Visualisation du sillon oculaire supérieure durant l’embryogenèse Danio rerio

Résumé

Nous présentons ici une série standardisée des protocoles d’observer le sillon oculaire supérieur, une structure récemment identifiés, évolutivement conservée dans le œil de vertébrés. À l’aide de larves de poisson zèbre, nous démontrons techniques nécessaires pour identifier les facteurs qui contribuent à la formation et la fermeture du sillon oculaire supérieur.

Résumé

Colobome oculaire congénital est une maladie génétique qui est généralement observée comme une fissure dans l’aspect inférieur de le œil résultant de la fermeture incomplète fissure choroïde. Récemment, l’identification des individus avec colobome dans l’aspect supérieur de l’iris, rétine et lentille a conduit à la découverte d’une nouvelle structure, dénommée la fissure supérieure ou sillon oculaire supérieur (SOS), qui est transitoirement présent sur la partie dorsale aspect de la cupule optique au cours du développement de le œil de vertébrés. Bien que cette structure est conservée à travers la souris, poulet, poisson et newt, notre compréhension actuelle du re est limitée. Afin d’élucider les facteurs qui contribuent à sa formation et de la fermeture, il est impératif de pouvoir observer et identifier les anomalies, tels que le retard dans la fermeture du re. Ici, nous avons décidé de créer une série normalisée de protocoles qui permet de visualiser efficacement le SOS en combinant des techniques de microscopie largement disponibles avec des techniques de biologie moléculaire commun tels que la coloration par immunofluorescence et ARNm surexpression. Bien que cet ensemble de protocoles porte sur la possibilité d’observer le retard de fermeture de SOS, il s’adapte aux besoins de l’expérimentateur et peut être facilement modifié. Dans l’ensemble, nous espérons créer une méthode accessible à travers lequel notre compréhension du re peut être avancée afin d’élargir les connaissances actuelles du développement de le œil de vertébrés.

Introduction

La formation de le œil de vertébrés est un processus hautement conservé dans lequel les voies de signalisation intercellulaires soigneusement orchestrées établissent les types de tissus et spécifient l’identité régionale¹. Perturbations au début morphogenèse oeil entraîner des défauts profonds à l’architecture de le œil et sont fréquemment aveuglantes². Une telle maladie résulte de l’omission de fermer la fissure choroïde oculaire dans la partie ventrale de la cupule optique³. Cette affection, appelée colobome oculaire, est estimée à se produire dans 1 sur 4-5000 naissances vivantes et cause 3 à 1....

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’Université de l’Alberta animalier et Comité d’urbanisme.

1. le protocole 1 : Visualisation de SOS à l’aide de stéréomicroscopie et imagerie (DIC) de contraste interférentiel différentiel

1. Collecte des embryons
   1. Dans un réservoir d’eau déchlorée, préparer des croisements de gdf6a^+/- zebrafish le soir en couplant un poisson-zèbre mâle avec une femelle poisson-zèbre. N’oubliez pas de séparer le mâle de la femelle à l’aide d’un diviseur pour s’assurer que les embryons sont nés dans une gamme limitée de temps.
   2. Le lendemain matin, enlever l’et....

Résultats

Le poisson-zèbre SOS apparaît à 20 hpf dans la rétine dorsale présomptive⁸. Par 23 hpf le SOS transitions de son architecture initiale étroit à une large échancrure et 26 hpf, il n’est donc plus visible⁸. Par conséquent, afin d’examiner le SOS au cours du développement d’oeil de poisson zèbre normal, les embryons doivent être observées entre hpf 20-23. Durant cette période, le SOS est observable par le microscope à dissection et imagerie DIC.......

Discussion

Nous présentons ici une série standardisée des protocoles d’observer les SOS dans l’embryon de poisson zèbre en développement. Pour déterminer les phénotypes de retard fermeture, nos protocoles ont mis l’accent sur la capacité de distinguer la séparation de deux lobes distincts des côtés dorsal-nasal et dorsale-temporal de le œil, semblable aux techniques permettant de visualiser le retard de fermeture de fissure choroïde phénotypes dans l’oeil ventral.

Ces techniques de visualisation peuvent .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1-phényle 2-thiourée	Sigma Aldrich	P7629-10G
Boîte de Pétri de 100 mm	Fisher Scientific	FB0875713 Boîte de
Pétri de 35 mm	Corning	CLS430588
Agarose	BioShop Canada Inc.	AGA001.1
Albumine sérique bovine	Sigma Aldrich	A7906-100G
Microscope DIC/Fluorescence	Zeiss	AxioImager Z1
Microscope de dissection	Olympus	SZX12
Caméra de microscope de dissection	Qimaging	MicroPublisher 5.0 RTV
Dow Corning Graisse sous vide	poussé Fisher Scientific	14-635-5D
Ethyl 3-aminobenzoate de méthanesulfonate sel (Tricaïne)	Sigma Aldrich	A5040-25G
Chèvre anti-lapin Alexa Fluor 488	Abcam	ab150077
Sérum de chèvre	Sigma Aldrich	G9023
Logiciel de capture d’image	Zeiss	ZEN
Incubateur	VWR	Modèle 1545
Couvercle de microscope en verre (22 mm x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542B
Lame de microscope	Fisher Scientific	12-544-2
Broche minutien	Fine Science Tools	26002-10
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit	Invitrogen	AM1340
NotI	New England Biolabs	R0189S
Paraformaldéhyde ( PFA)	Sigma Aldrich	P6148-500G
Phénol :Chloroforme :Alcool isoamylique pH 6,7 +/- 0,2	Fisher Scientific	BP1752-100
Protéinase K	Sigma Aldrich	P4850
Anticorps anti-laminine de lapin	Millipore Sigma	L9393
TURBO Dnase (2 U/µ ; L)	Invitrogen	AM2238
Agarose ultrapure à faible point de fusion	Invitrogen	16520-100
Sulfate de dodécyle de sodium ultra-pur (SDS)	Invitrogen	15525017