilliporeSCME004milieu cellulaire endothélial
ÉthanolCarlo Erba529121
FBSHycloneSV30015-04
FormaldéhydeMerck-Sigma Aldrich252549
GIEMSARAL Diagnostic320310
Chèvre-Anti SourisJackson Immuno Research115-545-003
Chèvre-Anti LapinThermofisher ScientificR37117
HBSS avec Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14025-100
hCMEC/D3CedarlaneCLU512
Hepes 1MThermofisher Scientific15630-070
Hoescht 33342Merck-Sigma Aldrich33263
LaminineMerck-Sigma AldrichL6274
L-glutaminThermofisher Scientific25030-024
Lucifer YellowMerck-Sigma AldrichL0259
MEM 10XThermofisher Scientific21430
MEM 1XThermofisher Scientific42360
Ntera/Cl2D.1ATCCCRL-1973
ParaformaldéhydeMicroscopie électronique Sciences15714
PBS sans Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14190
PBS-Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14040-091
Pen/StrepEurobioCXXPES00-07
Poly-d-LysineMerck-Sigma AldrichP1149
Prolong GoldThermofisher ScientificP36930
QiashredderQIAGEN79656
Collagène de rat ICultrex3443-100-01
Acide rétinoïque All-TransMerck-Sigma AldrichR2625
Kit de purification de l’ARNQIAGEN74104
SDSMerck-Sigma AldrichL4509
Bicarbonate de sodium 5.6 %EurobioCXXBIC00-07
Pyruvate de sodiumThermofisher Scientific11360
T75 Cell+ FlaskSarstedt83-1813-302Flacon en polystyrène pour culture tissulaire avec traitement de surface spécifique (Cell+) pour cellules adhérentes sensibles
TranswellCorning3460inserts de culture à membrane poreuse
polyester Trypsin-EDTAMerck-Sigma AldrichT3924
Eau Ultra PureThermofisher Scientific10977-035
UridineMerck-Sigma AldrichU3750
VerseneThermofisher Scientific15040-033EDTA
YFV-FNVIP DakarFlacon de
vaccin

Références

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Mod le de la barri re h mato enc phaliqueMod le humain de la BHECulture de mini cerveauPerm abilit des cellules endoth lialesTransport du jaune de lucif rineD tection du passage viralTransport du m dicament NeurovitaBiomol cule de ciblage neuronalCellules endoth liales microvasculaires c r bralesInsert de culture membrane de polyester

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