Modèle de matrice extracellulaire OS en trois dimensions pour l’ostéosarcome

Summary

Le modèle de la matrice extracellulaire (BEM) OS pour l’ostéosarcome (OS) est bien établie et illustré ici. Il peut être utilisé comme un échafaudage approprié pour imiter tumeur primitive la croissance in vitro et fournissant un modèle idéal pour l’étude de l’hétérogénéité histologique et cytogéniques des OS.

Abstract

L’ostéosarcome (OS) est le plus commun et une tumeur osseuse primaire très agressifs. Il est caractérisé par des variations anatomiques et histologiques avec les difficultés diagnostiques et pronostiques. OS compose de cellules cancéreuses génotypiquement et phénotypiquement hétérogènes. Éléments du microenvironnement osseux sont prouvés pour tenir compte de l’hétérogénéité et la maladie de la progression tumorale. La matrice osseuse extracellulaire (BEM) conserve les matrices de microstructures et les composantes biochimiques de la matrice extracellulaire native. Ce créneau spécifique des tissus fournit un échafaudage favorable et à long terme de prolifération et de cellules d’OS ensemencement. Cet article fournit un protocole pour la préparation du modèle BEM et son application la plus expérimentale. Cellules d’OS peuvent croître et se différencier en plusieurs phénotypes compatibles avec la complexité histopathologique des échantillons cliniques d’OS. Le modèle permet également la visualisation de morphologies diverses et leur association avec des altérations génétiques et mécanismes réglementaires. Comme l’homologue de l’OS humain, ce modèle de BEM-OS peut être mis au point et appliqué à la pathologie et de la recherche clinique de l’OS.

Introduction

Ostéosarcome (OS) se produit habituellement dans les régions, la métaphyse des os longs, en croissance active durant l’adolescence. Plus de 80 % des sites touchés par OS ont la préférence pour la métaphyse du tibia proximal et humérus proximal, mais aussi du fémur distal et proximal, correspondant à l’emplacement de la plaque de croissance¹. OS compose de plusieurs sous-types de cellules mésenchymateuses propriétés et une grande diversité dans les caractéristiques histologiques et grades. Évidences soutiennent des cellules souches mésenchymateuses (CSM), précurseurs engagés ostéoblastes et péricytes comme les cellules d’origine^2,3,4,5. Ces cellules peuvent accumuler des altérations génétiques ou épigénétiques et donner lieu à des OS sous l’influence de certains signaux micro-environnementales de l’os. Les mécanismes intrinsèques et extrinsèques entraîner l’instabilité génomique et l’hétérogénéité du système d’exploitation, avec plusieurs phénotypes morphologiques et cliniques^6,7. Pour des thérapies individualisées ou projection de nouveaux médicaments, nouveaux modèles doivent être générées pour contre l’hétérogénéité ou d’autres troubles cliniques.

Système d’exploitation est une tumeur solide maligne intra osseuse. La complexité et l’activité entourant les éléments microenvironnement confèrent des différences phénotypiques et fonctionnelles sur des cellules d’OS dans différents endroits d’une tumeur. La matrice osseuse extracellulaire (BEM) fournit un échafaudage biochimique et structural de dépôts minéraux et remodelage osseux. La partie organique de la matrice extracellulaire (ECM) se compose principalement de type j’ai collagène sécrété par les cellules de la lignée ostéoblastique, tandis que sa partie minéralisée est composée de phosphate de calcium sous forme d’hydroxyapatite⁸. Le rôle dynamique des réseaux de l’ECM est de réglementer l’adhésion cellulaire, la différenciation, la diaphonie et tissu la fonction maintenance⁹.

Déminéralisée hydrogels BEM et ECM ont été utilisées avec succès dans la culture de cellules et peut renforcer la cellule prolifération^10,11. Synthétisés comme OS ECM peut régler la taille du pool, la décisions sort et la progression de la lignée MSCs^12,13,14. En outre, résultats témoignent de son importance clinique pour fournir l’activité ostéogénique en stimulant les processus cellulaires durant OS formation et régénération^15,16,17.

Dans cet article, notre groupe établit un modèle modifié et l’alternative favorable pour la culture à long terme en trois dimensions. Cellules d’OS injectés dans le tissus dérivés BEM présentent un phénotype hétérogène mésenchymateux facilement par rapport aux cultures bidimensionnelles en plastique. BEM dérivé spectacle des tissus homologues in situ de son avantage dramatique comme étant une niche native pour OS cellules in vitro et a un grand potentiel en recherche clinique et théorique des OS. Cette plate-forme BEM caractérisée est simple mais efficace pour la recherche in vitro et pourra être prolongée dans la modélisation des divers types de cancer.

Protocol

Utilisation et protection des animaux sont menées selon les instituts nationaux de Guide de santé pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (publication n ° 80-23, révisé en 1996 de NIH) après approbation par le Comité éthique animale de Sun Yat-sen University.

1. préparation de l’OS

1. Obtenir 4 à des souris BALB/c 6 semaines (sans condition de sexe). Euthanasier une souris aseptiquement par dislocation cervicale et coupés frais péroné, du tibia et du fémur d’un membre postérieur avec des ciseaux chirurgicaux stériles. Décoller le tissu épithélial et ensuite enlevez autant de tissu mou possible à l’aide de ciseaux et pince à épiler.
2. Rincer les os de la jambe avec une solution saline tamponnée au phosphate de stérile de 10 mM (PBS) deux fois pour enlever le sang dans un plat de 6 cm. Plonger les os à 75 % d’éthanol pendant 3 min, puis rincez deux fois avec du PBS. Les os propres peuvent être stockés dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL avec du PBS stérile à-80 ° C pendant des mois jusqu'à leur utilisation.
   Remarque : Utilisé dans toutes les étapes suivantes de PBS a 10 mM PO₄³⁻.

2. déminéralisation et décellularisation d’OS

1. Décongeler les os congelés à la température ambiante et puis congeler à nouveau à-80 ° C, h. 1 sous réserve des os à plus de 2 à 3 cycles de gel-dégel pour ventilation de lyse et tissu cellulaire.
2. Incuber les os dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL avec 0,5 N HCl du jour au lendemain à la température ambiante sur un agitateur basculant de plate-forme ou orbital avec bascule/agitant doucement pour assurer une couverture complète et même des os.
   Remarque : Assurez-vous que les os sont entièrement immergés pendant le mouvement dans l’acide et ne vous contentez pas au cours du processus. Le volume de HCl solution devrait être dix fois plus que celle des os.
3. Après le détartrage, décanter la solution de HCl complètement et rincer sous le robinet pendant 1 h. Ensuite, laver les os deux fois pendant 15 min par lavage à l’eau distillée sur un agitateur basculant de plate-forme ou orbital.
   Remarque : Assurez-vous de supprimer complètement la solution ou l’eau entre les lavages et après le lavage final avec de l’eau distillée.
4. Extraire les lipides dans les os déminéralisés avec un mélange de 1:1 du méthanol et chloroforme dans un tube à centrifuger 50 mL enveloppé de papier d’aluminium pendant 1 h à température ambiante¹⁰.
5. Puis, transfert les os dans un autre tube de méthanol enveloppé de papier d’aluminium pendant 30 min. Retirez le méthanol complètement et rincer à l’eau deux fois pendant 15 minutes en agitant doucement distillée. Décanter l’eau de lavage final et procéder aux étapes suivantes en vertu de l’état stérile.
   Remarque : Durant l’étape d’extraction, lumière doit être évitée pour empêcher décomposition de chloroforme. Le mélange peut être stocké dans le récipient résistant à la lumière ou un tube à centrifuger enveloppé de papier d’aluminium. Effectuer tous les traitements et laver les étapes de la section modeste rotation ou mouvement de bascule.
6. Rincer les os dans un plat de 6 cm avec du PBS stérile pendant 3 min et ensuite transférer les ossements dans un nouveau tube de centrifuger de 50 mL. Ajouter 40 mL stérile 0.05 % trypsine-EDTA (TE) dans le tube et incuber les os pendant 23 h dans un incubateur à CO₂ à 37 ° C¹⁸.
7. Jetez la solution TE et rincez deux fois avec du PBS stérile additionnée de 90 μg/mL ampicilline et 90 kanamycine μg/mL. Après décantation finale se laver complètement PBS, reconstituer avec 40 mL de PBS stérile. Laver soigneusement pendant 24h à température ambiante avec le doux balancement ou secousses pendant le trempage antibiotique.
   NOTE : Tous les PBS stérile utilisé dans ce domaine et les étapes suivantes contient 90 μg/mL ampicilline et 90 kanamycine μg/mL. Laver une nuit ou plus sous rotation ou mouvement à bascule sont effectués pour immersion complète de longues périodes avec des antibiotiques pour une stérilisation efficace des espaces interstitiels.
8. Retirez le PBS et transférer les os dans un tube à centrifuger frais 50 mL rempli avec du PBS stérile. Le prêt déminéralisée et decellularise OS sont appellent la matrice osseuse extracellulaire (BEM) et peuvent être stockés à 4 ° C pendant 2 mois jusqu'à leur utilisation.

3. semis et culture de cellules

1. Sortez le BEM du réfrigérateur 4 ° C et plongez-le dans 75 % d’éthanol pour 30 s, puis rincez avec du PBS deux fois. Transférer le BEM sur une plaque de culture cellulaire propre 6 puits. Ajouter 2 mL de milieu de culture complet (Dulbecco modifié moyen/F12 de l’aigle (DF12) contenant 5 % sérum de veau fœtal, 90 ampicilline μg/mL et 90 kanamycine μg/mL). Incuber le BEM du jour au lendemain dans un incubateur à CO₂ à 37 ° C.
2. Obtenir les lignées de cellules d’OS humaines (MNNG/HOS et MG-63). Suspendre environ 1,0 x 10 cellules de⁵ OS avec 100 μl PBS contenant du rouge de phénol comme indicateur.
   Remarque : Afin de mieux suivre et observer les cellules multicouches dans le modèle tridimensionnel de BEM, MNNG/HOS et MG-63 sont infectés par vecteur lentiviral exprimant mCherry fluorescent et la protéine fluorescente verte (GFP).
3. Après que le BEM est complètement trempée dans le milieu, injecter des cellules d’OS BEM de l’épiphyse proximale ou distale quand l’aiguille atteint la cavité médullaire de BEM. Incuber le modèle OS-BEM pendant au moins 2 h dans un humidifié 5 % CO₂ atmosphère à 37 ° C pour s’assurer que les cellules injectées adhèrent fermement à BEM.
   NOTE : Réchauffez tous les médias utilisés pour la culture cellulaire. L’incubateur utilisé pour la culture cellulaire a une humidifié 5 % CO₂ atmosphère à 37 ° C.
4. Ajouter 1 mL milieu de culture complet dans la plaque pour recouvrir complètement la surface de la culture BEM du jour au lendemain dans un incubateur à CO₂ à 37 ° C.
5. Modèle de transfert l’OS-BEM doucement dans un nouveau puits de la plaque 6 puits avec une pince stérile et le milieu de culture frais refeed 1 mL. Le modèle de la culture pendant 14 jours dans un incubateur à CO₂ à 37 ° C et actualiser le milieu de culture selon la situation de la prolifération de cellules d’OS.
6. Gardez le suivi moyen statut de couleur et de la cellule sous le microscope de fluorescence inversée au cours du processus de culture. Lorsque les cellules d’OS s’étendaient à plaque, transférer doucement le modèle OS-BEM à un autre nouveau bien avec des pinces stériles.
   Remarque : Le milieu de culture est rouge vif à un pH de 7,4, qui est la valeur de pH optimum pour la culture cellulaire plus chez les mammifères. Si le milieu se transforme en orange ou même jaune, immédiatement actualiser le support afin de maintenir un environnement sain pour les cellules de l’OS.
7. Transférer le modèle OS-BEM dans un nouveau puits avec des pincettes et rincer doucement avec du PBS pour enlever le milieu de culture. Ensuite, transvaser dans un tube à centrifuger 15 mL et le fixer avec formol 10 % mis en mémoire tamponné pour l’identification histologique.

Results

Après déminéralisation et décellularisation, BEM semble être translucide avec la plus forte résistance et ténacité par rapport à l’OS natif de souris. Un petit résidu de muscle et de l’espace de la cavité médullaire peuvent clairement observer (Figure 1A, B). Pour déterminer l’effective décellularisation de BEM, BEM est incorporé à la paraffine après fixation et puis découpé en 3 à 5 μm sections pour l’hématoxyline-éosine (H & E) coloration. L’élimination complète des no...

Discussion

En général, les OS peuvent être classés comme ostéoblastique, chondroblastiques et fibroblastic des sous-types selon sa composante histologique dominant. Son pronostic dépend non seulement des paramètres histologiques mais aussi sur son site anatomique. Il peut se produire à l’intérieur de l’OS (dans intramédullaire ou compartiment intracortical), à la surface des os et sites extraosseous¹⁹. L’émergence et l’hétérogénéité du système d’exploitation peuvent être élucidés comme une conjugaison d’événe...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tube à centrifuger 15 mL	Greiner	188271
Tube à centrifuger 50 mL	Greiner	227270
Plat de culture cellulaire 6 cm	Greiner	628160
Plaque 6 puits	Greiner	657160
Ampicilline	Sigma-Aldrich	A9393
C57-BL/6J souris	Laboratoire universitaire Sun Yat-sen Centre
CO2 incubateur	SHEL LAB	SCO5A
Phosphate de sodium dibasique	Guangzhou Chemical Reagent Factory	BE14-GR-500G
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D0547
Sérum fœtal bovin	Hyclone	SH30084.03
Hémocytomètre	BLAU	717805
Kanamycin	Sigma-Aldrich	PHR1487
MG-63	Académie chinoise des sciences, Shanghai Cell Bank		Lignée cellulaire d’ostéosarcome humain
MNNG/HOS	Académie chinoise des sciences, Shanghai Cell Bank		Lignée cellulaire d’ostéosarcome humain
Rouge de phénol	Sigma-Aldrich	P4633	Une solution de rouge de phénol est utilisée comme indicateur de pH : sa couleur présente une transition progressive du jaune au rouge sur la plage de pH de 6,6 à 8,0.
Chlorure	de potassium Sangon Biotech	A100395
Phosphate de potassium monobasique	Sangon Biotech	A501211
Chlorure de sodium	Sangon Biotech	A501218