Analyse colorimétrique d’activité Phosphatase alcaline dans le Biofilm de S. aureus

Résumé

Dans ce manuscrit, nous avons mis en place une méthode de haut débit afin de quantifier l’activité de la phosphatase alcaline dans la culture de biofilm de S. aureus de plaque 96 puits vitroplants

Résumé

Phosphatase alcaline (ALP) est une enzyme commune exprimée dans les cellules procaryotes et eucaryotes. Elle catalyse l’hydrolyse des monoesters de phosphate de nombreuses molécules à pH basique et joue un rôle indispensable dans le métabolisme du phosphate. Chez l’homme, ALP eucaryote est l’un des signaux enzymatiques le plus souvent utilisés dans le diagnostic des maladies diverses, telles que la cholestase et le rachitisme. Dans S. aureus, ALP est détectée exclusivement sur la membrane cellulaire ; Elle est également exprimée en une forme sécrétoire ainsi. Pourtant, on connaît mal son rôle dans la formation de biofilm.

Le but de ce manuscrit est de développer un test rapide et fiable pour mesurer l’activité ALP en biofilm de S. aureus ne nécessitant pas l’isolement de la protéine. À l’aide de p-nitrophényl phosphate (pNPP) comme substrat, nous avons mesuré l’activité ALP dans S. aureus biofilm formé en plaques 96 puits vitroplants. L’activité était basée sur la formation du produit soluble réaction mesurée par 405 absorbance nm. La nature à haut rendement de la méthode de plaque 96 puits vitroplants fournit une méthode sensible et reproductible pour les tests d’activité ALP. Les mêmes expérimental mis en place peuvent être étendus pour mesurer les autres extracellulaires marqueurs moléculaires associés à la formation de biofilm.

Introduction

Phosphatase alcaline (ALP) est partout exprimée dans les deux cellules procaryotes et eucaryotes¹. Il peut catalyser l’hydrolyse de monophosphate de différentes molécules telles que les nucléotides, les protéines, les alcaloïdes, les esters de phosphate et anhydrides d’acide phosphorique. Chez l’homme, ALP eucaryote est présent dans de nombreux tissus, y compris le foie, les os, les intestins et placenta². Il joue un rôle important dans la phosphorylation des protéines, la croissance cellulaire, l’apoptose, cellules souches processus ainsi que la minéralisation squelettique normale. ALP eucaryote est également un indicat....

Protocole

1. préparation moyenne

1. Préparer 1 L de bouillon de soja tryptique (BST) : dans 1 L d’eau distillée, ajouter 15 g de hydrolysât de caséine, 5 g de papaique de farine de soja, 3 g de chlorure de sodium, 2,5 g de dextrose et 2,5 g de phosphate dipotassique. Stériliser avant usage.
2. Pour Trypticase Soy Agar (TSA), ajouter 15 g d’agar à 1 L de TSB, autoclave. Puis laissez-le refroidir à température ambiante. Ensuite, verser à un ratio de 20 mL par boîte de pétri (100 x 15 mm).
3. Milieu de culture de biofilm : ajouter 10 g de glucose dans 1 L de BST autoclavé. Stériliser par filtration à l’aide d’un filtre de 0,2 µm.

Résultats

Figure 1 montre un résultat représentatif de l’activité ALP de biofilm cultures de S. aureus en plaques de 96 puits de culture tissulaire. 75 μl de solution de pNPP disponibles dans le commerce a été ajouté à chaque puits et incubé à température ambiante. Après une incubation de différentes époques (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min et 75 min, respectivement) 75 μL de 5 M NaOH a été ajouté pour arrêter la réaction. Le produit a été ensuite mesuré.......

Discussion

Dans notre test, nous avons utilisé des pNPP comme le substrat de l’ALP. Il s’agit d’une solution de travail conçue pour ELISA et aucune dilution n’est nécessaire. Après hydrolyse par ALP, un produit jaune se développe et peut être mesuré à 405 nm. À la fin de la réaction enzymatique, nous avons brièvement centrifugé la plaque 96 puits et transféré le surnageant sur une plaque bien 96 fraîches pour mesurer l’absorbance à l’aide du lecteur de plaques. Nous avons constaté que cette étape supplémentaire de centrifugation es.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agar	VWR	9002-18-0
Centrifugeuse Eppendorf	Thomas Scientific	5810
Gluose	VWR	50-99-7
Pastilles de NaOH	VWR	SS0550-500GR
Para-nitrophénylphosphate (pNPP)  ;	Sigma	P7998-100ML	Les concentrations typiques des substrats liquides pNPP, souvent utilisés dans les tests immuno-enzymatiques (ELISA), varient entre 10 et 50 mM. À l’instar de la plupart des substrats liquides pNPP prêts à l’emploi comme celui utilisé ici, la concentration exacte de pNPP n’est pas divulguée en raison de sa nature exclusive.
10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4	Sigma	P3288-1VL
Lecteur de plaques	Biotek	ELx808
S. aureus	ATCC	ATCC25923
Gélose tryptique de soja  ;   ;   ;   ;   ;   ; 15 g/L TSB	VWR	9002-18-0
Bouillon de soja tryptique :  ;   ;   ;   ;   ; g/L digestion pancréatique de la caséine............ 15.0 Digeste papaïque du tourteau de soja......... 5.00 Chlorure de sodium.............................. 3.00 Dextrose........................................   ; 2,50 Phosphate dipotassique.................. 2.50	VWR	90006-098
Plaques de culture tissulaire à 96 puits	BD	6902D09	Fond en forme de U