Article de méthode

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice In Vivo

DOI :

10.3791/59322

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23 août 2019

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1Instituto de Investigaciones Biomédicas, CSIC-UAM, 2Ciberonc, Instituto de Salud Carlos III

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole décrit les modèles de souris xénogreffes et orthotopiques de la tumorigénèse thyroïdienne humaine comme plate-forme pour tester des traitements inhibiteurs à base de microARN. Cette approche est idéale pour étudier la fonction des ARN non codants et leur potentiel en tant que nouvelles cibles thérapeutiques.

Résumé

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Les microARN (miARN) sont d'importants régulateurs de l'expression génique grâce à leur capacité à déstabiliser l'ARNm et à inhiber la traduction des ARNc cibles. Un nombre sans cesse croissant d'études ont identifié les miARN comme des biomarqueurs potentiels pour le diagnostic et le pronostic du cancer, ainsi que comme des cibles thérapeutiques, ajoutant une dimension supplémentaire à l'évaluation et au traitement du cancer. Dans le contexte du cancer de la thyroïde, la tumorigénèse résulte non seulement de mutations dans des gènes importants, mais aussi de la surexpression de nombreux miARN. En conséquence, le rôle des miARN dans le contrôle de l'expression des gènes thyroïdiens évolue comme un mécanisme important dans le cancer. Ici, nous présentons un protocole pour examiner les effets de la livraison miRNA-inhibiteur comme modalité thérapeutique dans le cancer thyroïde utilisant le xénogreffe humain de tumeur et les modèles orthotopic de souris. Après l'ingénierie des cellules tumorales thyroïdiennes stables exprimant le GFP et la luciferase, les cellules sont injectées dans les souris nues pour développer des tumeurs, qui peuvent être suivies par la bioluminescence. L'inhibition in vivo d'un miRNA peut réduire la croissance tumorale et réguler les cibles du gène miRNA. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer l'importance d'un miRNA déterminé in vivo, en plus d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Introduction

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Le cancer de la thyroïde est une malignité endocrinienne avec une incidence croissante, bien qu'en termes généraux il ait un bon résultat1. Néanmoins, certains patients développent des formes agressives de la maladie qui sont incurables et les bases moléculaires sont mal comprises2.

Les miARN sont des ARN non codants de 22 nucléotides qui régulent l'expression des gènes dans de nombreux tissus, généralement par liaison de base-paire à la région non translationnelle de 3' (3'UTR) des ARN de messager cible (ARNM), déclenchant la dégradation de l'ARNm ou la répression translationnelle

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Protocole

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L'expérimentation animale a été réalisée conformément au droit communautaire européen (86/609/CEE) et au droit espagnol (R.D. 1201/2005), avec l'approbation du Comité d'éthique du Consejo Superior de Investigaciones Cient-ficas (CSIC, Espagne).

1. Inoculation de flanc des cellules et traitement antagomiR intratumoral

  1. Préparation cellulaire
    1. Ingénieur d'une lignée de cellules cancéreuses de la thyroïde humaine Cal62 (KRASG12R et p53A161D mutations) pour surexprimer une construction transgénique qui exprime constitutivement GFP et luciferase (CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP). Sélectionnez le....

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Résultats

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Nous avons utilisé deux modèles différents de souris pour déterminer si la neutralisation d'un miRNA pourrait supprimer la croissance de tumeur. En conséquence, les cellules de Cal62-luc de tumeur humaine de tumeur ont été sous-cutanéement injectées dans les flancs des souris nues pour produire un modèle xénographe. Après deux semaines, des tumeurs ont été établies et pourraient être mesurées avec des étriers. À ce moment-là, des souris ont été injectées intratumoralement avec l'inhibiteur miR-146b, ou un contrôle approp.......

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Discussion

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Cet article décrit une méthode pour étudier la fonction in vivo d'un miRNA afin de mieux comprendre son rôle dans l'initiation et la progression de tumeur, et son potentiel en tant que cible thérapeutique dans le cancer thyroïde. Les modèles de xénogreffe de tumeur décrits ici sont basés sur l'utilisation des cellules qui peuvent être suivies par leur signal de bioluminescence, permettant la mesure de la croissance de tumeur in vivo sous l'influence d'un traitement. En outre, nous décrivons l'utilisation d'un traitement .......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

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Nous sommes reconnaissants à Raquel Arocha Riesco pour son aide dans le traitement et les soins des souris. Nous remercions le Dr J. Blanco (Institut catalan pour la chimie avancée-CSIC) et le Dr E. Mato (Institut de Reserca de l'Hospital de la Santa Creu i Sant Pau) Barcelone (Espagne) pour avoir offert respectivement les cellules CMV-Firefly luc-IRES-EGFP et Cal62-Luc.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AntagomiR : inhibiteur de miARN mirVanaThermo Fisher4464088In Vivo Ready
Membrane Matrix : Matrigel Matrice de membrane basale Haute concentrationCorning#354248
DICERanticorps Abcamab14601IHQ : 1/100
In vivo réactif d’administration : Invivofectamine 3.0 RéactifThermo FisherIVF3005
Logiciel d’imagerie In vivo : Système d’imagerie IVIS-Lumina IICaliper Life Sciences
Contrôle négatif : inhibiteur de miARN mirVana, contrôle négatif #1Thermo Fisher4464077In Vivo Ready
PCNAanticorps Abcamab92552WB : 1/2 000
PTEN anticorpsSanta Cruzsc-7974WB : 1/1 000
XenoLight D-Luciferin - Substrat bioluminescent au sel K+PerkinElmer122799dilué dans du PBS

Références

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  1. Lim, H., Devesa, S. S., Sosa, J. A., Check, D., Kitahara, C. M. Trends in Thyroid Cancer Incidence and Mortality in the United States. Journal of the American Medical Association. 317 (13), 1338-1348 (2017).
  2. Landa, I., et al.

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Mots-clés

Inhibition des micro ARNMod le de cancer de la thyro deInjection tumorale orthotopiqueImagerie par bioluminescenceTraitement par antagomiRAnalyse de la croissance tumoraleLign e cellulaire CAL 62Mod le de souris nuesInjection r tro orbitaireSubstrat D lucif rine

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