Analyse colorimétrique d’activité Phosphatase alcaline dans le Biofilm de S. aureus

Résumé

Dans ce manuscrit, nous avons mis en place une méthode de haut débit afin de quantifier l’activité de la phosphatase alcaline dans la culture de biofilm de S. aureus de plaque 96 puits vitroplants

Résumé

Phosphatase alcaline (ALP) est une enzyme commune exprimée dans les cellules procaryotes et eucaryotes. Elle catalyse l’hydrolyse des monoesters de phosphate de nombreuses molécules à pH basique et joue un rôle indispensable dans le métabolisme du phosphate. Chez l’homme, ALP eucaryote est l’un des signaux enzymatiques le plus souvent utilisés dans le diagnostic des maladies diverses, telles que la cholestase et le rachitisme. Dans S. aureus, ALP est détectée exclusivement sur la membrane cellulaire ; Elle est également exprimée en une forme sécrétoire ainsi. Pourtant, on connaît mal son rôle dans la formation de biofilm.

Le but de ce manuscrit est de développer un test rapide et fiable pour mesurer l’activité ALP en biofilm de S. aureus ne nécessitant pas l’isolement de la protéine. À l’aide de p-nitrophényl phosphate (pNPP) comme substrat, nous avons mesuré l’activité ALP dans S. aureus biofilm formé en plaques 96 puits vitroplants. L’activité était basée sur la formation du produit soluble réaction mesurée par 405 absorbance nm. La nature à haut rendement de la méthode de plaque 96 puits vitroplants fournit une méthode sensible et reproductible pour les tests d’activité ALP. Les mêmes expérimental mis en place peuvent être étendus pour mesurer les autres extracellulaires marqueurs moléculaires associés à la formation de biofilm.

Introduction

Phosphatase alcaline (ALP) est partout exprimée dans les deux cellules procaryotes et eucaryotes¹. Il peut catalyser l’hydrolyse de monophosphate de différentes molécules telles que les nucléotides, les protéines, les alcaloïdes, les esters de phosphate et anhydrides d’acide phosphorique. Chez l’homme, ALP eucaryote est présent dans de nombreux tissus, y compris le foie, les os, les intestins et placenta². Il joue un rôle important dans la phosphorylation des protéines, la croissance cellulaire, l’apoptose, cellules souches processus ainsi que la minéralisation squelettique normale. ALP eucaryote est également un indicateur clé de sérum pour la présence de maladies dans les os, le foie et autres tissus/organes lorsque élevé^3,4.

Procaryote ALP a été détectée dans une variété de cellules bactériennes, y compris e. coli⁵,^6,de S. aureus⁷ et certaines bactéries du rumen commune dans les sols⁸. L’activité bactérienne ALP a été utilisée comme un biocapteur dans la détection des pesticides, métaux lourds,⁹ et¹⁰de la contamination bactérienne. L’expression constitutive de l’ALP a été utilisée pour identifier des staphylocoques¹¹ et pour différencier Serratia Enterobacter¹². Il est également suggéré que constitutive production ALP est corrélée à la pathogénicité à staphylocoques¹³. Bien que l’ALP a été étudiée dans différents contextes^3,4, encore peu est inédite pour son activité et sa fonction dans les cultures de biofilms.

Un biofilm a été documenté pour avoir une vie bactérienne fonctionne différemment par rapport à son homologue de cellule bactérienne libres¹⁴. Chez S. aureus, la formation de biofilm a été identifiée dans une variété de conditions cliniques et représente la résistance aux antibiotique et l’inflammation chronique^15,16. De nombreuses molécules avaient été signalés dans une matrice de biofilm tels que les polysaccharides, protéines, acides nucléiques et les lipides, mais le mécanisme de formation de biofilm n’est pas entièrement compris¹⁴. Pour comprendre le rôle de l’ALP dans la formation de biofilm, nous cultivées biofilms de Staphylococcus aureus dans les plaques de 96 puits de culture tissulaire et mesuré l’activité ALP à l’aide de para-nitrophénylphosphate (pNPP).

La molécule pNPP est un substrat prêt à l’emploi pour ALP et a été largement utilisé pour mesurer l’activité ALP^6,17,18. Ce dosage colorimétrique est basé sur la conversion de para-nitrophényl phosphate (pNPP) en para-nitrophénol aboutissant à un produit coloré à 405 nm. Par rapport aux autre essai ALP classique, tels que l’agarose gel électrophorèse¹⁹, précipitations agglutinine (WGA) de germe de blé, et WGA-HPLC²⁰, ce test est très spécifique, sensible, facile à reproduire et la plupart important, permet pour la grande débit.

Protocole

1. préparation moyenne

1. Préparer 1 L de bouillon de soja tryptique (BST) : dans 1 L d’eau distillée, ajouter 15 g de hydrolysât de caséine, 5 g de papaique de farine de soja, 3 g de chlorure de sodium, 2,5 g de dextrose et 2,5 g de phosphate dipotassique. Stériliser avant usage.
2. Pour Trypticase Soy Agar (TSA), ajouter 15 g d’agar à 1 L de TSB, autoclave. Puis laissez-le refroidir à température ambiante. Ensuite, verser à un ratio de 20 mL par boîte de pétri (100 x 15 mm).
3. Milieu de culture de biofilm : ajouter 10 g de glucose dans 1 L de BST autoclavé. Stériliser par filtration à l’aide d’un filtre de 0,2 µm.

2. Formation de Biofilm de S. aureus dans la plaque de Culture tissulaire bien 96

Remarque : Le biofilm de S. aureus est cultivé comme décrit précédemment^6,21.

1. Ensemencer une colonie individuelle S. aureus de TSA dans 10 mL de TSB et croître une nuit à 37 ° C.
2. Diluer la culture au jour le jour dans 10 mL de TSB/glucose (10 g/L) à un ratio de 1 : 100 (v/v). Vortex doucement pour mélanger pendant une concentration uniforme.
3. Transférer 200 mL de culture diluée dans un total de 18 puits (plus pour les groupes expérimentaux, un tel contrôle non-biofilm pour suggérer une relation avec l’activité de l’ALP⁶) d’une 96 plaque bien. Utiliser des triplés pour chaque point dans le temps : 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min et 75 min. Reportez-vous à l’étape 3.2.
4. Incuber la plaque 96 puits à 37 ° C pendant 24 h pour la formation de biofilm^6,21.
5. Décanter le liquide surnageant par aspiration.
6. Laver chaque bien avec 1 x solution tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4), centrifuger pendant 5 min à 15 000 x g et éliminer le surnageant par aspiration.

3. mesure de l’activité ALP en Biofilm de S. aureus

Remarque : Activité de l’ALP a été mesurée comme décrit^6,18.

1. Ajouter 75 mL de substrat tamponné de ALP consistant pNPP commercialement disponible dans chaque puits de l’étape 2.6 et commencer l’enregistrement de l’époque. Enregistrer chaque point dans le temps en trois exemplaires.
2. Après incubation pendant un temps varié : 0 min (contrôle), 15 min, 30 min, 45 min, 60 min et 75 min respectivement, ajoutent 75 µL de 5 M de NaOH pour arrêter la réaction.
3. Centrifuger la plaque pendant 5 min à 15 000 x g.
4. Transférer 100 µL de liquide surnageant dans une nouvelle plaque 96 puits pour mesure colorimétrique.
5. Mesurer l’absorbance de chaque bien à 405 nm en utilisant un 96 plaque bien lecteur. Utiliser le temps min 0 point puits à contrôler pour le bruit de fond 405 nm.
6. Répétez l’expérience entière dans trois assiettes bien 96 individuelles.

Résultats

Figure 1 montre un résultat représentatif de l’activité ALP de biofilm cultures de S. aureus en plaques de 96 puits de culture tissulaire. 75 μl de solution de pNPP disponibles dans le commerce a été ajouté à chaque puits et incubé à température ambiante. Après une incubation de différentes époques (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min et 75 min, respectivement) 75 μL de 5 M NaOH a été ajouté pour arrêter la réaction. Le produit a été ensuite mesuré...

Discussion

Dans notre test, nous avons utilisé des pNPP comme le substrat de l’ALP. Il s’agit d’une solution de travail conçue pour ELISA et aucune dilution n’est nécessaire. Après hydrolyse par ALP, un produit jaune se développe et peut être mesuré à 405 nm. À la fin de la réaction enzymatique, nous avons brièvement centrifugé la plaque 96 puits et transféré le surnageant sur une plaque bien 96 fraîches pour mesurer l’absorbance à l’aide du lecteur de plaques. Nous avons constaté que cette étape supplémentaire de centrifugation es...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agar	VWR	9002-18-0
Centrifugeuse Eppendorf	Thomas Scientific	5810
Gluose	VWR	50-99-7
Pastilles de NaOH	VWR	SS0550-500GR
Para-nitrophénylphosphate (pNPP)  ;	Sigma	P7998-100ML	Les concentrations typiques des substrats liquides pNPP, souvent utilisés dans les tests immuno-enzymatiques (ELISA), varient entre 10 et 50 mM. À l’instar de la plupart des substrats liquides pNPP prêts à l’emploi comme celui utilisé ici, la concentration exacte de pNPP n’est pas divulguée en raison de sa nature exclusive.
10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4	Sigma	P3288-1VL
Lecteur de plaques	Biotek	ELx808
S. aureus	ATCC	ATCC25923
Gélose tryptique de soja  ;   ;   ;   ;   ;   ; 15 g/L TSB	VWR	9002-18-0
Bouillon de soja tryptique :  ;   ;   ;   ;   ; g/L digestion pancréatique de la caséine............ 15.0 Digeste papaïque du tourteau de soja......... 5.00 Chlorure de sodium.............................. 3.00 Dextrose........................................   ; 2,50 Phosphate dipotassique.................. 2.50	VWR	90006-098
Plaques de culture tissulaire à 96 puits	BD	6902D09	Fond en forme de U