Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

HOX Locus Focused CRISPR/sgRNA bibliothèque préalable identifier critique FCCT limites

7.8K vues

⸱

DOI :

10.3791/59382

⸱

31 mars 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Physiological Sciences, University of Florida, 3Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida

Dans cet article

Résumé

Une bibliothèque CRISPR/sgRNA a été appliquée à interroger des gènes codant pour des protéines. Toutefois, la faisabilité d’une bibliothèque de sgRNA afin de découvrir la fonction d’une limite de la FCCT dans la régulation des gènes reste inexplorée. Nous décrivons ici une bibliothèque de sgRNA spécifiques de locus HOX afin d’élucider la fonction des limites de la FCCT dans loci HOX .

Résumé

Facteur de CCCTC-liaison (FCCT)-médiation stable topologiquement associant des domaines (TADs) jouent un rôle crucial dans les interactions contraignantes des éléments d’ADN qui sont trouvent dans le pays voisin dat. FCCT joue un rôle important dans la régulation de l’expression spatiale et temporelle des gènes HOX qui contrôlent le développement embryonnaire, la structuration du corps, hématopoïèse et leucémogenèse. Cependant, il reste largement méconnue si et comment HOX loci associés FCCT limites réglementent l’organisation de la chromatine et expression du gène HOX . Dans le protocole actuel, une bibliothèque de mise en commun de sgRNA spécifiques ciblant tous les sites de fixation FCCT dans les locus HOXA/B/C/D a été générée afin d’examiner les effets des perturbateurs limites FCCT associées à la chromatine sur la formation de TAD et gène HOX expression. Par le biais de CRISPR-Cas9 dépistage génétique, le site de liaison FCCT situé entre les gènes HOXA7/HOXA9 (CBS7/9) a été identifié comme un régulateur essentiel du domaine de chromatine oncogènes, comme étant important pour le maintien de gène HOX ectopique modèles d’expression de MLL-réarrangé la leucémie myéloïde aiguë (AML). Ainsi, cette bibliothèque sgRNA dépistage approche donne une idée nouvelle organisation génomique FCCT médiée au locus spécifique et fournit également une base pour la caractérisation fonctionnelle des éléments réglementaires génétiques annotés, les deux codes et non-codantes, au cours d’un processus biologique normal dans l’ère du projet génome humain après.

Introduction

Des études d’interaction du génome récentes ont révélé que les formes du génome nucléaire humain stable topologiquement associant domaines (TADs) qui sont conservées à travers les espèces et les types de cellules. L’organisation du génome dans des domaines distincts facilite et limite les interactions entre les éléments de régulation (par exemple, des promoteurs et des rehausseurs). Le facteur de liaison CCCTC (FCCT) lie aux limites du TAD et joue un rôle crucial dans les interactions contraignantes des éléments d’ADN qui sont trouvent dans la voisine TADs1. Cependant, génome large FCCT liaison de données a révélé que, bien que FCCT interagit principalement avec les mêmes ADN-sites dans différents types de cellules, il fonctionne souvent comme un obstacle de la chromatine dans un site spécifique à un type de cellule, mais pas dans l’autre, ce qui suggère que les fonctions FCCT ainsi que d’autres activités dans la formation de la chromatine limites2. Ce qui reste inconnu, c’est savoir si les éléments de frontière (sites de liaison du FCCT) sont directement liées à la fonction biologique de la FCCT et comment ces liens se produisent. Par conséquent, nous émettons l’hypothèse que les sites de fixation spécifiques FCCT dans le génome directement régulent la formation des dat et contrôlent les interactions de promoteur/enhancer dans ces domaines ou entre les domaines voisins. L’achèvement du homme et projets de séquençage du génome des souris et des analyses subséquentes épigénétiques ont découvert de nouvelles signatures moléculaires et génétiques du génome. Cependant, le rôle des signatures spécifiques/modifications dans la régulation des gènes et la fonction cellulaire, ainsi que leurs mécanismes moléculaires, doivent encore être pleinement compris.

Plusieurs sources de données prend en charge que les DAT induite par le FCCT représentent la chromatine fonctionnelle domaines3,4,5. Bien que le FCCT interagit principalement avec les mêmes ADN-sites dans différents types de cellules, génome large FCCT ChIP-seq données révèlent que FCCT fonctionne souvent comme un obstacle de la chromatine dans un type de cellule, mais pas dans les autres2. FCCT joue un rôle essentiel au cours du développement par la médiation du génome organisation4,6,7. Perturbation des limites de la FCCT altérée des interactions enhancer/promoteur et l’expression des gènes, menant au colmatage du développement. Ceci suggère que FCCT médiée dat sont non seulement des composants structurels, mais aussi des unités réglementaires requises pour enhancer bonne action et gène transcription5,8,9.

Les gènes HOX jouent un rôle crucial durant le développement embryonnaire et ils sont limités dans le temps et dans l’espace dans leurs profils d’expression. Le locus HOXA forme deux dat stable, séparant les gènes antérieurs et postérieurs par un élément de limite associée à FCCT dans les CSEh et de cellules IMR901. Des rapports récents ont démontré que le HoxBlinc, un lncRNA de locus associés HoxB , intervient dans la formation de la FCCT réalisé TADs et interactions enhancer/promoteur dans le locus HOXB . Cela conduit à l’activation de gène HOXB antérieure lors d’engagement et la différenciation ESC10. En outre, au locus spécifique dont le locus HOXA , altération de la FCCT véhiculée par les profils d’expression génique spécifique lignée TAD domaines changés et a été associée au développement de la maladie États11,12. La preuve étaye une fonction primordiale pour FCCT dans la coordination transcription génique et déterminer l’identité de la cellule en organisant le génome en domaines fonctionnels.

Malgré son rôle dans le développement embryonnaire, au cours de l’hématopoïèse, HOX gènes régulent la fonction des cellules (HS/PC) souches et progénitrices hématopoïétique. Cela se fait en contrôlant l’équilibre entre la prolifération et la différenciation10,13,14,15. L’expression des gènes HOX est étroitement contrôlée tout au long de la spécification et la différenciation de cellules hématopoïétiques, avec la plus haute expression dans HS / expression génique PCs. HOX diminue graduellement au cours de la maturation, avec ses niveaux les plus bas se produisant dans différenciés de cellules hématopoïétiques16. Dérégulation du gène HOX est un mécanisme dominant de transformation leucémique par dysregulating des propriétés autorenouvellement et différenciation de HS/PCs, conduisant à une transformation leucémique17,18. Cependant, le mécanisme d’établir et de maintenir normal vs patrons d’oncogènes expression des gènes HOX ainsi que des réseaux de régulation associés reste peu clair.

CRISPR-Cas9 sgRNA criblage a été largement utilisé pour interroger de gènes codant pour des protéines19 comme bien que non codantes des gènes, comme lncRNA20 et miRNA21 chez différentes espèces. Toutefois, le coût d’utilisation de la bibliothèque de sgRNA CRISPR-Cas9 à identifier de nouvelles cibles génomiques demeure élevé, parce que le séquençage du génome de haut débit est souvent appliqué pour vérifier le criblage de sgRNA. Notre sgRNA système de contrôle se concentre sur les loci de génome spécifique et évalue le ciblage sgRNAs par une étape de RT-PCR selon l’expression du gène marqueur, comme HOXA9. En outre, Sanger séquençage a confirmé que le sgRNA a été intégré dans le génome et Indel mutations peut être détecté pour identifier la sgRNA site de ciblage. Par l’intermédiaire du dépistage génétique de la CRISPR-Cas9 locus-spécifiques, la limite de la chromatine CBS7/9 a été identifiée comme un régulateur critique pour l’établissement domaine de chromatine oncogènes et le maintien des modèles d’expression de gène HOX ectopiques dans la pathogenèse de l’AML 12. la méthode peut être largement appliquée pour identifier non seulement la fonction spécifique du contour de la FCCT dans le développement embryonnaire, l’hématopoïèse, leucémogenèse, mais aussi limite FCCT comme cibles thérapeutiques potentielles futures thérapie épigénétique.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. FCCT sgRNALibrary Design à l’aide d’un outil en ligne

  1. Concevoir la sgRNA ciblant les sites de fixation FCCT dans les locus HOX humains en utilisant l’outil concepteur de la plate-forme (GPP) de perturbation génétique (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
  2. Synthétiser un total de 1 070 sgRNAs composé de sgRNAs ciblage 303 gènes ciblage aléatoires, 60 témoins positifs, 500 non-homme-ciblage des contrôles et 207 éléments FCCT ou lncRNA ciblant les gènes (Figure 1, tableau 1). Chaque élément d’ADN ciblage est ciblé par les différentes sgRNAs 5-10.

2. sgRNA bibliothèque clonage

  1. Cloner les oligonucléotides synthétisés dans le vecteur lentiviral épine dorsale CRISPR (lentiCRISPRv2).
    1. Digérer le vecteur LentiCRISPRv2 avec l’enzyme de restriction BsmBI à 37 ° C pendant 2 h.
    2. Recherchez la présence de la bande plus large (environ 12 873 bp) sur le gel après digestion de BsmBI et de le purifier ensuite avec le kit d’extraction de gel.
      Remarque : Un morceau de petit remplissage 2 Ko est également présent sur le gel après digestion, mais cela doit être ignorée.
    3. Ligaturer les oligonucléotides synthétisés et digérées LentiCRISPR vector avec 150 ng de LentiCRISPR ADN, 1 µL de 10 µM oligos, 2 µL de tampon de ligase 10 x T4, 1 µL de T4 ligase, digéré et puis les incuber à 16 ° C durant la nuit.
  2. Transformer la bibliothèque CRISPR/sgRNA des gènes dans des cellules capables d’electro à l’amplification.
    1. Préparer l’électroporateur à 1.8 kV, Ω 200 et 25 µF. Réchauffez la récupération médias SOC dans un bain-marie à 37 ° C, puis réchauffez LB ampicillin antibiotiques plaques à 37 ° C.
    2. Décongeler les cellules compétentes sur la glace pendant 10 min.
    3. Préparer les tubes micro-centrifugeuse de 1,5 mL et 1 mm électroporation cuvettes sur la glace.
    4. Mélanger 1 µL d’une ADN de plasmide de bibliothèque 10 ng/µL dans 25 µL de cellules compétentes dans un tube à centrifuger-micro 1,5 mL et mélanger doucement en effleurant le fond du tube plusieurs fois manuellement.
    5. Une fois que la cuve est assez froide, transvaser le mélange de cellules ADN/compétente dans il. Appuyez deux fois sur le comptoir et essuyer les gouttelettes d’eau de l’extérieur de la cuve avec un papier de soie. Ensuite, placez la cuve dans le module d’électroporation et appuyez sur impulsion.
    6. Immédiatement ajouter 975 µL de 37 ° C préchauffé médias SOC. Mix de pipetage de haut en bas et transférez dans un tube de 15 mL.
    7. Faites pivoter et incuber à 37 ° C pendant 1 h.
    8. Diluer 100 cellules µL dans 900 µL des médias SOC et déposer sur une plaque de gélose antibiotique ampicilline LB 100 µL. Incuber une nuit à 37 ° C.
  3. Extraire l’ADN plasmidique des colonies combinées avec une colonne de maxi-prep comme indiqué dans le protocole du fabricant.
    1. Grattez toutes les colonies de la gélose LB et ensemencer une culture starter 2 ml de milieu d’antibiotique ampicilline LB et incuber une nuit à 37 ° C avec agitation vigoureuse (~ 200 x g).
    2. Diluer au 1/500 de la culture starter dans 100 mL de milieu ampicilline LB et incuber à 37 ° C pendant 12 à 16 h avec agitation vigoureuse (~ 200 x g).
    3. Récolter le culot cellulaire bactérienne par centrifugation à 6 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
    4. Resuspendre le culot bactérien dans 10 mL de tampon de suspension.
    5. Lyse le culot de suspension avec 10 mL de tampon lyse et vigoureusement inverser 4 - 6 fois. Incuber le lysat pendant 5 min à température ambiante.
    6. Neutraliser le lysat avec 10 mL de tampon de neutralisation réfrigérés. Mélanger en retournant délicatement les tubes le 4 - 6 fois et il incuber pendant 20 min sur la glace.
    7. Tournez en bas à 13 500 x g pendant 30 min à 4 ° C. Rapidement transférer le surnageant contenant l’ADN de plasmide dans un nouveau tube.
    8. Répétez l’étape 2.3.7 et transférer rapidement le surnageant contenant l’ADN de plasmide dans un nouveau tube.
    9. Équilibrer la colonne en appliquant 10 mL de tampon d’équilibration et laissez la colonne vide par écoulement gravitaire.
    10. Ajouter le liquide surnageant à la colonne et lui permettre d’entrer la résine par écoulement gravitaire.
    11. Laver la colonne avec 2 x 30 mL de tampon de lavage.
    12. Éluer l’ADN avec 15 mL de tampon d’élution.
    13. Précipiter l’ADN 10,5 ml d’isopropanol à température ambiante à l’ADN éluée. Mix et un essorage descendre immédiatement à 15 000 x g pendant 30 min à 4 ° C et éliminer délicatement le surnageant.
    14. Laver le culot d’ADN avec 5 mL d’éthanol à 70 %, granule d’ADN de centrifugeuse à 15 000 x g pendant 10 min et éliminer le surnageant clair.
    15. Répétez l’étape 2.5.14 deux fois plus.
    16. Centrifuger le granule d’ADN à 15 000 x g pendant 10 min et éliminer délicatement le surnageant sans déranger le culot d’ADN.
    17. Sécher le culot pendant 5-10 min et dissoudre l’ADN contenu dans un volume de tampon (buffer de TE, pH 8,0) requis.

3. le titre élevé sgRNA bibliothèque Lentivirus génération

  1. Préparation de cellules : les cellules HEK293T Culture dans de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) additionné de 10 % (vol/vol) sérum fœtal (SVF) et antibiotique de pénicilline-streptomycine de 1 % (vol/vol) (PS) dans des flacons de T-25. Placez-les dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2.
  2. Paquet de lentivirus : co transfecter cellules HEK293T avec 20 µg de vecteurs de bibliothèque purifiée de l’étape 2, 15 µg du plasmide paquet (psPAX2) et 10 µg du plasmide enveloppe (pMD2.G) pendant 48 h avant la récolte du virus.
  3. Collection de virus : après 48 h, collectthe virus surnageant et filtrer le surnageant à travers une membrane 0,45 µm hypoprotidique liaison PVDF de virus.
  4. Concentration de virus : concentrer le liquide surnageant des gènes par 50 fois en utilisant le concentrateur et le virus MOI d’essai à l’étape 5.
  5. Stockage de virus : le concentré aliquote virus et magasin dans un congélateur à-80 ° C.

4. optimisé Puromycine Concentration

  1. Culture de cellules de la leucémie : des cellules de Culture MOLM13 AML en RPMI 1640 additionné de 10 % (vol/vol) sérum fœtal (SVF) et 1 x antibiotiques pénicilline-streptomycine (PS) dans une fiole de T-125. Placez-les dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2.
    Remarque : Les cellules sont généralement passés chaque 4-5 d à un ratio de partage de 1:4 ou 1:6, jamais permettant aux cellules d’atteindre plus de 70 % confluence.
  2. Mettre en place des cellules de MOLM13 dans une plaque de 12 puits avec une densité de 1,0 x 104 cellules/mL, à un volume total de 2 mL par puits (2,0 x 104 cellules).
  3. Analyse temporelle : cellules MOLM13 de traiter avec la puromycine pendant 7 jours en augmentant les concentrations (µg/mL 0,1, 0,2 µg/mL, 0,5 µg/mL, 1,0 µg/mL et 2,0 µg/mL)
    1. Mettre en place des cellules MOLM13 sans traitement puromycine au jour J0 et mis en place 3 puits répétées sans traitement puromycine comme un contrôle du jour 0 au jour 7.
    2. Traiter les cellules MOLM13 avec 0,1 µg/mL, 0,2 µg/mL, 0,5 µg/mL, 1,0 µg/mL et 2,0 µg/mL, séparément, avec chaque condition expérimentale contenant 3 puits répétées.
    3. Compter le ratio de cellules vivantes et faire une courbe de survie du jour 0 au jour 7, qui contient toutes les conditions.
  4. Courbe de survie : coloration des cellules à Trypan blue comte viabilité et tous les jours pour obtenir les courbes de survie pour chaque concentration de puromycine.
  5. Optimiser la concentration minimale puromycine : déterminer la concentration de la puromycine minime grâce à la coloration bleu Trypan, en qui MOLM13 toutes les cellules sont tuées entre 5-7 jours.

5. titrage d’une bibliothèque des gènes dans les cellules de la leucémie MOLM13

  1. Préparation de cellules AML : prélever des cellules MOLM13 AML avec le milieu de la transduction (RPMI 1640, 10 % SVF et 1 % PS 8,0 µg/mL de milieu de revêtement) à une densité de 1,5 x 106 cellules/ml.
  2. Cellules de lieu MOLM13 dans la plaque de 12 puits avec 1. 5 x 106 cellules dans chaque puits.
  3. Décongeler le lentivirus : Retirez le lentivirus concentré du congélateur-80 ° C et décongelez-le sur la glace.
  4. Mix MOLM13 cellules avec une dose différente du lentivirus concentré dans des puits distincts, y compris 0, 1, 2.5, 5, 7,5 et 10 µL (totales 6 groupes).
  5. Immédiatement, centrifuger ces mélanges à 1 000 x g pendant 2 h à 33 ° C et les plaques de 12 puits de transfert retour à l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 4 h.
  6. Après 4 h, tournez en bas les cellules infectées à 400 x g pendant 5 min à température ambiante.
  7. Doucement aspirer le surnageant sans déranger le culot cellulaire et remettre en suspension les cellules transduits avec supports neufs (RPMI 1640, PS de SVF et 1 % 10 %) et puis transférez-les sur flacons T-25 et incuber à 37 ° C pendant 48 h sans puromycine.
  8. Après 48 h, diviser ces cellules en 2 flacons (2 groupes) : un groupe expérimental traité avec 1 puromycine µg/mL pendant 5 jours et un groupe témoin sans traitement puromycine pendant 5 jours.
  9. Procéder à la sélection puromycine pendant 5 jours avec 1 puromycine µg/mL après l’étape 4 jusqu'à ce que toutes les cellules de contrôle non-transduites sont morts. Échange pour les supports neufs tous les 2 jours.
  10. Mesurer la valeur optimisée de MOI pour la transduction en divisant le nombre de cellules vivantes, traités avec la puromycine avec le nombre de cellules sans traitement puromycine.

6. la transduction de la bibliothèque de KO CRISPR-Cas9 regroupées

  1. Transduction avec lentivirus : infecter 1,5 x 106 MOLM13 cellules avec 0,3 MOI de lentivirus sgRNA mis en commun dans un milieu (RPMI 1640, 10 % FBS, PS 1 % et 8 µg/mL de milieu de revêtement) en plaque 6 puits et utiliser les cellules sans l’infection lentivirus comme un contrôle.
  2. Immédiatement, centrifuger la plaque 6 puits à 1 000 x g pendant 2 h à 33 ° C à spinfect les cellules et les plaques de transfert retour à l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 4 h.
  3. Tournez en bas les cellules infectées à 400 x g pendant 5 min à température ambiante.
  4. Doucement aspirer le surnageant sans déranger le culot cellulaire et remettre en suspension les cellules transduits avec supports neufs (RPMI 1640, PS de SVF et 1 % 10 %) et puis transférez-les sur flacons T-25 et incuber à 37 ° C pendant 48 h sans puromycine.
  5. Après 48 h, traiter des cellules avec la 1 puromycine µg/mL pendant 5 jours. Après 2 jours d’échange pour les supports neufs et garder une densité cellulaire optimal.
  6. Le seul clone en plaques 96 puits à limiter les méthodes de dilution des semences et incuber ces clones unique à 37 ° C et 5 % de CO2. Leur culture pendant 3 à 4 semaines.
  7. Après qu’une seule cellule grandit dans une population, la moitié des cellules de transfert en plaques 24 puits pour mise en culture sous sélection puromycine et vérifier ces clones à l’étape suivante. Garder le reste des cellules.

7. sélection de la bibliothèque de KO CRISPR-Cas9 mis en commun avec le One-step RT-qPCR

  1. Déterminer l’efficacité du clone sgRNA intégré de dépistage en évaluant l’expression du gène marqueur HOXA9 avec une seule étape de la transcriptase-inverse PCR (RT-qPCR en une seule étape).
    Remarque : HOXA9 sont fortement exprimés dans les cellules MOLM13 AML leucémogenèse22,23.
  2. Comte le sgRNA intégré MOLM13 cellulaire et transfert 1 x 104 cellules / puits d’une plaque PCR 96 puits.
  3. Centrifuger le tube à 1 000 x g pendant 5 min et ensuite soigneusement retirer et jeter le surnageant avec une pipette sans déranger le culot cellulaire.
  4. Laver les cellules avec 125 µL de tampon PBS et centrifuger le tube à 1 000 x g pendant 5 min. Puis retirez 120 µL du liquide surnageant à l’aide d’une pipette et le conserver environ 5 µL de PBS dans chaque puits.
  5. Ajouter 50 µL du mélange maître lyse cellulaire contenant 48 µL de tampon de lyse cellulaire, 1 µL de solution de protéinase K (10 mg/mL) et 1 µL de solution de DNase (1 mg/mL) dans chaque puits. Puis la pipette et descendre 5 fois pour remettre en suspension le culot cellulaire.
  6. Incuber le mélange pendant 10 min à température ambiante, suivie de 5 min à 37 ° C et puis 75 ° C pendant 5 min.
  7. Stocker le lysat cellulaire au congélateur-80 ° C.
  8. La préparation de la réaction de RT-qPCR one-step : décongeler le mélange en une seule étape de réaction et d’autres composants de réaction à 4 ° C. Ensuite tournez en bas brièvement à collecter des solutions au fond des tubes et placer sur la glace sans lumière. Mélangez et faites tourner doucement.
  9. Ajouter 1 µL de lysat cellulaire dans les puits PCR avec le mélange de réaction de RT-qPCR, y compris 1 µL d’apprêt avant du gène marqueur (300 nM) et amorce de marche arrière (300 nM), 0.125 µL de la transcriptase inverse (10 U/µL) et 5 µL du mélange de réaction en une seule étape (x 2).
  10. Sceller le puits avec film optiquement transparent et doucement vortex et mélanger les composants de la réaction.
  11. Placer la plaque PCR 96 puits sur un appareil de PCR en temps réel.
  12. Exécutez la réaction de transcription inverse pendant 10 min à 50 ° C, suivie d’inactivation de la polymérase et la dénaturation de l’ADN pendant 1 min à 95 ° C.
  13. Réaliser la RT-PCR avec 40 cycles de réaction PCR : dénaturation pendant 15 s à 95 ° C, recuit/extension et plaque fluorescence lecture pour 20 s à 60 ° C, puis analyse des courbes de fusion entre 65 et 95 ° C par incréments de 0,5 ° C à 2-5 s/étape.
  14. Mettre en place surexprimés, réprimés et aucun changement de groupes selon les niveaux d’expression du gène HOXA9 par comparaison au contrôle, séparément. Utiliser β-actin gene comme un contrôle de gène de ménage.

8. vérification des sgRNAs intégré des Clones positifs par le biais de génotypage et séquence de Sanger

  1. Vérifier les clones d’expression HOXA9 diminué par Sanger sequencing et effectuer une PCR avec 50 à 100 ng MOLM13 du génome ADN, 5 µL polymérase réaction de tampon (10 x), 1 µL avant l’apprêt (10 µM) (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG) et inverse 1 µL apprêt (10 µM) (TCTACTATTCTTTCCCCTGCACTGTTGTGGGCGATGTGCGCTCTG), 1 µL dNTP (10mM), la polymérase 1 unité (5 U /µL). Effectuer la réaction de PCR avec la dénaturation initiale 94 ° c pendant 30 s et puis plus dénaturation à 94 ° C pendant 20 s, recuit à 56 ° C pendant 20 s, extension à 68 ° C pendant 20 s (total 30 cycles), ultime prorogation à 68 ° C pendant 10 min et puis maintenant à 4 ° C.
  2. Extraire et purifier les produits PCR (dimensions 285 bp) avec un Kit de Purification de PCR.
  3. Ligaturer les produits PCR purifiés dans le vecteur T avec 2 µL T4 ligature de tampon (10 x), 50 ng T vecteur ADN (50 ng/µL), 25 ng purifiée PCR ADN (285 bp), ligase T4 de 1 µL (3 unités/µL) et place la ligature mélangent dans un incubateur à 16 ° C durant la nuit.
  4. Transférer le mélange de ligation dans la cellule compétente DH5α, poussent sur une plaque de gélose antibiotique ampicilline LB et incuber une nuit à 37 ° C.
  5. Sélectionner les clones unique de la plaque LB et les vérifier par génotypage et Sanger séquençage.

9. détection des sgRNAs Mutation Indel induite par nucléase Digestion dosage

  1. Détecter que le sgRNA intégré unique clone induite Indel taux par un nucléase test test.
  2. Préparer séparément les amplimères PCR avec 50 à 100 ng Indel mutant (test) et ADN de type sauvage (WT, référence) en tant que modèle PCR, 5 µL de tampon de réaction polymérase (x 10), 1 µL dNTP (10mM), polymérase 1 unité (5 U/µL), primer avant 1 µL (10 µM) (5'-GAGATGGCGGCGCGGAAG-3') et 1 µ L inverse amorce (10 µM) (5'-AAATATAGGGCGGCTGTTCACT-3'). La réaction PCR a été réalisée avec la dénaturation initiale à 98 ° C pendant 30 s, puis la dénaturation à 98 ° C pendant 20 s, recuit à 56 ° C pendant 20 s, extension à 72 ° C pendant 30 s (total 30 cycles) et une extension finale à 72 ° C pendant 10 min et maintenant à 4 ° C.
  3. Mettre en place le groupe de mélange hétéroduplex avec 200 ng de la « référence » (20 ng/µL) et 200 ng amplimères PCR « test » (20 ng/µL) dans le tube PCR de 0,2 mL, et le groupe de mélange de homoduplex avec seulement 400 ng de « référence » amplimères PCR comme un contrôle.
  4. Séparément, incuber le mélange hétéroduplex homoduplex à 95 ° C pendant 5 min dans un bécher de 1 L rempli avec 800 mL d’eau et ensuite refroidir à température ambiante pour recuire et former des hétéroduplex ou homoduplexes progressivement.
  5. Séparément digest 400 ng du mélange hétéroduplex et homoduplex recuit avec 1 µL indel mutation détection la nucléase (2,5 U/µL) et 2 µL nucléase réaction tampon (10 x) à 42 ° C pendant 60 min.
  6. Analyse des échantillons digérés avec électrophorèse sur gel d’agarose, l’ADN de mélange hétéroduplex devrait être coupé en petits fragments (bp 70-250) et le homoduplex ADN (320 bp) ne doivent pas être coupées.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

CRISPR-Cas9 technologie est un outil de recherche performant pour les études de génomique fonctionnelles. Il supplante rapidement le gène classique techniques d’édition et a haute utilité pour des applications axées sur le gène pangénomique tant qu’individuelles. Ici, la première individuellement clonés locus-spécifiques CRISPR-Cas9-arrayed sgRNA bibliothèque contient 1 070 sgRNAs composé de sgRNAs ciblage 303 gènes ciblage aléatoires, 60 témoins positifs, 500 non-homme-ciblage des contrô...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Les gènes codant pour des protéines liées sgRNA bibliothèques ont été appliquées dans un système de dépistage fonctionnelle à l’identification des gènes et des réseaux de régulation des fonctions cellulaires spécifiques par le biais de sgRNA enrichissement24,25,26 ,27,28. Plusieurs région non codante associés sgRNA bibliothèques apparaissaient également dans ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Nous n’avons aucun conflit d’intérêt concernant ce rapport.

Remerciements

Les auteurs remercient également Nicholas Cesari pour l’édition du manuscrit. Le travail a été soutenu par des subventions du National Institute of Health (S.H., R01DK110108, R01CA204044).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Réactif de lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000-008
Protéinase KThermo Fisher Scientific25530049
PuromycineThermo Fisher ScientificA1113802
cellules Stbl3  ;Technologies de la vie  ;
HEK293TATCCCRL-3216
MOLM-13DSMZACC 554
lentiCRISPRv2Addgene52961
pMD2.GAddgene12259
psPAX2Addgene12260
pGEM® ;-T Easy Vector Systems  ;PromegaA137A
T4 ligase  ;Biolabs de la Nouvelle-Angleterre  ; M0202S
QIAquick Kit d’extrait de gelQIAGEN28706
QIAuick Kit de purification PCRQIAGEN28106
SingleShot&trade ; SYBR® ;   ; Kit Vert One-StepLaboratories Bio-Rad1725095
QIAGEN Plasmid Maxi KitQIAGEN12163
Dulbecco' s Eagle Medium modifié  ;Thermo Fisher Scientific  ;
RPMI 1640  ;Thermo Fisher Scientific11875093
sérum de veau fœtal (FBS)  ;Thermo Fisher Scientific10-082-147
Pénicilline/streptomycine/L-glutamine  ;Technologies de la vie  ;
10378016 Concentrateur Lenti-X  ;Clontech631232
Trypan Blue SolutionThermo Fisher Scientific15250061
PolybreneSanta Cruz Biotechnologysc-134220
Saline tamponnée au phosphate (PBS)  ;Genessee Scientific  ; 25-507
Tampon TAE  ;Thermo Fisher Scientific  ;FERB49
Géomètre® ; Kits de détection de mutationsIntegrated DNA Technologies706020
Biorad Universal Hood II Gel Doc SystemBio-Rad170-8126
Centrifugeuse 5424 REppendorf5404000138
Bains secs/chauffe-blocs numériquesThermo Fisher Scientific88870002
TSX Series Congélateurs ultra-basThermo Fisher ScientificTSX40086V
Forma&trade ; Steri-Cult&Commerce ; CO2  ; IncubateursThermo Fisher Scientific3308
Herasafe&trade ; KS, Classe II Enceinte de Sécurité BiologiqueThermo Fisher Scientific51022484
Sorvall&trade ; Légende et commerce ; Centrifugeuse XT/XF SeriesThermo Fisher Scientific75004506
Fisherbrand&trade ;   ; Isotemp&trade ; Bains d’eauThermo Fisher ScientificFSGPD02
Thermo Scientific&trade ;   ; Localisateur et commerce ; Plus Rack and Box SystemsThermo Fisher Scientific13-762-353
CFX96 Touch Système de détection PCR en temps réelBio-Rad1855195
MiniAmp&trade ; ThermocycleurApplied Biosystems technologyA37834
Thermo Scientific&trade ;   ; Hibou et commerce ; EC300XL2 Bloc d’alimentation compactThermo Fisher Scientific7217581
Thermo Scientific&trade ;   ; Hibou et commerce ; EasyCast&trade ; B1 Mini Systèmes d’électrophorèsesur gel Thermo Fisher Scientific09-528-178
VWR® ; Rotateur de tubes et rôtissoiresVWR International10136-084
VWR® ; Mini agitateur à incubationVWR International12620-942
Balance analytique MS104TS/00METTLER TOLEDO30133522
DS-11 FX et DS-11 FX+ SpectrophotomètreDeNovix Inc.DS-11 FX
C73730311965084

Références

  1. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  2. Cuddapah, S., et al. Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains. Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).
  3. Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
  4. Tang, Z., et al. CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription. Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).
  5. Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).
  6. Dowen, J. M., et al. Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes. Cell. 159 (2), 374-387 (2014).
  7. Phillips-Cremins, J. E., et al. Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment. Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).
  8. Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation. Genes & Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).
  9. Narendra, V., et al. CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation. Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).
  10. Deng, C., et al. HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development. Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).
  11. Patel, B., et al. Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).
  12. Luo, H., et al. CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia. Blood. 132 (8), 837-848 (2018).
  13. Dou, D. R., et al. Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development. Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).
  14. Lawrence, H. J., et al. Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells. Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).
  15. Deng, C., et al. USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription. PLOS Genetics. 9 (6), e1003524(2013).
  16. Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis. Blood. 120 (3), 519-527 (2012).
  17. Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia. Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).
  18. Rice, K. L., Licht, J. D. HOX deregulation in acute myeloid leukemia. Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).
  19. Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells. Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).
  20. Zhu, S., et al. Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).
  21. Kurata, J. S., Lin, R. J. MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs. RNA. 24 (7), 966-981 (2018).
  22. Collins, C. T., Hess, J. L. Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets. Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).
  23. Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice. The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).
  24. Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).
  25. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  26. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  27. Zhou, J., et al. Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting. The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).
  28. Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
  29. Rajagopal, N., et al. High-throughput mapping of regulatory DNA. Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).
  30. Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).
  31. Rezaei, N., et al. FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics. Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).
  32. Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions. Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).
  33. Wilken, M. S., et al. DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements. Epigenetics Chromatin. 8, 8(2015).
  34. Narlikar, L., Ovcharenko, I. Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).
  35. Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Criblage CRISPRsites de liaison de CTCFr gulation des g nes HOXtransduction lentiviraleanalyse par RT qPCRs quen age Sangeressai de digestion par nucl aseformation d h t roduplexescellules MOLM13
HOX Locus Focused CRISPR/sgRNA bibliothèque préalable identifier critique FCCT limites
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.