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Modèle de matrice extracellulaire OS en trois dimensions pour l’ostéosarcome

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DOI :

10.3791/59271

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12 avril 2019

 ,  , 
1MOE Key Laboratory of Gene Function and Regulation, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University

Auteurs correspondants : Yan Zhang <zhang39@mail.sysu.edu.cn>

Dans cet article

Résumé

Le modèle de la matrice extracellulaire (BEM) OS pour l’ostéosarcome (OS) est bien établie et illustré ici. Il peut être utilisé comme un échafaudage approprié pour imiter tumeur primitive la croissance in vitro et fournissant un modèle idéal pour l’étude de l’hétérogénéité histologique et cytogéniques des OS.

Résumé

L’ostéosarcome (OS) est le plus commun et une tumeur osseuse primaire très agressifs. Il est caractérisé par des variations anatomiques et histologiques avec les difficultés diagnostiques et pronostiques. OS compose de cellules cancéreuses génotypiquement et phénotypiquement hétérogènes. Éléments du microenvironnement osseux sont prouvés pour tenir compte de l’hétérogénéité et la maladie de la progression tumorale. La matrice osseuse extracellulaire (BEM) conserve les matrices de microstructures et les composantes biochimiques de la matrice extracellulaire native. Ce créneau spécifique des tissus fournit un échafaudage favorable et à long terme de prolifération et de cellules d’OS ensemencement. Cet article fournit un protocole pour la préparation du modèle BEM et son application la plus expérimentale. Cellules d’OS peuvent croître et se différencier en plusieurs phénotypes compatibles avec la complexité histopathologique des échantillons cliniques d’OS. Le modèle permet également la visualisation de morphologies diverses et leur association avec des altérations génétiques et mécanismes réglementaires. Comme l’homologue de l’OS humain, ce modèle de BEM-OS peut être mis au point et appliqué à la pathologie et de la recherche clinique de l’OS.

Introduction

Ostéosarcome (OS) se produit habituellement dans les régions, la métaphyse des os longs, en croissance active durant l’adolescence. Plus de 80 % des sites touchés par OS ont la préférence pour la métaphyse du tibia proximal et humérus proximal, mais aussi du fémur distal et proximal, correspondant à l’emplacement de la plaque de croissance1. OS compose de plusieurs sous-types de cellules mésenchymateuses propriétés et une grande diversité dans les caractéristiques histologiques et grades. Évidences soutiennent des cellules souches mésenchymateuses (CSM), précurseurs engagés ostéoblastes et péricytes comme les cellules d’origine2,3,4,5. Ces cellules peuvent accumuler des altérations génétiques ou épigénétiques et donner lieu à des OS sous l’influence de certains signaux micro-environnementales de l’os. Les mécanismes intrinsèques et extrinsèques entraîner l’instabilité génomique et l’hétérogénéité du système d’exploitation, avec plusieurs phénotypes morphologiques et cliniques6,7. Pour des thérapies individualisées ou projection de nouveaux médicaments, nouveaux modèles doivent être générées pour contre l’hétérogénéité ou d’autres troubles cliniques.

Système d’exploitation est une tumeur solide maligne intra osseuse. La complexité et l’activité entourant les éléments microenvironnement confèrent des différences phénotypiques et fonctionnelles sur des cellules d’OS dans différents endroits d’une tumeur. La matrice osseuse extracellulaire (BEM) fournit un échafaudage biochimique et structural de dépôts minéraux et remodelage osseux. La partie organique de la matrice extracellulaire (ECM) se compose principalement de type j’ai collagène sécrété par les cellules de la lignée ostéoblastique, tandis que sa partie minéralisée est composée de phosphate de calcium sous forme d’hydroxyapatite8. Le rôle dynamique des réseaux de l’ECM est de réglementer l’adhésion cellulaire, la différenciation, la diaphonie et tissu la fonction maintenance9.

Déminéralisée hydrogels BEM et ECM ont été utilisées avec succès dans la culture de cellules et peut renforcer la cellule prolifération10,11. Synthétisés comme OS ECM peut régler la taille du pool, la décisions sort et la progression de la lignée MSCs12,13,14. En outre, résultats témoignent de son importance clinique pour fournir l’activité ostéogénique en stimulant les processus cellulaires durant OS formation et régénération15,16,17.

Dans cet article, notre groupe établit un modèle modifié et l’alternative favorable pour la culture à long terme en trois dimensions. Cellules d’OS injectés dans le tissus dérivés BEM présentent un phénotype hétérogène mésenchymateux facilement par rapport aux cultures bidimensionnelles en plastique. BEM dérivé spectacle des tissus homologues in situ de son avantage dramatique comme étant une niche native pour OS cellules in vitro et a un grand potentiel en recherche clinique et théorique des OS. Cette plate-forme BEM caractérisée est simple mais efficace pour la recherche in vitro et pourra être prolongée dans la modélisation des divers types de cancer.

Protocole

Utilisation et protection des animaux sont menées selon les instituts nationaux de Guide de santé pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (publication n ° 80-23, révisé en 1996 de NIH) après approbation par le Comité éthique animale de Sun Yat-sen University.

1. préparation de l’OS

  1. Obtenir 4 à des souris BALB/c 6 semaines (sans condition de sexe). Euthanasier une souris aseptiquement par dislocation cervicale et coupés frais péroné, du tibia et du fémur d’un membre postérieur avec des ciseaux chirurgicaux stériles. Décoller le tissu épithélial et ensuite enlevez autant de tissu mou possible à l’aide de ciseaux et pince à épiler.
  2. Rincer les os de la jambe avec une solution saline tamponnée au phosphate de stérile de 10 mM (PBS) deux fois pour enlever le sang dans un plat de 6 cm. Plonger les os à 75 % d’éthanol pendant 3 min, puis rincez deux fois avec du PBS. Les os propres peuvent être stockés dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL avec du PBS stérile à-80 ° C pendant des mois jusqu'à leur utilisation.
    Remarque : Utilisé dans toutes les étapes suivantes de PBS a 10 mM PO43−.

2. déminéralisation et décellularisation d’OS

  1. Décongeler les os congelés à la température ambiante et puis congeler à nouveau à-80 ° C, h. 1 sous réserve des os à plus de 2 à 3 cycles de gel-dégel pour ventilation de lyse et tissu cellulaire.
  2. Incuber les os dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL avec 0,5 N HCl du jour au lendemain à la température ambiante sur un agitateur basculant de plate-forme ou orbital avec bascule/agitant doucement pour assurer une couverture complète et même des os.
    Remarque : Assurez-vous que les os sont entièrement immergés pendant le mouvement dans l’acide et ne vous contentez pas au cours du processus. Le volume de HCl solution devrait être dix fois plus que celle des os.
  3. Après le détartrage, décanter la solution de HCl complètement et rincer sous le robinet pendant 1 h. Ensuite, laver les os deux fois pendant 15 min par lavage à l’eau distillée sur un agitateur basculant de plate-forme ou orbital.
    Remarque : Assurez-vous de supprimer complètement la solution ou l’eau entre les lavages et après le lavage final avec de l’eau distillée.
  4. Extraire les lipides dans les os déminéralisés avec un mélange de 1:1 du méthanol et chloroforme dans un tube à centrifuger 50 mL enveloppé de papier d’aluminium pendant 1 h à température ambiante10.
  5. Puis, transfert les os dans un autre tube de méthanol enveloppé de papier d’aluminium pendant 30 min. Retirez le méthanol complètement et rincer à l’eau deux fois pendant 15 minutes en agitant doucement distillée. Décanter l’eau de lavage final et procéder aux étapes suivantes en vertu de l’état stérile.
    Remarque : Durant l’étape d’extraction, lumière doit être évitée pour empêcher décomposition de chloroforme. Le mélange peut être stocké dans le récipient résistant à la lumière ou un tube à centrifuger enveloppé de papier d’aluminium. Effectuer tous les traitements et laver les étapes de la section modeste rotation ou mouvement de bascule.
  6. Rincer les os dans un plat de 6 cm avec du PBS stérile pendant 3 min et ensuite transférer les ossements dans un nouveau tube de centrifuger de 50 mL. Ajouter 40 mL stérile 0.05 % trypsine-EDTA (TE) dans le tube et incuber les os pendant 23 h dans un incubateur à CO2 à 37 ° C18.
  7. Jetez la solution TE et rincez deux fois avec du PBS stérile additionnée de 90 μg/mL ampicilline et 90 kanamycine μg/mL. Après décantation finale se laver complètement PBS, reconstituer avec 40 mL de PBS stérile. Laver soigneusement pendant 24h à température ambiante avec le doux balancement ou secousses pendant le trempage antibiotique.
    NOTE : Tous les PBS stérile utilisé dans ce domaine et les étapes suivantes contient 90 μg/mL ampicilline et 90 kanamycine μg/mL. Laver une nuit ou plus sous rotation ou mouvement à bascule sont effectués pour immersion complète de longues périodes avec des antibiotiques pour une stérilisation efficace des espaces interstitiels.
  8. Retirez le PBS et transférer les os dans un tube à centrifuger frais 50 mL rempli avec du PBS stérile. Le prêt déminéralisée et decellularise OS sont appellent la matrice osseuse extracellulaire (BEM) et peuvent être stockés à 4 ° C pendant 2 mois jusqu'à leur utilisation.

3. semis et culture de cellules

  1. Sortez le BEM du réfrigérateur 4 ° C et plongez-le dans 75 % d’éthanol pour 30 s, puis rincez avec du PBS deux fois. Transférer le BEM sur une plaque de culture cellulaire propre 6 puits. Ajouter 2 mL de milieu de culture complet (Dulbecco modifié moyen/F12 de l’aigle (DF12) contenant 5 % sérum de veau fœtal, 90 ampicilline μg/mL et 90 kanamycine μg/mL). Incuber le BEM du jour au lendemain dans un incubateur à CO2 à 37 ° C.
  2. Obtenir les lignées de cellules d’OS humaines (MNNG/HOS et MG-63). Suspendre environ 1,0 x 10 cellules de5 OS avec 100 μl PBS contenant du rouge de phénol comme indicateur.
    Remarque : Afin de mieux suivre et observer les cellules multicouches dans le modèle tridimensionnel de BEM, MNNG/HOS et MG-63 sont infectés par vecteur lentiviral exprimant mCherry fluorescent et la protéine fluorescente verte (GFP).
  3. Après que le BEM est complètement trempée dans le milieu, injecter des cellules d’OS BEM de l’épiphyse proximale ou distale quand l’aiguille atteint la cavité médullaire de BEM. Incuber le modèle OS-BEM pendant au moins 2 h dans un humidifié 5 % CO2 atmosphère à 37 ° C pour s’assurer que les cellules injectées adhèrent fermement à BEM.
    NOTE : Réchauffez tous les médias utilisés pour la culture cellulaire. L’incubateur utilisé pour la culture cellulaire a une humidifié 5 % CO2 atmosphère à 37 ° C.
  4. Ajouter 1 mL milieu de culture complet dans la plaque pour recouvrir complètement la surface de la culture BEM du jour au lendemain dans un incubateur à CO2 à 37 ° C.
  5. Modèle de transfert l’OS-BEM doucement dans un nouveau puits de la plaque 6 puits avec une pince stérile et le milieu de culture frais refeed 1 mL. Le modèle de la culture pendant 14 jours dans un incubateur à CO2 à 37 ° C et actualiser le milieu de culture selon la situation de la prolifération de cellules d’OS.
  6. Gardez le suivi moyen statut de couleur et de la cellule sous le microscope de fluorescence inversée au cours du processus de culture. Lorsque les cellules d’OS s’étendaient à plaque, transférer doucement le modèle OS-BEM à un autre nouveau bien avec des pinces stériles.
    Remarque : Le milieu de culture est rouge vif à un pH de 7,4, qui est la valeur de pH optimum pour la culture cellulaire plus chez les mammifères. Si le milieu se transforme en orange ou même jaune, immédiatement actualiser le support afin de maintenir un environnement sain pour les cellules de l’OS.
  7. Transférer le modèle OS-BEM dans un nouveau puits avec des pincettes et rincer doucement avec du PBS pour enlever le milieu de culture. Ensuite, transvaser dans un tube à centrifuger 15 mL et le fixer avec formol 10 % mis en mémoire tamponné pour l’identification histologique.

Résultats

Après déminéralisation et décellularisation, BEM semble être translucide avec la plus forte résistance et ténacité par rapport à l’OS natif de souris. Un petit résidu de muscle et de l’espace de la cavité médullaire peuvent clairement observer (Figure 1A, B). Pour déterminer l’effective décellularisation de BEM, BEM est incorporé à la paraffine après fixation et puis découpé en 3 à 5 μm sections pour l’hématoxyline-éosine (H & E) coloration. L’élimination complète des noyaux des cellules est montrée par imagerie de lumineux-zone. Le montage de réseau structure et collagène poreux naturel est bien entretenu à BEM decellularise (Figure 1C, D). En outre, marquage immunohistochimique (IHC) des composants organiques prédominants de la matrice osseuse, comme le collagène dans qu'i et le collagène IV ne démontrer aucun dommage sur les composantes d’ECM decellularise BEM par rapport à l’OS natif (Figure 1E). Par conséquent, BEM fournit un échafaudage approprié et prometteur avec grande biocompatibilité cellule OS l’ensemencement et la prolifération.

Les cellules MNNG/HOS présentent une morphologie très atypique avec cytoplasme finement vacuolisé, tandis que les cellules MG-63 ont des formes taraudés fibroblastes en culture monocouche (Figure 2A, B). La coupe histologique d’un patient OS affiche significative pléomorphisme cellulaire avec des cellules rondes ou polygonales, anisonucleosis et plusieurs mitoses (Figure 2C). Pour vérifier la viabilité et la qualité du modèle BEM, les deux lignées cellulaires sont injectées dans la cavité médullaire de BEM et surveillées par imagerie de fluorescence au cours de la culture de 14 jours (Figure 3A, B). Des coupes histologiques de coloration H & E révèlent que les cellules d’OS attachent aux résidus de muscle et croître en tas épais ou adhèrent le long de la matrice osseuse et prolifèrent. Périoste tant l’endoste sont infiltrés par l’expansion des cellules d’OS. Étonnamment, les profils de croissance des cellules du modèle OS-BEM diffèrent de la culture à deux dimensions plaque. Tel qu’illustré à la Figure 3C, cellules d’OS sur le BEM decellularise montrent une morphologie très hétérogène similaire aux fonctions cytopathologiques d’une section de l’OS. Certaines cellules d’OS dans l’OS spongieux et la cavité médullaire sont sphériques et étalées en partie dehors, alors que les cellules au repos le long du périoste et l’endoste sont extrêmement dispersés dans des cellules allongées, accompagnés de pléomorphisme nucléaire. L’activité des cellules est déterminée au moyen de Ki67 immunomarquage, qui montre également de grands avantages dans les cultures à long terme. Aussi, des cellules d’OS en culture BEM expriment hautement glycoprotéine de matrice osseuse — sécrétée protéine acide et riche en cystéine (SPARC/Ostéonectine) — qui est spécifique pour la matrice ostéoïde (Figure 3D).

figure-results-1
Figure 1 : Les caractéristiques structurales des souris decellularise BEM. (A, B) Vue d’ensemble de souris natif (A) et decellularise (B) d’os. (C, D) Décellularisation a été évaluée par H & E decellularise OS (D) et la coloration du tibia d’indigènes (C) de la souris. Noyaux colorés à l’hématoxyline pouvaient être observés dans le tibia de souris natif, mais pas dans le BEM. (E) IHC de coloration pour le collagène I et collagène IV afin de détecter les principales composantes de l’ECM qui sont conservés dans le tibia de souris après décellularisation. Flèche jaune signale le collagène abondant j’ai dans l’OS spongieux et la flèche bleue indique le collagène abondant IV au sein de l’os compact. Barreaux de l’échelle = 50 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Les caractéristiques de cytomorphologiques des OS. (A, B) OS humains cellules lignes MNNG/HOS (A) et MG-63 (B) élargis dans la culture de fiole en plastique. Echelle = 100 μm. (C) section histopathologique de coloration H & E du patient de l’OS. Echelle = 50 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Caractérisation des OS des cellules dans l’OS decellularise modèle de la matrice extracellulaire. (A, B) Représentant mCherry expression (rouge) image de MNNG/HOS (A) et GFP expression (vert) de la MG-63 (B) par microscopie de fluorescence après semis et de culture à BEM. Echelle = 100 μm. (C) H & E analyse montrant la morphologie typique des cellules injectées MNNG/HOS et MG-63 après mise en culture à BEM. (D), IHC analyse le niveau d’expression Ki67 et SPARC de cellules MNNG/HOS après mise en culture dans le modèle de BEM pendant 14 jours. Les images représentatives sont deux séries de coupes sériées colorées avec Ki67 et SPARC. Echelle = 50 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

En général, les OS peuvent être classés comme ostéoblastique, chondroblastiques et fibroblastic des sous-types selon sa composante histologique dominant. Son pronostic dépend non seulement des paramètres histologiques mais aussi sur son site anatomique. Il peut se produire à l’intérieur de l’OS (dans intramédullaire ou compartiment intracortical), à la surface des os et sites extraosseous19. L’émergence et l’hétérogénéité du système d’exploitation peuvent être élucidés comme une conjugaison d’événements oncogéniques et un coup de pouce micro-environnementales adéquate, suivie de croissant développement et migration vers des organes éloignés20,21,22 ,,23. Mystère au cours de l’évolution de l’OS peut être déchiffrée avec un modèle approprié pour décrire les implications cliniques ciblant l’environnement OS et niche.

Culture des plats en plastique ou en flacons in vitro peut difficilement récapituler le microenvironnement biologique dynamique et complexe. Des progrès considérables de divers modèles précliniques (p. ex., souris, poisson zèbre et chien) imitant l’ostéosarcome ont été déclarés et appliqué à la pathogenèse enquête et drogues développement4,24,25, 26 , 27 , 28. toujours, les chercheurs ont souci pour des animaux de laboratoire en raison de leur inconfort et de la souffrance au cours d’expériences. In vitro des modèles tridimensionnels comme notre modèle BEM decellularise a l’avantage en raison de sa commodité et l’exploitation rapide des économies ; Il assure l’entretien facile et à long terme de tissus ou de cellules viables et est également plus proche de la situation biologique indigène que la culture en plastique. Il a été utilisé dans nos recherches démontrant l’hétérogénéité phénotypique et le mécanisme de régulation de la dédifférenciation des OS avec succès29.

Ce protocole a précisé la faisabilité pour générer un BEM de tissus provenant de souris et pourrait être utilisé pour les tissus de l’homme, rat et le chien. Les étapes plus critiques pour le succès de l’établissement et l’application du BEM sont : (i) toutes les débris cellulaires ; (ii) le maintien d’une condition de culture stériles, en bonne santé ; (iii) la dextérité et pipetage doux pendant l’injection, de transfert et de la culture du modèle OS-BEM.

Autres protocoles déclarés emploient généralement la pressurisation ou une combinaison de traitements chimiques et enzymatiques, comme X-100 Triton, dodécylsulfate de sodium (SDS) et la solution de DNase/RNase pour atteindre décellularisation puissant30,31 . Le tissu cartilagineux qui subit une décellularisation avec détergents a été démontré pour supprimer les composants ECM dont glycosaminoglycanes32. Pour récapituler un BEM plus intact dans toute la mesure, une méthode de décellularisation modérée mais puissant est interprétée ici pour éviter la dissolution et l’endommagement des composants clés et architecture native de l’environnement osseux.

Toutefois, il est ne pas à négliger que ce modèle OS-BEM s’est reposé dans une plaque sans écoulement moyen, entraînant par conséquent une répartition inégale de l’oxygène et des nutriments. Réseau vasculaire et autres sous-types de cellules qui aident à réguler la communication et l’interaction des signaux micro-environnementales et homéostasie d’os doivent être pris en compte24, 33,34, 35. j’espère que ce modèle est combiné avec d’autres techniques ingénieries de haute technologie pour faire la lumière sur la médecine de OS recherche et guide de précision.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

Les auteurs apprécient le soutien de Liuying Chen pour son assistance administrative et Zhao Long pour son excellente assistance technique lors de la construction d’échafaudages de matrice extracellulaire osseuse. Cette étude est financée par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31871413).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube à centrifuger 15 mLGreiner188271
Tube à centrifuger 50 mLGreiner227270
Plat de culture cellulaire 6 cmGreiner628160
Plaque 6 puitsGreiner657160
AmpicillineSigma-AldrichA9393
C57-BL/6J sourisLaboratoire universitaire Sun Yat-sen Centre
CO2 incubateurSHEL LABSCO5A
Phosphate de sodium dibasiqueGuangzhou Chemical Reagent FactoryBE14-GR-500G
DMEM/F12Sigma-AldrichD0547
Sérum fœtal bovinHycloneSH30084.03
HémocytomètreBLAU717805
KanamycinSigma-AldrichPHR1487
MG-63Académie chinoise des sciences, Shanghai Cell BankLignée cellulaire d’ostéosarcome humain
MNNG/HOSAcadémie chinoise des sciences, Shanghai Cell BankLignée cellulaire d’ostéosarcome humain
Rouge de phénolSigma-AldrichP4633Une solution de rouge de phénol est utilisée comme indicateur de pH : sa couleur présente une transition progressive du jaune au rouge sur la plage de pH de 6,6 à 8,0.
Chlorurede potassium Sangon BiotechA100395
Phosphate de potassium monobasiqueSangon BiotechA501211
Chlorure de sodiumSangon BiotechA501218
Animalier

Références

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