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Article de méthode

Séquençage des semi-conducteurs pour les tests génétiques préimplantatoires pour l'anéuploidy

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DOI :

10.3791/59273

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25 août 2019

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1Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 2Birth Defects Prevention and Control Institute of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 3Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, 5State Key Laboratory of Microbial Metabolism, Joint International Research Laboratory of Metabolic and Developmental Sciences, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, 6Basecare Medical Device Co., Ltd

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous introduisons une méthode de séquençage des semi-conducteurs pour les tests génétiques préimplantatoires pour l'aneuploidy (PGT-A) avec les avantages d'un court délai d'exécution, à faible coût et d'un débit élevé.

Résumé

L'anéuploidy chromosomique, l'une des principales causes menant à l'arrêt embryonnaire de développement, à l'échec d'implantation, ou à la perte de grossesse, a été bien documenté dans les embryons humains. Le test génétique préimplantatoire pour l'aneuploidy (PGT-A) est un test génétique qui améliore considérablement les résultats reproducteurs en détectant les anomalies chromosomiques des embryons. Le séquençage de nouvelle génération (NGS) fournit une approche à haut débit et rentable pour l'analyse génétique et a montré l'applicabilité clinique dans PGT-A. Ici, nous présentons une méthode NGS basée sur le séquençage des semi-conducteurs rapide et peu coûteux pour le dépistage de l'aneuploidy chez les embryons. La première étape du flux de travail est l'amplification du génome entier (WGA) du spécimen d'embryon biopsié, suivie de la construction de la bibliothèque de séquençage, et du séquençage ultérieur sur le système de séquençage des semi-conducteurs. En général, pour une application PGT-A, 24 échantillons peuvent être chargés et séquencés sur chaque puce générant 60 à 80 millions de lectures à une longueur moyenne de lecture de 150 paires de base. La méthode fournit un protocole raffiné pour effectuer l'amplification du modèle et l'enrichissement de la bibliothèque de séquençage, ce qui rend la détection PGT-A reproductible, à haut débit, rentable et économique. La durée de fonctionnement de ce séquenceur semi-conducteur n'est que de 2 à 4 heures, ce qui réduit le délai d'exécution entre la réception d'échantillons et la publication de rapports en 5 jours. Tous ces avantages font de cet analyse une méthode idéale pour détecter les anéuploidies chromosomiques à partir d'embryons et ainsi faciliter son application large dans pgT-A.

Introduction

Le choix d'embryons viables de bonne qualité avec des numéros de copie chromosomiques normaux (euploïdes) pour le transfert en procréation assistée aide à améliorer les résultats de la grossesse. Traditionnellement, le système de classement morphologique bien établi est largement utilisé pour l'évaluation des embryons en raison de sa disponibilité facile et de sa nature non invasive. Cependant, il a été démontré que l'évaluation morphologique ne peut fournir que des informations limitées sur la qualité de l'embryon1 et le potentiel d'implantation2. Une raison fondamentale est son incapacité à évaluer la composition chromosomique des embryons.

L'anéuploidy chromosomique (nombre anormal de copie des chromosomes) est l'une des principales causes menant à l'arrêt embryonnaire de développement, à l'échec d'implantation ou à la perte de grossesse. L'apparition de l'aneuploidy a été bien documentée dans les embryons humains, représentant 60%-70% dans les embryons de clivage-étape3,4 et 50% -60% dans les blastocystes5. Cela, dans une certaine mesure, a contribué au goulot d'étranglement dans l'amélioration du taux de grossesse du traitement de fécondation in vitro (FIV), qui s'est maintenu à environ 35%-40%6,7. Par conséquent, la sélection d'embryons euploïdes pour le transfert est considérée comme bénéfique pour améliorer les résultats de la grossesse. À cette fin, des tests génétiques préimplantatoires pour l'aneuploidy (PGT-A) ont été développés pour étudier la viabilité des embryons à l'aide d'approches génétiques. Il y a de plus en plus d'essais contrôlés randomisés et d'études de cohorte qui appuient le rôle crucial du TCP-A. Il a été prouvé que l'application de PGT-A diminue le taux de fausses couches et augmente le taux de grossesse clinique et le taux d'implantation8, le taux de grossesse continue et le taux de naissance satinaire9.

Historiquement, différentes méthodes ont été appliquées dans pgT-A, tels que l'hybridation in situ de fluorescence (FISH), l'hybridation génomique comparative (CGH), le tableau-CGH, et le polymorphisme nucléotide simple (SNP)-microarray. Des études antérieures ont indiqué que PGT-A pour les embryons de clivage-étape par FISH donne des résultats qui sont mal compatibles avec ceux obtenus par le dépistage chromosomique complet (CCS) des blastocystes correspondants en utilisant 59273array-CGH ou SNP-microarray5927310. Ces écarts peuvent être attribués au mosaïsme chromosomique, aux artefacts techniques FISH, ou à l'autocorrection embryonnaire des erreurs de ségrégation chromosomique s'est avérée au cours du développement11. Il a été largement reconnu que l'utilisation de biopsies trophectoderm blastocyste (TE) pour le tableau à base de PGT-A tels que tableau-CGH ou SNP-microarray est efficace pour identifier le déséquilibre chromosomique chez les embryons10,12. Récemment, le séquençage monocellulaire de prochaine génération (NGS) offre une approche à haut débit et rentable pour l'analyse génétique et a montré l'applicabilité clinique dans PGT-A13,14,15, qui en font un alternative prometteuse aux méthodes actuellement disponibles.

Ici, nous présentons une méthode NGS rapide, robuste et peu coûteuse basée sur le séquençage des semi-conducteurs pour le dépistage de l'aneuploidy chez les embryons humains. La première étape du flux de travail est l'amplification du génome entier (WGA) du spécimen d'embryon biopsié, à l'aide d'un kit WGA à cellule unique, suivie de la construction d'une bibliothèque de séquençage, et du séquençage ultérieur sur le système de séquençage des semi-conducteurs.

En détectant lesions H qui sont libérés de chaque incorporation de triphosphate de désoxyribonucleoside lors de la synthèse des brins d'ADN, le système transfère les signaux chimiques (changement de pH) capturés par les éléments semi-conducteurs pour diriger les données numériques , qui sont interprétés en autres mesures d'information sur la séquence d'ADN. Éliminant l'exigence de détection optique coûteuse et de réactions de séquençage complexes, cette simple chimie de séquençage réduit le coût total du réactif et réduit le temps de séquençage en 2 à 4 heures16. Plus important encore, sur la base des spécifications de performance du fabricant, la plate-forme de séquençage des semi-conducteurs peut générer jusqu'à 15 Go de données de séquençage (dépend de la qualité de la bibliothèque) par course, ce qui est significativement plus élevé que certains des autres séquenceurs ne produisant qu'environ 3 à 4 Go de données (avec 2 x 75 bp de longueur de lecture)17. Dans les applications cliniques de PGT-A, cette plate-forme peut atteindre 24 échantillons par puce générant jusqu'à 80 millions de lectures17 et au moins un million de lectures uniques de chaque échantillon. La profondeur de lecture peut garantir que chaque échantillon a au moins 0,05x couverture du génome entier. Les avantages ci-dessus de cette plate-forme en font une méthode de dépistage idéale et donc, faciliter ses larges applications dans PGT-A18.

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Protocole

L'approbation éthique a été accordée par le Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee (numéro de référence : 2010.432). La licence de recherche a été approuvée par le Council on Human Reproductive Technology de Hong Kong (numéro R3004).

1. Amplification du génome entier

  1. Avant de commencer, vérifiez le volume de perles magnétiques (tableaudes matériaux)pour vous assurer qu'il n'y a pas moins de 135 L (avec un excédent de 20 %) pour chaque échantillon. Gardez les perles magnétiques à température ambiante (RT) pendant au moins 30 min. Préparer 720 l (avec un excédent de 20 %) de 70 % d'éthanol pour chaque échantillon. Équiper un vélothermique (tableaudes matériaux)d'un couvercle chauffé à 105 oC.
    REMARQUE : L'éthanol nouvellement préparé à 70 % (tableaudes matériaux)doit être utilisé dans les 3 jours.
  2. Préparation de l'échantillon
    REMARQUE: Dans la pratique courante, 5 à 10 cellules trophectoderrm du blastocyste sont biopsiés selon la ligne directrice de pratique19.
    1. Suspendre les biopsies dans 2 ll de 1x salin tamponné par phosphate (PBS) dans un seul tube de réaction en chaîne de polymérase (PCR) de 0,2 ml.
    2. Faites tourner brièvement le tube sur une mini centrifugeuse à 3 s pour recueillir les gouttelettes.
  3. Lyse cellulaire et extraction
    1. Décongeler le tampon d'extraction cellulaire (Tableau des matériaux) et le tampon de dilution enzymatique d'extraction (Tableau des matériaux) sur la glace, le vortex et tourner brièvement sur une mini centrifugeuse pendant 3 s avant utilisation.
    2. Ajouter 3 ll de tampon d'extraction cellulaire à chaque tube à partir de l'étape 1.2.2.
    3. Préparer un mélange maître de lyse cellulaire de 5 l l pour chaque échantillon en ajoutant 4,8 l de tampon de dilution enzymatique d'extraction et une enzyme d'extraction cellulaire de 0,2 L (tableaudes matériaux). Bien mélanger et aliquot dans chaque tube à partir de l'étape 1.3.2. Retourner le tube doucement et tourner brièvement sur une mini centrifugeuse pendant 3 s.
      REMARQUE : les pointes ne doivent pas toucher le liquide contenant les échantillons de cellules lors de l'ajout du mélange principal.
    4. Incuber le tube de l'étape 1.3.3 dans le cycler thermique avec couvercle chauffé. Exécuter le programme avec les réglages suivants: 10 min à 75 oC, 4 min à 95 oC, tenir à 4 oC.
  4. Préamplification
    1. Décongeler le tampon de préamplification (Tableau des matériaux) sur la glace, le vortex et tourner brièvement sur une mini centrifugeuse pendant 3 s avant utilisation.
    2. Préparer un mélange maître de préamplification de 5 L pour chaque échantillon en ajoutant 4,8 l de tampon de préamplification et 0,2 L d'enzyme de préamplification (tableaudes matériaux). Bien mélanger et aliquot dans chaque tube à partir de l'étape 1.3.4. Retourner le tube doucement et tourner brièvement sur une mini centrifugeuse pendant 3 s.
      REMARQUE : Les conseils ne doivent pas toucher le liquide contenant les échantillons d'ADN lors de l'ajout du mélange principal.
    3. Incuber le tube dans le cycler thermique avec couvercle chauffé. Exécuter le programme avec les réglages qui coulent: 2 min à 95 oC; 12 cycles pour 15 s à 95 oC, 50 s à 15 oC, 40 s à 25 oC, 30 s à 35 oC, 40 s à 65 oC, 40 s à 75 oC; tenir à 4 oC.
  5. amplification
    1. Décongeler le tampon d'amplification (Tableaudes matériaux) sur la glace, le vortex et tourner brièvement sur une mini centrifugeuse pendant 3 s avant utilisation.
    2. Préparer un mélange maître d'amplification de 60 L pour chaque échantillon en ajoutant 25 l de tampon d'amplification, 0,8 l d'enzyme d'amplification (Tableaudes matériaux)et 34,2 l d'eau exempte de nucléane pour la WGA (Tableau des matériaux). Bien mélanger et aliquot dans chaque tube à partir de l'étape 1.4.3. Retourner le tube doucement et tourner brièvement sur une mini centrifugeuse pendant 3 s.
    3. Incuber le tube dans le cycler thermique avec couvercle chauffé. Exécuter le programme avec les réglages suivants: 2 min à 95 oC; 14 cycles pour 15 s à 95 oC, 1 min à 65 oC, 1 min à 75 oC; tenir à 4 oC.
  6. Purification de le Produits WGA
    1. Transférer chaque produit WGA de l'étape 1.5.3 dans de nouveaux tubes de 1,5 ml. Ajouter 112,5 L de perles magnétiques dans chaque tube. Vortex et incuber à RT pendant 5 min.
      REMARQUE : Mélangez complètement les perles magnétiques avant utilisation.
    2. Placer les tubes sur un support magnétique (Table des Matériaux) pendant 3 min jusqu'à ce que le supernatant soit clair. Jeter tous les supernatants sans déranger les perles.
    3. Ajouter 300 l d'éthanol à 70 % à chaque tube. Faites pivoter chaque tube à 180 degrés pour laisser les perles passer à travers l'éthanol et retournent à la position d'origine. Jeter tous les supernatants après que les perles se soient installées sans déranger les perles. Répétez cette étape une fois.
      REMARQUE : Gardez le tube sur le support magnétique tout en tournant le tube horizontalement.
    4. Faites tourner brièvement chaque tube sur une mini centrifugeuse pendant 3 s. Placez les tubes sur le support magnétique jusqu'à ce que le supernatant résiduel soit clair. Jeter tous les supernatants résiduels sans déranger les perles. Sécher à l'air les perles à RT pendant environ 3 min.
    5. Retirez les tubes du support magnétique et suspendez les perles séchées en ajoutant 35 'L de tampon Tris-EDTA (TE) faible (tableaudes matériaux). Incuber à RT pendant 5 min.
    6. Placer les tubes sur le support magnétique pendant 3 min jusqu'à ce que le supernatant soit clair. Transférer tous les supernatants contenant de l'ADN éluté à de nouveaux tubes de 1,5 ml sans déranger les perles.

2. Contrôle de la qualité des produits WGA

  1. Quantifier chaque produit PURifié WGA à partir de l'étape 1.6.6 par un test de fluoromètre (Tableau des matériaux) selon le manuel du fabricant en utilisant 1 'L de produit WGA comme matériau de départ.
    REMARQUE : La concentration acceptée du produit WGA est de 10 ng/L. Il n'est pas recommandé de passer aux étapes suivantes.

3. Fragmentation des produits WGA

  1. Avant le début, préchauffer un chauffe-bloc sec à 37 oC. Préparer 6 L (avec un excédent de 20 %) de 0,5 M EDTA pour chaque échantillon. Sur la base de la concentration, aliquot 300 ng d'ADN de chaque produit PURifié WGA dans l'étape 1.6.6 à de nouveaux tubes PCR de 0,2 mL et apporter le volume à 16 L avec de l'eau sans nauséail pour chaque tube.
  2. Fragmentation
    1. Préparer un mélange de réaction à fragmentation de l'ADN double brin (dsDNA) de 4 ll pour chaque échantillon en ajoutant 2 ll de tampon de réaction à fragmentation de dsDNA (Tableau des matériaux) et 2 l d'enzymes de fragmentation de l'ADN (tableaudes matériaux). Bien mélanger et aliquot dans chaque tube à partir de l'étape 3.1. Vortex et tourner brièvement sur une mini centrifugeuse pendant 3 s. Incuber les tubes pendant 25 min à 37 oC dans un cycleur thermique avec couvercle chauffé.
    2. Ajouter immédiatement 5 'L de 0,5 M EDTA à chaque tube. Bien mélanger en vortexant et tourner brièvement sur une mini centrifugeuse à 3 s.
  3. Purification et résuspension
    1. Transférer chaque produit de l'étape 3.2.2 dans de nouveaux tubes de 1,5 ml. Ajouter 37,5 L de perles magnétiques à chaque tube. Mélanger par vertexing et incuber à RT pendant 5 min.
    2. Purifie les produits décrits de l'étape 1.6.2 à l'étape 1.6.4.
    3. Élifier chaque produit purifié tel que décrit dans les étapes 1.6.5 et 1.6.6 en ajoutant 32 L de tampon à faible TE.

4. Construction de la bibliothèque

  1. Blunt- e (en) nd (en) r (en) l'épairment, la sélection de la taille et la purification
    1. Préparer un mélange de réparation émoussé de 20 l pour chaque échantillon en ajoutant 9,5 l d'eau exempte de nucléane, 10 l de tampon de réparation de 5x (tubedu tableau des matériauxà partir de l'étape 3.3.3. Vortex et tourner brièvement sur une mini centrifugeuse pour 3 s.
    2. Ajouter 50 l de perles magnétiques à chaque tube à partir de l'étape 4.1.1. Vortex et incuber à RT pendant 5 min.
      REMARQUE : Mélangez complètement les perles magnétiques avant utilisation.
    3. Placer chaque tube sur le support magnétique pendant 3 minutes jusqu'à ce que le supernatant soit clair. Transférer tous les supernatants dans de nouveaux tubes de 1,5 ml où 25 perles magnétiques ll sont ajoutées pour chacune. Vortex les tubes avec le supernatant transféré et incuber à RT pendant 5 min.
    4. Purifie les produits dans les tubes incubés tels que décrits de l'étape 1.6.2 à l'étape 1.6.4.
    5. Élifier chaque produit purifié tel que décrit dans les étapes 1.6.5 et 1.6.6 en ajoutant 32 L de tampon à faible TE.
      REMARQUE : Il s'agit d'un point d'arrêt sûr; l'ADN purifié de cette étape est stable à 4 oC pour un temps d'au plus 24 h.
  2. Adaptateur l igation et p (en) urification
    1. Préparer un mélange de ligature adaptateur de 17 L pour chaque échantillon en ajoutant 10 l d'eau sans nucléane, 5 l de tampon de ligase 10x (Tableau des matériaux), 1 l d'adaptateur P1 (Tableau des matériaux), et 1 l de ligase d'ADN (Table des Matériaux). Bien mélanger en vortexant pendant 5 s et tourner sur une mini centrifugeuse pour 15 s, et aliquot dans chaque tube à partir de l'étape 4.1.5.
    2. Ajouter 1 l d'adaptateurs (Tableau des matériaux) à chaque tube à partir de l'étape 4.2.1 selon la feuille d'échantillon (Fichier supplémentaire: Feuille d'échantillon pour la ligature de l'adaptateur ). Vortex et tourner brièvement sur une mini centrifugeuse pendant 3 s. Incuber les tubes à RT (20 à 25 oC) pendant 20 min.
    3. Ajouter 75 l de perles magnétiques à chaque tube à partir de l'étape 4.2.2. Mélanger par vertexing et incuber à RT pendant 5 min. Ensuite, purifier les produits tels que décrits de l'étape 1.6.2 à l'étape 1.6.4.
    4. Élifier chaque produit purifié tel que décrit dans les étapes 1.6.5 et 1.6.6 en ajoutant 15 L de tampon à faible TE. Transférer tous les supernatants contenant de l'ADN éluté sur de nouvelles bandes de 0,2 mL à 8 tubes.
      REMARQUE : Il s'agit d'un point d'arrêt sûr; l'ADN purifié de cette étape est stable à 4 oC pour un temps d'au plus 24 h.
  3. Amplification et purification
    1. Préparer un mélange maître d'amplification de 50 l l pour chaque échantillon en ajoutant 47,5 l de super mix (Tableaudes matériaux)et 2,5 l de mélange d'apprêt (Tableaudes matériaux). Bien mélanger en vortexant et tourner brièvement sur une mini centrifugeuse, et aliquot dans les bandes de 0,2 mL à 8 tubes à partir de l'étape 4.2.4.
    2. Vortex les bandes pendant 30 s et tourner brièvement sur une mini centrifugeuse pour 3 s. Incuber les bandes dans le cycler thermique avec couvercle chauffé. Exécuter le programme avec les réglages suivants: 20 min à 72 oC; 5 min à 95 oC; 10 cycles pour 15 s à 95 oC, 15 s à 62 oC, 1 min à 70 oC; 5 min à 70 oC; tenir à 4 oC.
    3. Transférer chaque produit de l'étape 4.3.2 dans de nouveaux tubes de 1,5 ml. Ajouter 97,5 L de perles magnétiques à chaque tube. Mélanger par vortex et incuber à RT pendant 5 min.
    4. Purifie les produits décrits de l'étape 1.6.2 à l'étape 1.6.4.
    5. Élifier chaque produit purifié tel que décrit dans les étapes 1.6.5 et 1.6.6 en ajoutant 25 L de tampon à faible TE.

5. Contrôle de qualité et dilution de la bibliothèque d'ADN

  1. Quantifier chaque bibliothèque d'ADN préparée à partir de l'étape 4.3.5 par l'analyse du fluoromètre selon le manuel du fabricant en utilisant 2 lL de bibliothèque d'ADN comme matériau de départ.
  2. La concentration acceptée de la bibliothèque d'ADN est de 0,5 ng/L et celle du contrôle positif (Tableau des matériaux) est de 15 ng/L. Si la concentration du contrôle positif varie trop de 15 ng/L, répétez la quantification du contrôle positif jusqu'à ce que la concentration soit proche de 15 ng/L. Si la concentration de la bibliothèque est inférieure à 0,5 ng/L, redémarrez à partir de la fragmentation (section 3).
    REMARQUE : Assurez-vous que la concentration du contrôle positif atteint la valeur acceptée avant de quantifier la bibliothèque d'ADN.
  3. Diluer chaque bibliothèque à 100 pmol en ajoutant de l'eau sans nucléaris. Ajouter 1 ll de bibliothèque à n 'L d'eau sans nucléane; calculer n en utilisant l'équation ci-dessous:
    figure-protocol-1
    où Q est la concentration de chaque bibliothèque mesurée par l'assay fluoromètre et C est la concentration du contrôle positif mesuré par l'assay fluoromètre.

6. Séquençage

  1. Avant de commencer, préparer 48 L (avec un excédent de 20 %) de 1 M NaOH pour chaque échantillon et un tube sans nucléane de 1,5 ml. Décongeler le tampon PCR de mix principal (Table of Materials) (2000 l en volume) à RT. Apportez les particules de sphère ( Tableau desMatériaux) à RT.
  2. Mise en commun des bibliothèques
    1. Vortex chaque bibliothèque diluée à partir de l'étape 5.3 et tourner brièvement 4x sur une mini centrifugeuse pour 3 s à chaque fois. Prendre 5 ll de chaque bibliothèque pour mettre en commun le tube sans nucléaris de 1,5 ml. Vortex la bibliothèque mixte et tourner brièvement sur une mini centrifugeuse pour 3 s.
  3. Émulsion PCR à l'aide d'un système d'émulsion
    1. Ajouter 150 l de solution de rupture à 2 nouveaux tubes de récupération (Tableau des matériaux). Installez les nouveaux tubes de récupération, routeur de récupération et plaque d'amplification.
    2. Mélanger en inversant la bouteille d'huile (Table des Matériaux) 3 fois. Assurez-vous que la solution de pétrole et de récupération (Tableau des matériaux) sont au moins 2/3 plein.
    3. Vortex le maître mix PCR tampon pour 30 s et tourner brièvement sur une mini centrifugeuse pour 3 s. Vortex les particules de sphère et la bibliothèque mixte à partir de l'étape 6.2.1 pour 1 min et tourner brièvement sur une mini centrifugeuse pour 3 s.
    4. Préparer un mélange de ligature de 2400 l en ajoutant 172 l d'eau exempte de nucléane, 8 l de bibliothèque mixte à partir de l'étape 6.3.3, 120 'L de mélange d'enzymes (Tableau des matériaux),et 100 'L de particules de sphère au tube contenant 200 'L master mix PCR buffer.
    5. Définir une pipette à 800 l. Chargez le mélange de ligature de l'étape 6.3.4 au filtre de réaction (Tableau des matériaux) à travers le port de l'échantillon. Utilisez une pipette 1000P pour ajouter 200 l d'huile de réaction au filtre de réaction.
    6. Sélectionnez le programme Proton: Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit, puis, sélectionnez bouton assisté pour s'assurer que l'appareil a été mis en place correctement en suivant les instructions sur le moniteur. Ensuite, cliquez ensuite sur Suivant pour démarrer le programme.
  4. Enrichissement par un système d'enrichissement automatique
    1. Lorsque le programme PCR émulsion est terminé, cliquez sur Suivant, puis cliquez sur Final Spin pour tourner pendant 10 min. Sortez les 2 tubes de récupération après avoir cliqué sur Open Lid.
    2. Jetez le supernatant des 2 tubes de récupération jusqu'à ce qu'il reste 100 L dans chaque tube, et étiquetez en conséquence. Bien mélanger la solution et transférer dans un nouveau tube de 1,5 ml.
    3. Ajouter 200 l'eau sans nucléane à chaque tube de récupération, laver par pipetting de haut en bas plusieurs fois, et transférer toute la solution au tube de 1,5 ml à l'étape 6.4.2. Répétez l'étape de lavage une fois.
    4. Ajouter 200 l'eau sans nucléarisation à l'un des tubes de récupération et laver en pipetting de haut en bas plusieurs fois. Transférer toute la solution à l'autre tube de récupération et laver en pipetting de haut en bas à plusieurs reprises. Ensuite, transférez toute la solution sur le même tube de 1,5 ml à partir de l'étape 6.4.3. Vortex le tube de 1,5 ml pour 30 s et centrifugeuse pendant 8 min à 15 500 x g.
      REMARQUE : Le volume total final du produit PCR d'émulsion dans cette étape devrait être d'environ 1200 L.
    5. Jeter le supernatant dans le tube et conserver 20 L du produit PCR émulsion. Ajouter 80 l de solution de resuspension (Table des Matériaux) au tube. Mélanger en pipetting de haut en bas.
    6. Préparer une solution de fusion de 320 l pour chaque puce en ajoutant 280 l de solution monolaurate de polyéthylène glycol sorbitan (Table of Materials) et 40 'L de 1 M NaOH.
      REMARQUE : 1 M NaOH doit être entreposé à 4 oC ou fraîchement préparé. Vortex avant utilisation.
    7. Vortex le tube contenant des perles C1 (Table des Matériaux) pour 30 s. Prenez 100 l de perles C1 à un nouveau tube de 1,5 ml. Placez le tube de 1,5 ml sur le support magnétique pendant 2 min à RT. Jetez tous les supernatants après que les perles se soient installées sans déranger les perles.
    8. Ajouter 1 ml de solution de lavage C1 (Table des Matériaux) au tube de l'étape 6.4.7. Vortex pour 30 s. Placez le tube sur le support magnétique pendant 2 min à RT. Jetez tous les supernatants après que les perles se soient installées sans déranger les perles. Resuspendre les perles en ajoutant 130 l l de solution de capture de perles (Tableau des matériaux).
    9. Système d'enrichissement (ES) configuration
      1. Chargez l'échantillon (100 l produit PCR émulsion) à partir de l'étape 6.4.5, les perles lavées (130 l) à partir de l'étape 6.4.8, la solution de lavage ES (300 l) (Tableaudes matériaux),et la solution de fusion (300 l) de l'étape 6.4.6 dans la bande à 8 tubes. L'ordre de mise en page est : échantillon (tube 1), perles lavées (tube 2), solution de lavage ES (tubes 3, 4, 5) et solution de fusion (tube 7). Gardez les tubes 6 et 8 vides.
      2. Placez la bande à 8 tubes de l'étape 6.4.9.1 sur l'ES. Installez une pointe de pipette et un nouveau tube de 0,2 ml et commencez le programme.
        REMARQUE : Assurez-vous que le tuyauterie fonctionne normalement.
    10. Laver les particules de sphère une fois l'enrichissement terminé.
      1. Centrifugelement du tube de 0,2 mL à partir de l'étape 6.4.9.2 pour 5 min à 15.500 x g. Jeter le supernatant et conserver 10 L du produit d'enrichissement. Ajouter 200 l'eau sans nucléarisdans au tube. Mélanger par un vortex.
      2. Centrifugeler le tube de 0,2 ml de 5 min à 15 500 x g. Jeter le supernatant et conserver 10 L du produit d'enrichissement. Ajouter 90 l'eau sans nucléarisdans au tube. Mélanger par un vortex.
  5. Préparation du modèle
    1. Vortex le contrôle positif et tourner brièvement. Ajouter 5 ll de contrôle positif au modèle de 100 L (produit d'enrichissement à partir de l'étape 6.4.10.2). Vortex et centrifugeuse pendant 5 min à 15 500 x g. Jetez le supernatant et conservez 10 l du modèle.
    2. Ajouter 20 ll d'apprêt de séquençage (Tableau des matériaux) et 15 l de tampon d'annealing (Tableau des matériaux) au tube de modèle de l'étape 6.5.1. Vortex le tube et tourner brièvement sur une mini centrifugeuse pendant 3 s.
    3. Incuber le tube de l'étape 6.5.2 dans le cycler thermique avec couvercle chauffé. Exécuter le programme avec les réglages suivants: 2 min à 95 oC, 2 min à 37 oC, tenir à 4 oC.
    4. Ajouter 10 l de tampon de chargement (Table des Matériaux) au tube à partir de l'étape 6.5.3. Mélanger en pipetting de haut en bas.
  6. Initialisation de séquenceur
    1. Vérifier la pression du réservoir du gaz azoté (pression totale de 500 psi, pression de sortie 10 psi, optimum 20-30 psi). Rechargez 100 mL d'eau déionisée (18,2 M) aux tubes C1 et C2 (tableaudes matériaux)et installez-les aux positions C1 et C2 correspondantes sur le séquenceur.
    2. Préparer les solutions W1 (32 'L'm 1 M NaOH) et W3 (40-50 ml de tampon W3 [Tableaudes matériaux]). Préparer la solution W2 en ajoutant 1920 ml d'eau déionisée (18,2 M), une bouteille entière de tampon W2 (Table of Materials) et 8 à 12 l de 1 M NaOH, et inverser 4 à 8 fois pour mélanger.
      REMARQUE : Étant donné que la qualité de l'eau varie géologiquement, ajustez le volume de 1 M NaOH au besoin. Le pH de départ de W2 est de 5,9 à 6,1, et la plage optimale après ajustement est de 7,4 à 7,6. Changer et installer de nouveaux tubes de réactif et utiliser récemment la puce utilisée pour le lavage.
    3. Préparer les 4 nouveaux tubes vides du kit de supplément de séquençage (Tableau des matériaux). Étiquetez les 4 tubes comme dGTP, dCTP, dATP et dTTP, et ajoutez 70 L de dGTP, dCTP, dATP, ou dTTP (Tableau des matériaux) au tube correspondant (c.-à-d., 70 l dGTP au tube étiqueté comme dGTP, etc.). Vortex les tubes avant l'utilisation. Installer les tubes aux positions correspondantes indiquées sur le séquenceur (Tableau des matériaux).
  7. Lavage de copeaux
    1. Laver la puce (Table of Materials) une fois en injectant 100 l d'isopropanol dans le puits de chargement de la puce. Retirer le liquide expulsé du puits opposé.
    2. Laver la puce deux fois en injectant 100 ll d'eau sans nucléane dans le puits de chargement de la puce. Retirer le liquide expulsé du puits opposé.
    3. Laver la puce une fois en injectant 100 'L de 0,1 M NaOH dans le puits de chargement de la puce. Retirer le liquide expulsé du puits opposé. Incuber à RT pendant 1 min.
    4. Laver la puce une fois en injectant 100 ll d'eau sans nucléane dans le puits de chargement de la puce. Retirer le liquide expulsé du puits opposé.
    5. Laver la puce deux fois en injectant 100 l d'isopropanol dans le puits de chargement de la puce. Retirer le liquide expulsé du puits opposé. Sécher en soufflant de l'azote sur la puce. Éloignez-vous de la lumière.
  8. Chargement et séquençage de l'échantillon
    1. Mélanger l'échantillon de 55 L à partir de l'étape 6.5.4 en pipetting de haut en bas et charger l'échantillon au puits de chargement de la puce.
      REMARQUE : Gardez la pointe de pipette et le tube PCR de 0,2 mL utilisé dans cette étape.
    2. Placez la puce sur la mini centrifugeuse à puce (Table of Materials) lorsque
    3. Préparer deux nouveaux tubes de 1,5 ml pour la solution tampon annealing et le rinçage. Préparer le tampon d'annealing à 50 % en ajoutant 500 ll de tampon annealing et 500 l d'eau sans nucléarisation. Préparer la solution de rinçage en ajoutant 500 l de tampon annealing et 500 'L de 100 % 2-propanol.
    4. Préparer deux nouveaux tubes de 1,5 ml et préparer le mélange moussant en mélangeant 49 'L de tampon annealing de 50% et 1 'L de solution moussante (Tableau des matériaux) dans les deux tubes.
    5. Fixer une pipette à 100 l. Faire des bulles en pipetilisant l'air dans le mélange moussant à partir de l'un des deux tubes de l'étape 6.8.4. Faire 120 l de bulles et conserver le tuyautage jusqu'à ce qu'aucune bulle visible exceptionnelle ne puisse être vue. Chargez 120 l de bulles dans le puits de chargement.
      REMARQUE : Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles visibles exceptionnelles. Sinon, recommencez.
    6. Transférer le liquide expulsé excessif du puits de sortie de l'étape 6.8.5 au puits de chargement par tuyauterie. Ne pas les bulles pipette. Centrifugelant la puce pendant 30 s sur la mini centrifugeuse à puce.
    7. Répétez l'étape 6.8.5 en utilisant le deuxième tube contenant le mélange moussant de l'étape 6.8.4.
    8. Ajouter 55 ll du tampon annealing de 50 % au tube de 0,2 ml conservé à l'étape 6.8.1. Utilisez la pointe de pipette maintenue à l'étape 6.8.1 pour faire du haut et vers le bas. Chargez tous les tampons annealing de 55 L au puits de chargement. Centrifugelant la puce pendant 30 s sur la mini centrifugeuse à puce désignée.
    9. Chargez 100 L de solution de rinçage dans le puits de chargement de la puce et jetez le liquide expulsé du puits de sortie. Répétez cette étape de chargement une fois.
      REMARQUE: S'il ya des bulles dans la puce, expulser les petites bulles par de grosses bulles et rincer par solution de rinçage. Pour ce faire, il est possible de faire une solution de rinçage de 100 oL et de laisser 5 l'air sous la solution de rinçage. Par conséquent, lors de la pipetting le 105 L dans la puce, l'air formera une grande bulle qui peut expulser les petites bulles, et puis, la grande bulle peut être expulsée par la solution de rinçage suivante.
    10. Chargez 100 l de la mémoire tampon d'annealing de 50 % dans le puits de chargement de la puce. Répétez cette étape de chargement pour un total de 3 fois.
    11. Ajouter 6 ll de l'enzyme de séquençage dans 60 'L du tampon annealing 50% dans un nouveau tube de 1,5 mL. Mélanger en pipetting de haut en bas. Chargez 65 L de cette solution mixte dans le puits de chargement de la puce. Pipette lentement pour éviter l'écume.
    12. Gardez la puce loin de la lumière et incuber à RT pendant 5 min.
    13. Après l'incubation, chargez immédiatement la puce sur le séquenceur et cliquez sur Démarrer la séquence mentez sur l'écran pour commencer le séquençage.
      REMARQUE : Les données brutes de séquençage et les fichiers de contrôle de la qualité seront téléchargés automatiquement à l'entreprise pour analyse des données.

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Résultats

Sur la base de ce protocole modifié, la plate-forme de séquençage des semi-conducteurs a été appliquée pour la première fois, appliquée pour PGT-A. Nous avons examiné sur des biopsies des blastomeres de clivage-étape et des embryons blastocyst-étape. Il est suggéré que les cellules biopsiées subissent WGA dès que possible pour empêcher toute dégradation de l'ADN. Une étude précédente a comparé les performances de différentes méthodes WGA et a indiqué que la méthode que nous avons décrite ...

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Discussion

Différent des autres chimies de séquençage, le séquenceur décrit ici utilise des semi-conducteurs pour la détection des nucléotides. La puce elle-même est un dispositif électronique qui détecte les ions d'hydrogène par polymérase-conduite incorporation de base17, qui permet 2-4 h temps de séquençage du programme Proton. En outre, la puce est une puce de micropuits qui permet la localisation d'une molécule cible, qui est différente de la chimie de séquençage des cellules d'écoulement par d'autres f...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par le General Research Fund (Ref. 14162417) de Hong Kong, la National Natural Science Foundation of China (Réf. 81860272), le Plan de recherche majeur de la Provincial Science and Technology Foundation of Guangxi (Réf. No. AB16380219), et la China Postdoctoral Science Foundation Grant (Ref No. 2018M630993) de Chine.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes PCR, 0,2 mLAxygenPCR-02D-C
UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0ThermoFisher15575020
PBS, pH 7,4, Ca2+ et Mg2+ sansThermoFisher10010023
1,0 M NaOH (1,0N)SIGMA-ALDRICHS2567Pour solution de fusion.
Tubes LoBind Eppendorf de qualité moléculaire, 1,5 mLFisher Scientific13-698-791
Kit de bibliothèque de fragments Ion PlusThermoFisher4471252
Système de purification d’eau ELGA PURELAB Flex 3 ou
Système d’eau équivalent 18 M&Omega		ThermoFisher4474524
Kit de bibliothèque de fragments Ion PlusThermoFisher4471252
Tampon d’amplification PicoPLEX WGARubicon GenomicsR30050Il peut être remplacé par le système d’amplification d’ADN SurePlex, numéro de catalogue : PR-40-415101-03.
Enzyme d’amplification PicoPLEX WGARubicon GenomicsR30050Celle-ci peut être remplacée par le système d’amplification d’ADN SurePlex, numéro de catalogue : PR-40-415101-03.
d’amplification Ion OneTouchdans le kit : Alimentations Ion OneTouch 2 (réf. A26367). Composant du kit étendu dans la feuille 5
Ion PI Tampon
MyOne Solution de capture
Agilent 2100 Instrument de bioanalyseur AgilentG2939AA
Ion OneTouch Breaking Solution (capuchon noir)Dans le kit : Ion PI Hi ? Q OT2 Solutions 200 (réf. A26429). Composant du kit étendu dans la feuille 5
Dynabeads MyOne Streptavidin C1ThermoFisher65001
PicoPLEX WGA Tampon d’extraction cellulaireRubicon GenomicsR30050Il peut être remplacé par le système d’amplification d’ADN SurePlex, numéro de catalogue : PR-40-415101-00.
PicoPLEX WGA Enzyme d’extraction cellulaireRubicon GenomicsR30050Cela peut être remplacé par le système d’amplification d’ADN SurePlex, numéro de catalogue : PR-40-415101-03.
Ion PI Chip Kit v3ThermoFisherA26771
Ion Chip Minifuge, 230 VThermoFisher4479673
Ion PI dATPThermoFisherA26772
Ion PI dCTPThermoFisherA26772
Ion PI dGTPThermoFisherA26772
Ion Plus Fragment Library KitThermoFisher4471252
Kit de bibliothèque de fragments Ion PlusThermoFisher4471252
ThermoQ&ndash ; Température Bain secTAMARHB-T2-A
NEBNuivant dsDNA FragmentaseNew England BiolabsM0348L
NEBNext dsDNA FragmentaseNew England BiolabsM0348L
Ion PI dTTPThermoFisherA26772
Ion OneTouch 2 InstrumentThermoFisherINS1005527ThermoFisher Numéro de catalogue : 4474778.
Ion Plus Fragment Library KitThermoFisher4471252
Ion One Touch ESThermoFisher8441-22ThermoFisher Numéro de catalogue : 4469495. Composant du kit étendu dans la feuille 5
ÉthanolSIGMA-ALDRICH51976Il peut être remplacé par de l’éthanol absolu de qualité moléculaire de n’importe quelle marque.
PicoPLEX WGA Tampon de dilution d’enzyme d’extractionRubicon GenomicsR30050Il peut être remplacé par le système d’amplification d’ADN SurePlex, numéro de catalogue : PR-40-415101-01.
PicoPLEX WGA Tampon de dilution d’enzyme d’extractionRubicon GenomicsR30050Il peut être remplacé par le système d’amplification d’ADN SurePlex, numéro de catalogue : PR-40-415101-02.
Fluorimètre Qubit 3.0ThermoFisherQ33216Ce modèle a été remplacé par Fluorimètre Qubit 4, Numéro de catalogue : Q33226.
Qubit ds DNA HS Kit de dosageThermoFisherM2002-02
Tubes de dosage QubitThermoFisherQ32856
Ion PI Foaming SolutionThermoFisherA26772
Index pour le codage à barres des bibliothèquesBaseCareil s’agit d’un index préparé en interne. Les utilisateurs peuvent acheter des produits commerciaux auprès des kits d’adaptateurs de codes-barres ThermoFisher Ion Xpress (Cat. N° 4474517)
Tampon de chargement Ion PIThermoFisherA26772
Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE BufferThermoFisher4389764
Agencour AMPure XP KitBeckman CoulterA63880
DynaMag-2 aimant (rack magnétique)ThermoFisher12321D
Ion PI Master Mix Tampon
PCRSorvall Legend Micro 17 MicrocentrifugeuseMicro 1775002430
Ion Plus Fragment Library KitThermoFisher4471252
Eau sans nucléaseThermoFisherAM9922Celle-ci peut être remplacée par une autre marque.
PicoPLEX WGA Eau sans nucléaseRubicon GenomicsR30050Cela peut être remplacé par le système d’amplification d’ADN SurePlex, numéro de catalogue : PR-40-415101-03.
Ion OneTouch BouteilleIon PI Hi ? Q OT2 Solutions 200 (réf. A26429). Composant du kit étendu dans la feuille 5
Kit de bibliothèque de fragments Ioniques Plus ThermoFisher4471252Composant du kit étendu dans la feuille 3
ÉtalonIl s’agit d’un étalon d’ADN préparé en interne pour l’étalonnage du qubit avant la quantification de la bibliothèque.
Tampon de préamplification PicoPLEX WGARubicon GenomicsR30050Il peut être remplacé par le système d’amplification d’ADN SurePlex, numéro de catalogue : PR-40-415101-03.
Enzyme de préamplification PicoPLEX WGARubicon GenomicsR30050Cela peut être remplacé par le système d’amplification d’ADN SurePlex, numéro de catalogue : PR-40-415101-03.
Bibliothèque Amplification Primer MixThermoFisher4471252Composant du kit étendu dans la feuille 3
FiltreComposant du kit étendu dans la feuille 5
ToupieComposant du kit étendu dans la feuille 5
TubesComposant du kit étendu dans la feuille 5
Solution de remise en suspensionISP
Ion ProtonThermoFisherDA8600Ce modèle est importé par Da An Gene Co., LTD. de l’Université Sun Yat-Sen de ThermoFisher et a été certifié par la China Food and Drug Administration pour une application clinique. Le numéro de catalogue dans ThermoFisher est 4476610.
Ion PI : Salut ? Q Séquençage PolyméraseThermoFisherA26772
Ion PI Sequencing Serveur d’amorce
pour séquenceurLenovoT260
Ion PI Sphere Particles
Platinum PCR SuperMix Haute FidélitéThermoFisher4471252
Nalgene 25mmSeringue Filtres ThermoFisher724-2045Taille des pores : 0,45 & mu ;m. Spécifiquement pour les fluides aqueux.
Ion PI : Salut ? Q W2 SolutionThermoFisherA26772
Ion PI 1X W3 SolutionThermoFisherA26772
Ion OneTouch Wash Solution C1
L’Ion PGM Hi ? Q View Kit de séquençageThermoFisherA30044Composant du kit étendu dans la feuille 2
Kit de bibliothèque de fragments Ionique PlusThermoFisher4471252Composant du kit étendu dans la feuille 3
Kit de séquençage Ion PI Hi-Q 200 (1 cycle de séquençage par initialisation)ThermoFisherA26772Composant du kit étendu dans la feuille 4
Ion PI Hi ? Q OT2 200 KitThermoFisherA26434Composant du kit étendu dans la feuille 5
solution Plaque de recuitde billes d’huile d’ADN double brin de réaction ionique OneTouch de récupération de récupération

Références

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