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Article de méthode

Identification des récepteurs d'orexine et d'endocannabinoïdes chez le poisson zèbre adulte à l'aide de méthodes d'immunoperoxidase et d'immunofluorescence

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DOI :

10.3791/59308

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25 juin 2019

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1Department of Sciences and Technologies (DST), University of Sannio, 2Endocannabinoid Research Group, Institute of Biomolecular Chemistry, 3Department of Veterinary Medicine and Animal Productions, University of Naples Federico II

Dans cet article

Résumé

Présentés ici sont des protocoles pour la caractérisation immunohistochimique et la localisation du peptide d'orexine, des récepteurs d'orexin, et des récepteurs endocannabinoïdes dans l'intestin et les cerveaux des modèles normaux et induits par l'obésité de régime (DIO) de poissons zèbres adultes utilisant immunoperixidase et les méthodes d'immunofluorescence double.

Résumé

L'immunohistochimie (IHC) est une technique très sensible et spécifique impliquée dans la détection d'antigènes cibles dans les sections tissulaires avec des anticorps étiquetés. Il s'agit d'un processus en plusieurs étapes dans lequel l'optimisation de chaque étape est cruciale pour obtenir le signal spécifique optimal. Grâce au CSI, la distribution et la localisation de biomarqueurs spécifiques peuvent être détectées, révélant des informations sur la conservation évolutive. En outre, le CSI permet de comprendre les changements d'expression et de distribution des biomarqueurs dans des conditions pathologiques, comme l'obésité. IHC, principalement la technique d'immunofluorescence, peut être utilisé chez les poissons zèbres adultes pour détecter l'organisation et la distribution des molécules phylogénétiquement conservées, mais un protocole Standard IHC n'est pas estasblished. L'orexine et l'endocannabinoïde sont deux systèmes hautement conservés impliqués dans le contrôle de l'apport alimentaire et de la pathologie de l'obésité. Les protocoles utilisés ici sont utilisés pour obtenir des informations sur le peptide orexin (OXA), le récepteur de l'orexine (OX-2R) et la localisation et la distribution des récepteurs cannabinoïdes (CB1R) dans l'intestin et le cerveau des modèles de poissons zèbres adultes obèses normaux et induits par l'alimentation (DIO). Sont également décrits des méthodes pour l'immunoperoxidase et la double immunofluorescence, aussi bien que la préparation des réactifs, de fixation, de paraffin-embedding, et de cryoprotection du tissu de poisson zèbre et la préparation pour une étape et arrière-plan endogènes de blocage d'activité contre-staining. L'ensemble complet des paramètres est obtenu à partir d'expériences précédentes du CSI, grâce auxquelles nous avons montré comment l'immunofluorescence peut aider à comprendre les OX, l'OX-2R et la distribution, la localisation et la conservation de l'expression chez les poissons zèbres adultes. Tissus. Les images résultantes avec une intensité de signal très spécifique ont conduit à la confirmation que le poisson zèbre sont des modèles animaux appropriés pour les études immunohistochimiques de la distribution, de la localisation et de la conservation évolutive de biomarqueurs spécifiques dans conditions physiologiques et pathologiques. Les protocoles présentés ici sont recommandés pour les expériences du CSI chez les poissons zèbres adultes.

Introduction

L'immunohistochimie (IHC) est une technique classique bien établie utilisée pour identifier les composants cellulaires ou tissulaires (antigènes) par interaction antigène-anticorps1,2. Il peut être utilisé pour identifier la localisation et la distribution des biomolécules cibles dans un tissu. Le CSI utilise des réactions immunologiques et chimiques pour détecter les antigènes dans les sections tissulaires3. Les principaux marqueurs utilisés pour la visualisation des interactions antigène-anticorps comprennent les colorants fluorescents (immunofluorescence) et les réactions de couleur enzyme-substrat (immunoperoxidase), tous deux conjugués aux anticorps4. L'utilisation de l'observation microscopique est possible pour déterminer la localisation des tissus étiquetés, ce qui correspond approximativement à la localisation de l'antigène cible dans le tissu.

Deux méthodes existent pour les réactions fluorescentes ou chromogéniques pour détecter les protéines : la méthode de détection directe, dans laquelle l'anticorps primaire spécifique est directement étiqueté; et la méthode de détection indirecte, dans laquelle l'anticorps primaire est non conjugué tandis que l'anticorps secondaire porte l'étiquette5,6,7. La méthode indirecte présente certains avantages, qui sont principalement son amplification du signal. En outre, contrairement à d'autres techniques moléculaires et cellulaires, avec l'immunofluorescence, il est possible de visualiser la distribution, la localisation et la coexpression de deux protéines ou plus exprimées différemment dans les cellules et les tissus7. Le choix de la méthode de détection utilisée dépend des détails expérimentaux.

À ce jour, iHC est largement utilisé dans la recherche fondamentale comme un outil puissant et essentiel pour comprendre la distribution et la localisation des biomarqueurs et le profilage général des différentes protéines dans les tissus biologiques de l'homme aux invertébrés8, 9 (en) , 10 Ans et plus , 11. La technique aide à afficher une carte de l'expression des protéines dans un grand nombre d'organes animaux normaux et altérés et de différents types de tissus, montrant la possibilité de descendre ou de modifier l'expression induite par des changements physiologiques et pathologiques. IHC est une technique très sensible qui nécessite une précision et le bon choix de méthodes pour obtenir des résultats optimaux12. Tout d'abord, de nombreux facteurs différents tels que la fixation, la réactivité croisée, la récupération d'antigènes et la sensibilité des anticorps peuvent conduire à de faux signaux positifs et faux négatifs13. La sélection des anticorps est l'une des étapes les plus importantes du CSI et dépend de la spécificité de l'antigène et de son affinité avec les protéines et les espèces à l'étude7.

Récemment, nous avons optimisé la technique du CSI pour détecter les membres de l'orexine/hypocrétine et des systèmes endocannabinoïdes dans le tissu adulte de poisson zèbre. Nous nous sommes concentrés principalement sur la fixation, l'intégration tissulaire à l'aide de deux approches différentes, la section et le montage (qui peuvent affecter la résolution et le détail lors de l'analyse microscopique), et le blocage (pour prévenir les faux positifs et réduire le fond)14. D'autres caractéristiques importantes sont la spécificité et la sélectivité des anticorps et la reproductibilité des protocoles individuels du Ci-Ph. La clé pour fournir la spécificité d'anticorps est l'utilisation des contrôles négatifs (y compris aucun anticorps primaire ou tissu qui est connu pour ne pas exprimer les protéines cibles) aussi bien que des contrôles positifs (y compris le tissu qui est connu pour exprimer les protéines cibles)15 . La sélection des anticorps pour iHC est faite en fonction de leur spécificité de l'espèce (la probabilité avec laquelle ils réagissent avec l'antigène d'intérêt) et des systèmes de détection de liaison antigène-anticorps qui sont utilisés4,5,6 ,7. Dans le cas de l'immunoperoxidase, la couleur de la réaction est déterminée par la sélection du chromogène précipitant, habituellement diaminobenzidine (brun)16. D'autre part, immunofluorescence utilise des anticorps conjugués avec un fluorophor pour visualiser l'expression des protéines dans les sections de tissus congelés et permet une analyse facile de protéines multiples en ce qui concerne le système de détection chromogénique 5 Annonces , 7.

Dans la technique d'immunoperoxidase, l'anticorps secondaire est conjugué à la biotine, une molécule de liaison capable de recruter une molécule journaliste chromogénique [complexe d'avidin-biotine (ABC)], conduisant à l'amplification du signal de coloration. Avec la méthode de journaliste d'ABC, l'enzyme peroxidase réagit avec 3,3'-diaminobenzidine (DAB), produisant une coloration intensément brune où l'enzyme se lie à l'anticorps secondaire, qui peut alors être analysée avec un microscope léger ordinaire. La coloration d'ABC, due à la forte affinité de l'avidine pour la biotine, produit une réaction rapide et optimale, avec peu d'anticorps secondaires attachés au site de la réactivité primaire d'anticorps. Cette méthode de détection chromogénique permet l'analyse densitométrique du signal, fournissant des données semi-quantitatives basées sur la corrélation des niveaux de signal brun avec les niveaux d'expression protéique18.

Avec les techniques d'immunofluorescence, la détection simultanée de protéines multiples est possible en raison de la capacité de différents fluorochromes à émettre de la lumière à des longueurs d'onde uniques, mais il est important de choisir les fluorochromes avec soin pour minimiser les chevauchements spectrals 5. En outre, l'utilisation d'anticorps primaires chez différentes espèces hôtes minimise les difficultés liées à la réactivité croisée. Dans ce cas, chaque anticorps secondaire spécifique à une espèce ne reconnaît qu'un seul type d'anticorps primaires. Les reporters fluorescents sont de petites molécules organiques, y compris des dérivés commerciaux, comme les colorants Alexa Fluor.

De nombreux modèles animaux sont utilisés pour comprendre des conditions physiologiques et pathologiques particulières. À ce jour, il est établi que de nombreuses voies métaboliques sont conservées au cours de l'évolution. Par conséquent, les études du CIS dans des organismes modèles tels que le poisson zèbre peuvent fournir un aperçu de la genèse et du maintien des conditions pathologiques et non pathologiques17. C'est un but de ce rapport pour illustrer des protocoles d'IHC qui peuvent être exécutés sur le tissu adulte de poisson zèbre et employés pour obtenir des images détaillées de la distribution et de la localisation d'OXA, d'OX-2R, et de CB1R aux niveaux périphériques et centraux. On signale également des protocoles pour l'application de deux principales méthodes indirectes du CIS dans les tissus périphériques et centraux du poisson zèbre adulte. La méthode indirecte, qui permet l'amplification du signal dans les cas où un anticorps secondaire est conjugué à un colorant fluorescent (méthode d'immunofluorescence) ou à un reporter enzymatique (méthode d'immunoperoxidase). Les méthodes de détection chromogéniques et fluorescentes possèdent des avantages et des inconvénients. Rapporté dans ce protocole est l'utilisation de IHC, principalement l'immunofluorescence, chez le poisson zèbre adulte, un modèle animal largement utilisé pour étudier les systèmes qui sont évolutifs conservés à travers différentes conditions physiologiques et pathologiques.

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Protocole

1. Protocole d'immunoperoxidase

REMARQUE: Le poisson zèbre a été obtenu par le professeur Omid Safari (Département des pêches, Faculté des ressources naturelles et de l'environnement, Université Ferdowsi de Mashhad, Mashhad, Iran)10.

  1. Dissection tissulaire
    1. Sacrifier le poisson zèbre par submersion dans l'eau glacée (5 parties de glace/1 partie d'eau, 4 oC); les laisser jusqu'à la cessation de tout mouvement pour assurer la mort par hypoxie.
    2. Enlevez rapidement l'intestin et le cerveau avec la méthode de dissection suivante :
      1. Séchez le poisson sur un essuie-tout et placez-le sagittalement sur un tapis de dissection, bloquant la partie ventrale de la douille de l'œil et la partie charnue de la queue.
      2. Pour l'intestin: couper la peau et enlever soigneusement la peau et le muscle sous-jacent du côté du poisson jusqu'à ce que les organes internes sont visibles. Retirez l'intestin de la cavité du corps qui l'étire.
      3. Pour le cerveau : retirez la tête avec une lame de rasoir. Enlever les tissus mous du côté ventral du crâne avec des forceps. Ouvrez le crâne et retirez l'os du côté ventral du cerveau. Enlever la peau et les os du crâne du côté dorsal du cerveau. Enlevez le cerveau.
  2. Fixation des tissus
    1. Fixer les tissus disséquants par immersion dans du paraformaldeyde frais de 4 % (PFA) dans un tampon de phosphate (PB, pH 7,4, 4 oC) pendant 3 h à température ambiante (RT).
      1. Préparer 0,1 M PB en dissolvant 1,755 g de NaH2PO4H2O et 4,575 g de Na2HPO4 dans 450 mL d'eau distillée (dH2O), et ajuster à un pH de 7,4 avec la quantité nécessaire de NaOH 1N.
      2. Préparer 4% PFA dissoudre 4 g de PFA dans 100 ml de 0,1 M PB (pH 7,4) par agitation sur une plaque chauffante. Lorsqu'une température de 60 oC est atteinte, ajouter 2-4 gouttes de NaOH 1N pour obtenir une solution claire. Gauche PFA 4% à RT et contrôler le pH . Ajuster le pH à 7,4.
        REMARQUE : La fixation des tissus pendant plus de 4 à 6 h peut conduire à une surfixation, qui masque les antigènes, limitant la liaison anticorps-épitophe. Le temps de fixation dépend de la taille des tissus.
  3. Incorporation de tissu
    1. Rincer les tissus 5x pendant 5 min chacun, par immersion en 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Déshydrater les tissus par immersion subséquente dans l'alcool 70 % (6 min), 80 % (6 min), 95 % (5 min), 95 % (5 min), 100 % (1 min) et 100 % (1 min).
    3. Clarifier les tissus par immersion dans 100% alcool:xylène (1:1) pendant 10 min, puis 2x en xylène pendant 5 min chacun.
    4. Infiltrer les tissus avec de la cire de paraffine (56 oC) deux fois pendant 1 h chacun par immersion directe dans la paraffine.
    5. Intégrer les tissus dans des blocs de paraffine à température ambiante (RT) et les conserver à RT jusqu'à la section.
  4. Coupe de tissu
    1. Couper les tissus en sections coronales ou sagittales d'une épaisseur de 8 m avec un microtome, et recueillir les sections en série alternée sur des lames de verre adhésif sur l'eau et réchauffées à 38 oC.
    2. Séchez les toboggans avec des sections à 37 oC pendant la nuit.
  5. Déparaffinisation et réhydratation des sections tissulaires
    1. Décire les sections par immersion en xylène pendant 5 min suivie d'une immersion en xylène pendant 3 min.
    2. Réhydratez les sections par immersion subséquente dans l'alcool 100% II (1 min), 100% I (1 min), 95% (1 min), 75% (1 min), 50% (1 min), puis placez les lames en dH2O (5 min).
      REMARQUE : Décire complètement les sections avant de commencer la réaction. Si les sections ont encore des traces de paraffine, effectuez une immersion supplémentaire en xylène pendant 5 minutes ou plus.
  6. Récupération d'antigène
    1. Traiter les sections avec un tampon de citrate (0,01 M, pH 6,0) en plongeant les glissières dans la solution et en chauffant dans un four à micro-ondes pendant 5 min à puissance maximale.
    2. Laissez refroidir les sections.
    3. Répéter le cycle de 5 min au micro-ondes à puissance maximale pour compléter la récupération d'antigène.
      1. Préparer le tampon de citrate (0,01 M, pH 6,0) en dissolvant 2,10 g d'acide citrique en 100 ml de dH2O et 5,882 g de citrate de sodium dans 200 mL de dH2O. Mélanger le citrate de sodium (0,01 M) avec de l'acide citrique (0,01 M) à un ratio de 1:4 en volume et ajuster le pH 6 en utilisant HCl 0.1N.
  7. Blocage de la peroxidase endogène
    1. Délimiter la zone tissulaire sur les lames à l'égard d'un stylo résistant aux solvants.
    2. Rincer les sections 3 fois, 5 min chacune, avec une solution saline tris tamponnée (TBS) (0,1 M, pH 7,3).
      1. Préparer 0,1 M TBS en dissolvant 12,1 g de base de trizma et 9 g de NaCl en 950 ml de dH2O et ajuster au pH 7,3 avec HCl 0,1N.
    3. Bloquez l'activité endogène de peroxidase par des diapositives immersion dans une solution de 0,75% H2O2 pour 5 min à RT.
      1. Préparer la solution H2O2 de 0,75 % dissolvant 5 mL de 30 % H2O2 dans 195 mL de dH2O.
        REMARQUE : les enzymes ndogenous peuvent réagir avec des réactifs iHC et donner de faux résultats positifs. En outre, les tissus fortement vascularisés expriment beaucoup de peroxidase endogène, qui peut mener à la coloration non spécifique intense et aux niveaux de fond. Le traitement avec 0.75% H2O2 étanches peroïdase endogène et réduit de manière significative le fond non spécifique.
  8. Blocage de bindi bindi ng sites et perméabilisation des tissus
    1. Incuber les sections tissulaires avec le tampon de blocage Triton (TBS-T) du SCT/0,4 %, contenant l'antisérum primaire (SNR), pendant 30 min à RT pour bloquer les sites de liaison non spécifiques.
      1. Préparer 0,4 % de Triton en dissolvant 0,4 mL de Triton X-100 dans 100 mL de SCT.
      2. Préparer la solution tampon de blocage TBS-T en dissolvant 1 % de sérum normal dans le SCT contenant 0,4 % de Triton X-100 (1 ml de sérum normal, 8,2 mL de SCT et 0,8 mL de 0,48 Triton X-100).
        REMARQUE : Sélectionnez l'espèce du sérum animal en fonction de l'hôte de l'anticorps secondaire (p. ex., lorsque vous utilisez un anticorps secondaire anti-lapin de chèvre, utilisez un sérum de chèvre normal).
  9. Incubation de tissus avec anticorps primaires
    1. Incuber les sections pendant la nuit dans une boîte humide à RT avec des anticorps primaires dilués dans TBS-T. Tainer les sections avec l'anticorps primaire suivant :
      1. Anticorps de chèvre contre OX-2R dilué 1:200, qui reconnaît le C-terminal de la protéine.
      2. Anticorps de chèvre contre OX-A dilué 1:200 [orexin-A (C-19)], qui reconnaît le C-terminal de la protéine.
        REMARQUE : Assurez-vous que l'anticorps primaire réagit avec la biomolécule d'intérêt. Définir avec quel épitoe de la biomolécule l'anticorps primaire réagit en utilisant l'alignement des gènes. Par exemple, l'épitope OX-A a été cartographié entre les aa 50-100 de l'ox-A humain (O43612) tandis que l'épitope OX-2R a été cartographié près des 50 derniers aa au terminal C de l'homme.
  10. Incubation de tissus avec anticorps secondaire
    1. Rincer les sections 3x pendant 5 min chacune, avec 0,1 M TBS (pH 7,3).
    2. Incuber les sections pendant 1,5 h à RT avec des anticorps secondaires biotinylated et l'immunoglobuline anti-chèvre de lapin (H-L) conjugués à la biotine, puis diluer 1:100 dans TBS-T.
      REMARQUE : Testez et trouvez les différentes dilutions des anticorps primaires et secondaires pour trouver la dilution optimale qui permet la réduction de l'arrière-plan.
  11. Réaction de Peroxidase
    1. Rincer les sections 3x pendant 5 min chacune, avec 0,1 M TBS (pH 7,3).
    2. Incuber les sections avec avidin-biotine complexe (ABC) pour 1 h.
      1. Préparer la solution ABC en ajoutant deux gouttes de composant A suivies de deux gouttes de composant B dans 5 ml de SCT.
    3. Rincer les sections 3x pendant 5 min chacune, avec 0,1 M TBS (pH 7,3).
    4. Traiter les sections avec le substrat chromogène 3,3'-diaminobenzidine-4 (DAB).
      1. Préparer la solution DAB en ajoutant une goutte (environ 30 l) de concentré de chromogène DAB à 1 ml de diluant DAB, et mélanger bien avant utilisation.
        REMARQUE : Préparer la solution ABC au moins 30 min avant l'utilisation et maintenir le complexe à 4 oC jusqu'à ce qu'il soit utilisé pour permettre une liaison stable à l'avidine/biotine. Préparer la solution de travail DAB fraîche, appliquer sur les sections de tissu, et se développer jusqu'à ce que la couleur est appropriée. Lorsque la réaction chromogénique convertit les sites de l'épitographe en une couleur brune et que l'intensité du signal est appropriée pour l'imagerie, passez à l'étape suivante. Le moment du développement de DAB peut varier de quelques secondes à 10 min. Pour OX-A et OX-2R 1, 2 min suffit. Manipulez le DAB avec soin, car il est cancérogène.
  12. Déhydratation et montage des tissus
    1. Rincer toutes les sections 3x pendant 5 min chacune, avec 0,1 M TBS (pH 7.3) pour arrêter la réaction DAB.
    2. Déshydrater les sections par immersion subséquente dans l'alcool 50% (2 min), 75% (2 min), 95% (2 min), 100% I (2 min), 100% II (2 min).
    3. Clarifier les tranches par immersion 2x en xylène 10 min chacune.
    4. Montez les sections avec DPX (dibutyl phtalate xylène) monture pour l'histologie, en ajoutant deux gouttes de supports de montage à des diapositives et en garniture lentement avec des couvertures.
      REMARQUE : Puisque l'immersion des tissus dans des concentrations croissantes d'alcool pendant la déshydratation entraîne la pénétration de l'alcool des tissus et le remplacement de l'eau par de l'alcool, déterminez un temps de déshydratation précis et ne déshydratez pas trop les tissus. Effectuer l'immersion en xylène après déshydratation pour clarifier le tissu et enlever tout excès ou l'alcool restant.
  13. Contrôles
    1. Répétez les sections 1.1-1.12, en omettant l'anticorps primaire et/ou en remplaçant l'anticorps primaire ou l'anticorps secondaire IgG par le SCT (contrôles négatifs).
    2. Répétez les sections 1,1 à 1,12 préabsorbant chaque anticorps primaire avec un excès du peptide relatif (100 mg de peptide/1 mL d'antisérum dilué).
    3. Répétez les sections 1.1-1.12 en utilisant différents tissus comme contrôle positif (p. ex., tissu de souris).
      REMARQUE : Préparer tous les tampons frais, peu de temps avant de commencer. Retirez soigneusement l'excès de liquide à chaque étape avec une pipette ou un papier filtre autour des sections, en gardant toujours les sections humides.
  14. Acquisition et analyse d'images
    1. Acquérir des images numériques sous éclairage lumineux constant et au même grossissement à l'aide d'un microscope équipé d'un appareil photo numérique.
    2. Effectuer une analyse semi-quantitative de l'intensité des taches à l'aide d'un logiciel d'imagerie (voir Tableau des matériaux).
      1. Ouvrez les images capturées, en format fichier .lif ou .tiff, pour évaluer les indices de positivité OX-A ou OX2-R.
      2. Sélectionnez le bouton sous Mesure et cliquez sur Manuel Counting. Comptez le nombre de profils de cellules tachées directement à partir de l'écran en plaçant une marque sur les cellules positives en cliquant sur la souris.
      3. Sélectionnez une zone d'intérêt (ROI) (3 x 103 m2) pour quantifier la densité immunosignal (densité optique, OD).
      4. Déterminer le pixel ayant la plus forte intensité (haute intensité positive) et la moins forte intensité (négative) à l'intérieur de l'image analysée pour attribuer le zéro comme valeur de l'arrière-plan (c.-à-d. une partie du tissu dépourvu de cellules tachées).
      5. Évaluer l'OD en travaillant sur une échelle logarithmique d'absorption. Dans l'analyse d'image numérique, l'intensité du pixel DAB varie de l'ombre la plus sombre (valeur 0) à la plus légère (255 valeur).
      6. Déterminer l'OD en traçant un histogramme de ce qui suit : log10(255/I), où « I » est la valeur d'intensité de pixel donnée par le programme et déterminée en soustrayant l'arrière-plan.
        REMARQUE : La réaction permanente et stable d'immunoperoxidase peut être analysée sous un microscope lumineux-champ à tout moment. Effectuer le comptage des cellules étiquetées sur une section alternative afin d'éviter le double comptage de la même cellule à partir de sections adjacentes.

2. Protocole d'immunofluorescence

  1. Dissection tissulaire
    1. Sacrifiez et disséquez les animaux tels que décrits à la section 1.1.
  2. Fixation des tissus
    1. Fixer l'intestin et le cerveau par immersion pendant 3 h dans 4% de PFA à 4 oC.
      1. Préparer pb et 4% PFA comme dans la section 1.2.1.
        REMARQUE : Le moment de la fixation dépend de la taille des tissus. La fixation des tissus pendant plus de 4 à 6 h peut conduire à une surfixation, qui masque les antigènes et limite la liaison anticorps-épitopées.
  3. Incorporation de tissu
    1. Rincer les tissus 3x pendant 5 min chacun, avec 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Pour la cryoprotection, transférer les tissus à 20% de saccharose en PB (0,1 M, pH 7,4) et garder toute la nuit à 4 oC. Ensuite, transférer les tissus à 30% de saccharose en 0,1 M PB (pH 7,4) et garder pour une nuit supplémentaire à 4 oC.
    3. Intégrer les tissus dans un bloc de température de coupe optimale (OCT). Pour ce faire, préparez un petit dewar d'azote liquide, prenez du papier d'aluminium et coupez-le en deux pour créer une casserole. La casserole contenant les tissus remplis du composé OCT doit être trempée dans l'azote liquide jusqu'à ce que le composé OCT soit refroidi. Les tissus congelés peuvent être stockés à -80 oC jusqu'à la section.
  4. Coupe de tissu
    1. Transférer les blocs de tissus congelés dans un cryostat à -20 oC et les couper en sections coronales ou sagittales de 10 m.
    2. Recueillir les tissus dans d'autres sections de série sur des lames de verre adhésif s'approprier l'immunohistochimie et les stocker à -20 oC jusqu'à l'utilisation.
      REMARQUE : Conservez les diapositives entre -20 et 4 oC dans une boîte à diapositives ou un livre de diapositives foncés.
  5. Blocage des sites de liaison non spécifiques et perméabilizzation tissulaire
    1. Délimiter la zone tissulaire sur la glissière à l'égard d'un stylo résistant aux solvants.
    2. Rincer les sections 3x pendant 5 min chacune, avec 0,1 M PB (pH 7,4).
    3. Incuber les sections avec 1% de sérum d'âne normal dissous dans le tampon de perméabilisation PB-Triton X-100 0,3% (PB-T) pendant 30 minutes à RT pour perméabilize la membrane cellulaire et bloquer les sites de liaison non spécifiques.
      1. Préparer Triton X-100 0,3% dissolvant 0,3 mL de Triton X-100 en 100 ml de 0,1 M PB (pH 7,4).
      2. Préparer la solution de blocage dissolvant 1% sérum d'âne normal dans PB contenant 0,3% TritonX-100.
        REMARQUE : Les espèces animales du sérum utilisées dans la perméabilisation et les tampons de blocage dépendent de l'hôte de l'anticorps secondaire.
  6. Incubation avec mélange d'anticorps primaires
    1. Rincer les sections 3x pendant 5 min chacune, avec 0,1 M PB (pH 7,4).
      1. Incuber les sections pendant la nuit dans une boîte humide à RT avec un mélange d'anticorps primaires dilués dans PB-T. Les mélanges suivants d'anticorps primaires peuvent être utilisés : anticorps de chèvre contre OX-2R dilué 1:100/rabbit anticorps contre CB1R dilué 1:100, ou anticorps de chèvre contre OX-A dilué 1:100/rabbit anticorps contre CB1R dilué 1:100.
  7. Incubation avec mélange d'anticorps secondaires
    1. Rincer les sections 3x pendant 5 min chacune, avec 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Incuber les sections pour 2 h à RT avec 1) un mélange d'âne anti-lapin Alexa Fluor 488-conjugué anticorps secondaires et âne anti-chèvre Alexa Fluor 594-conjugué anticorps secondaires dilués 1:100 en PB-T; ou 2) un mélange d'âne anti-chèvre Alexa Fluor 488-conjugué anticorps secondaires et âne anti-lapin Alexa Fluor 594-conjugué anticorps secondaires dilués 1:100 en PB-T.
      REMARQUE : Utilisez des anticorps secondaires développés dans le même hôte animal. Le sérum normal doit appartenir à la même espèce de l'anticorps secondaire (p. ex., utiliser des anticorps secondaires développés dans un âne et un sérum normal d'âne). Diluer les anticorps primaires et secondaires avec un tampon de blocage contenant le détergent pour augmenter la perméabilisation cellulaire et réduire l'arrière-plan.
  8. Montage de tissu
    1. Rincer les sections 3x pendant 5 min chacune, avec 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Counterstain les sections avec d'un colorant nucléaire DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) préparé la dissolution de 1,5 'L de DAPI (1 mg/mL) en 3 ml de PB.
    3. Glissades de couverture avec support de montage (voir Tableau des matériaux). Ce milieu de montage aqueux stabilise l'échantillon de tissu et les taches pour une utilisation à long terme. Les échantillons fluorescents peuvent être stockés dans l'obscurité à 4 oC. Pour prolonger la vie des fluorofores, utilisez un support de montage antialimenté.
      REMARQUE : Choisissez un bon support de montage. L'un des paramètres les plus importants des agents de montage est l'indice de réfraction (nD), qui devrait être d'environ 1,5, l'indice de réfraction du verre. Le support de montage utilisé ici peut être utilisé en particulier avec des échantillons préparés pour les déterminations des enzymes et des lipides (c.-à-d., spécimen qui ne doit pas être déshydraté avec une série ascendante d'alcool).
  9. Contrôles
    1. Répétez les sections 2.1-2.8, en omettant l'anticorps primaire ou secondaire, ou en remplaçant dans l'étape spécifique l'antisera primaire ou secondaire par PB (contrôle négatif).
    2. Répétez les sections 2,1 à 2,8, préabsorbant chaque anticorps primaire avec un excès du peptide relatif (100 mg de peptide/1 mL d'antisérum dilué).
    3. Répétez les sections 2.1-2.8 sur les tranches de cerveau de souris (contrôle positif).
      REMARQUE : Préparez tous les tampons frais, peu de temps avant de commencer. Enlever soigneusement l'excès de liquide à chaque étape avec une pipette ou un papier filtre autour des sections, en gardant toujours la section humide.
  10. Acquisition d'images
    1. Utilisez un microscope confocal équipé d'un stade motorisé x-y-z, d'un appareil photo numérique et d'un logiciel d'acquisition et d'analyse d'images comme NIS-Elements C pour observer et analyser les sections immunostained. Acquérir des images numériques en utilisant les objectifs 5-20-40x.
    2. Prenez les images de chaque section à faible grossissement (objectif 10x ou 20x) dans chacun des canaux disponibles pour composer un montage de grossissement faible, fournissant un aperçu de l'ensemble de la région pour faciliter la localisation et la documentation de OX-2R/CB1R co-expression anatomique. Normalisez les images de fluorescence au maximum de contraste et de superpose avant l'analyse.
    3. Recueillir des piles Z série d'images dans toute la zone d'intérêt. Acquérir les images à travers six plans focaux (Z-step) avec des étapes focales de 1 à 1,8 m pour couvrir le volume tissulaire dans lequel la coexpression OX-2R/CB1R est visualisée comme une ponctua jaune. Pour faire cette collection pour chaque canal (rouge, vert, bleu) séparément, à l'aide d'un microscope motorisé Z.
    4. Utilisez un logiciel de déconvolution d'imagerie pour décongestionner les images par l'application de dix itérations et effondrer les images de plans en série Z en une seule image de projection maximale.
    5. Ajuster les micrographes pour la lumière et le contraste en utilisant Adobe Photoshop 6.01 (Adobe Systems, San Jose, CA).
      REMARQUE : Effectuez l'étape de déconvolution pendant l'observation pour diminuer davantage l'arrière-plan. Limitez l'exposition à la la diapositive à la lumière pour éviter le photoblanchiment.
  11. Analyse d'image
    1. Effectuer une analyse quantitative de la coexpression OX-2R/CB1R sur des sections alternées de 10 m d'épaisseur (n ' 5 animaux par groupe) en couvrant toute la région d'intérêt de chaque animal.
    2. Quantifier la coexpression OX-2R/CB1R en tant que nombre de ponctuas positifs jaunes avec un système semi-automatisé d'analyse d'image. Le logiciel Imagins peut fournir un niveau de détail plus élevé, avec des données quantitatives concernant les régions de chevauchement entre les différentes sondes fluorescentes.
    3. Quantifier la poncte en utilisant des outils de seuil pour l'intensité du signal dans les deux canaux. Ouvrez le fichier d'images .liff, .tiff ou .jpg et sélectionnez Image-Seuil. Sélectionnez Réglage Automatique ou Méthode Manuelle et régulez Le Seuil jusqu'à ce que toutes les ponctuas tachées soient sélectionnées. Analyser la distribution des intensités de pixels dans une zone de l'image qui ne contient pas d'objets immuno-étiquetés pour obtenir le seuil d'arrière-plan. Déterminez ce fond individuellement pour chaque image. Le programme supprime ensuite le seuil d'arrière-plan en définissant la ligne de base des intensités de pixels à la valeur de fond.
    4. Sélectionnez Analyze-Measure et choisissez les paramètres à mesurer (intensité de puncta-minimum, valeurs maximales et moyennes; nombre/densité de la puncte immunoétiquetée).
    5. Comptez la poncte jaune le long du volume du tissu en 4 z-piles pour chaque section, en utilisant les piles immédiatement au-dessus ou en dessous du meilleur plan de mise au point. Exclure les régions floues de l'analyse.
      REMARQUE : Effectuez le comptage des cellules étiquetées sur la section alternative pour éviter le double comptage des mêmes cellules des sections adjacentes.

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Résultats

Les données représentatives de la coloration immunoperoxidase sont présentées à la figure 1 et à la figure 2. L'analyse immunohistochimique de la distribution d'OX-A et d'OX-2R dans l'intestin du poisson zèbre adulte a montré différents sites de localisation d'OX-A et d'OX-2R et leurs augmentations d'expression dans les cellules intestinales du poisson zèbre dio. Une coloration brune intense pour l'OX-A a été observée dans les cellules de l'intestin médial et an...

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Discussion

Préparation de l'échantillon

La préparation d'échantillons est la première étape critique du CSI. Un protocole fiable permet le maintien de la morphologie cellulaire, de l'architecture tissulaire et de l'antigénicité. Cette étape nécessite la collecte correcte de tissu, la fixation, et la section22,23. Le but de la fixation est de préserver les tissus et de réduire l'action des enzymes tissulaires ou des micro-o...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par Fondi Ricerca di Ateneo (FRA)2015-2016, Université de Sannio.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anti CB1Abcamab23703
Anti OX-2RSanta Cruzsc-8074
Anti-OXASanta Cruzsc8070
AquatexMerck1,085,620,050
Lapin biotinylé anti-chèvreVector LabBA-5000
acide citriqueSigma Aldrich251275
Microscope confocalNikonNikon Eclipse Ti2
CryostatLeica BiosystemCM3050S
DAPISigma Aldrich32670
Appareil photo numériqueLeica BiosystemDFC320
Appareil photo numérique pour microscope confocalNikonDS-Qi2
Donkey anti chèvre Alexa fluor 488-conjugué secondaire anticorpsThermo FisherA11055
Donkey anti chèvre Alexa fluor 594 Anticorps secondaires conjuguésThermo FisherA11058
Âne anti lapin Alexa fluor 488 Anticorps secondaires conjuguésThermo FisherA21206
Donkey anti lapin Alexa fluor 594 Anticorps secondaires conjuguésThermo FisherA21207
Éthanol absoluVWR20 821 330
Composé de section congeléeLeica BiosystemFSC 22 Média
H2O2Sigma Aldrich31642
HCl VWR20 252 290
ImmPACT DABVector labSK4105
MicroscopeLeica BiosystemDMI6000
MicrotomeLeica BiosystemRM2125RT
Na2HPO4Sigma AldrichS9763
NaClSigma AldrichS7653
NaH2PO4H2OSigma AldrichS9638
NaOHSigma AldrichS8045
Sérum d’âne normalSigma AldrichD9663
Sérum de lapin normalVector labS-5000
cire de paraffineCarlo Erba46793801
ParaphormaldeydeSigma AldrichP6148
citrate de sodium dihydratéSigma AldrichW302600
Triton X-100Fluka Analytical93420
TrizmaSigma AldrichT1503
VectaStain Elite ABC KitVector labPK6100
Xylene PureCarlo Erba392603
de section congelée

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