Article de méthode

Visualisation du sillon oculaire supérieure durant l’embryogenèse Danio rerio

DOI :

10.3791/59259

27 mars 2019

Dans cet article

Résumé

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Nous présentons ici une série standardisée des protocoles d’observer le sillon oculaire supérieur, une structure récemment identifiés, évolutivement conservée dans le œil de vertébrés. À l’aide de larves de poisson zèbre, nous démontrons techniques nécessaires pour identifier les facteurs qui contribuent à la formation et la fermeture du sillon oculaire supérieur.

Résumé

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Colobome oculaire congénital est une maladie génétique qui est généralement observée comme une fissure dans l’aspect inférieur de le œil résultant de la fermeture incomplète fissure choroïde. Récemment, l’identification des individus avec colobome dans l’aspect supérieur de l’iris, rétine et lentille a conduit à la découverte d’une nouvelle structure, dénommée la fissure supérieure ou sillon oculaire supérieur (SOS), qui est transitoirement présent sur la partie dorsale aspect de la cupule optique au cours du développement de le œil de vertébrés. Bien que cette structure est conservée à travers la souris, poulet, poisson et newt, notre compréhension actuelle du re est limitée. Afin d’élucider les facteurs qui contribuent à sa formation et de la fermeture, il est impératif de pouvoir observer et identifier les anomalies, tels que le retard dans la fermeture du re. Ici, nous avons décidé de créer une série normalisée de protocoles qui permet de visualiser efficacement le SOS en combinant des techniques de microscopie largement disponibles avec des techniques de biologie moléculaire commun tels que la coloration par immunofluorescence et ARNm surexpression. Bien que cet ensemble de protocoles porte sur la possibilité d’observer le retard de fermeture de SOS, il s’adapte aux besoins de l’expérimentateur et peut être facilement modifié. Dans l’ensemble, nous espérons créer une méthode accessible à travers lequel notre compréhension du re peut être avancée afin d’élargir les connaissances actuelles du développement de le œil de vertébrés.

Introduction

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La formation de le œil de vertébrés est un processus hautement conservé dans lequel les voies de signalisation intercellulaires soigneusement orchestrées établissent les types de tissus et spécifient l’identité régionale1. Perturbations au début morphogenèse oeil entraîner des défauts profonds à l’architecture de le œil et sont fréquemment aveuglantes2. Une telle maladie résulte de l’omission de fermer la fissure choroïde oculaire dans la partie ventrale de la cupule optique3. Cette affection, appelée colobome oculaire, est estimée à se produire dans 1 sur 4-5000 naissances vivantes et cause 3 à 1....

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Protocole

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Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’Université de l’Alberta animalier et Comité d’urbanisme.

1. le protocole 1 : Visualisation de SOS à l’aide de stéréomicroscopie et imagerie (DIC) de contraste interférentiel différentiel

  1. Collecte des embryons
    1. Dans un réservoir d’eau déchlorée, préparer des croisements de gdf6a+/- zebrafish le soir en couplant un poisson-zèbre mâle avec une femelle poisson-zèbre. N’oubliez pas de séparer le mâle de la femelle à l’aide d’un diviseur pour s’assurer que les embryons sont nés dans une gamme limitée de temps.
    2. Le lendemain matin, enlever l’et....

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Résultats

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Le poisson-zèbre SOS apparaît à 20 hpf dans la rétine dorsale présomptive8. Par 23 hpf le SOS transitions de son architecture initiale étroit à une large échancrure et 26 hpf, il n’est donc plus visible8. Par conséquent, afin d’examiner le SOS au cours du développement d’oeil de poisson zèbre normal, les embryons doivent être observées entre hpf 20-23. Durant cette période, le SOS est observable par le microscope à dissection et imagerie DIC.......

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Discussion

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Nous présentons ici une série standardisée des protocoles d’observer les SOS dans l’embryon de poisson zèbre en développement. Pour déterminer les phénotypes de retard fermeture, nos protocoles ont mis l’accent sur la capacité de distinguer la séparation de deux lobes distincts des côtés dorsal-nasal et dorsale-temporal de le œil, semblable aux techniques permettant de visualiser le retard de fermeture de fissure choroïde phénotypes dans l’oeil ventral.

Ces techniques de visualisation peuvent .......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun intérêt en conflit de déclarer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par les instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), Sciences naturelles et Conseil de recherches en génie (CRSNG), Alberta Innovates Technology Futures et les femmes et Health Research Institute (WCHRI enfants).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1-phényle 2-thiouréeSigma AldrichP7629-10G
Boîte de Pétri de 100 mmFisher ScientificFB0875713 Boîte de
Pétri de 35 mmCorningCLS430588
AgaroseBioShop Canada Inc.AGA001.1
Albumine sérique bovineSigma AldrichA7906-100G
Microscope DIC/FluorescenceZeissAxioImager Z1
Microscope de dissectionOlympusSZX12
Caméra de microscope de dissectionQimagingMicroPublisher 5.0 RTV
Dow Corning Graisse sous videpoussé Fisher Scientific14-635-5D
Ethyl 3-aminobenzoate de méthanesulfonate sel (Tricaïne)Sigma AldrichA5040-25G
Chèvre anti-lapin Alexa Fluor 488Abcamab150077
Sérum de chèvreSigma AldrichG9023
Logiciel de capture d’imageZeissZEN
IncubateurVWRModèle 1545
Couvercle de microscope en verre (22 mm x 22 mm)Fisher Scientific12-542B
Lame de microscopeFisher Scientific12-544-2
Broche minutienFine Science Tools26002-10
mMessage mMachine Sp6 Transcription KitInvitrogenAM1340
NotINew England BiolabsR0189S
Paraformaldéhyde ( PFA)Sigma AldrichP6148-500G
Phénol :Chloroforme :Alcool isoamylique pH 6,7 +/- 0,2Fisher ScientificBP1752-100
Protéinase KSigma AldrichP4850
Anticorps anti-laminine de lapinMillipore SigmaL9393
TURBO Dnase (2 U/µ ; L)InvitrogenAM2238
Agarose ultrapure à faible point de fusionInvitrogen16520-100
Sulfate de dodécyle de sodium ultra-pur (SDS)Invitrogen15525017
Boîte de Pétri

Références

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  1. Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).
  2. Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
  3. Gr....

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Mots-clés

Embryogen se du poisson z bremarquage immunofluorescentsurexpression d ARNmcontraste d interf rence diff rentielmicroscopie confocalemicroscopie de dissectionmarquage la laminineexpression de la GFP CAXretard de fermeture du SOS

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