Article de méthode

Visualisation des complexes mitophatonus endogènes in situ dans les cellules bêta pancréatiques humaines utilisant l'analyse de la ligation de proximité

DOI :

10.3791/59398

⸱

2 mai 2019

 , 
1Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, 2VA Ann Arbor Healthcare System

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit une méthode pour l'analyse quantitative de la formation complexe de protéine de mitophagie spécifiquement dans les cellules bêta des échantillons humains primaires d'islet. Cette technique permet ainsi l'analyse de la mitophagie à partir de matériel biologique limité, qui sont cruciaux dans les échantillons précieux de cellules bêta pancréatiques humaines précieuses.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La mitophagie est une voie de contrôle de la qualité mitochondriale essentielle, qui est cruciale pour les bioénergétiques de cellules bêta d'écœuras pancréatiques pour alimenter la libération d'insuline glucose-stimulée. L'évaluation de la mitophagie est difficile et nécessite souvent des journalistes génétiques ou de multiples techniques complémentaires pas facilement utilisées dans les échantillons de tissus, tels que les îlots pancréatiques humains primaires. Ici nous démontrons une approche robuste pour visualiser et quantifier la formation des complexes endogènes principaux de mitophagie dans les îlots pancréatiques humains primaires. En utilisant la technique d'analyse de la ligature de proximité sensible pour détecter l'interaction des régulateurs de mitophagie NRDP1 et USP8, nous sommes en mesure de quantifier spécifiquement la formation de complexes essentiels de mitophagie in situ. En couplant cette approche pour contrer le facteur de transcription PDX1, nous pouvons quantifier les complexes de mitophagie, et les facteurs qui peuvent altérer la mitophagie, en particulier dans les cellules bêta. La méthodologie que nous décrivons surmonte le besoin de grandes quantités d'extraits cellulaires nécessaires pour d'autres études d'interaction protéine-protéine, telles que l'immunoprécipitation (IP) ou la spectrométrie de masse, et est idéale pour les échantillons humains précieux d'îc généralement pas disponibles en quantités suffisantes pour ces approches. En outre, cette méthodologie évite la nécessité de techniques de tri de flux pour purifier les cellules bêta d'une population hétérogène d'îlet pour les applications de protéines en aval. Ainsi, nous décrivons un protocole valable pour la visualisation de la mitophagie fortement compatible pour l'usage dans les populations hétérogènes et limitées de cellules.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules bêta pancréatiques produisent l'insuline nécessaire pour maintenir l'homéostasie normale de glucose, et leurs résultats d'échec dans le développement de toutes les formes de diabète. Les cellules bêta conservent une capacité mitochondriale robuste pour générer l'énergie nécessaire pour coupler le métabolisme du glucose avec la libération d'insuline. Récemment, il est devenu évident que le maintien de la masse mitochondriale fonctionnelle est d'une importance essentielle pour la fonction cellulaire bêta optimale1,2,3. Afin de soutenir la masse mitochondriale fonctionnelle, les cellules bêta comptent sur desmécanismes de contrôle de qualité pour enlever les mitochondries dysfonctionnelles, endommagées ou vieillissantes 4. Nous et d'autres avons précédemment démontré que les cellules bêta s'appuient sur une forme spécialisée de rotation mitochondriale, appelée autophagie mitochondriale (ou mitophagie), pour maintenir le contrôle de la qualité mitochondriale dans les îlots de rongeurs et humains1, 2,5. Malheureusement, cependant, il n'y avait aucune méthode simple pour détecter la mitophagie, ou les composants endogènement exprimés de mitophagie, dans les cellules bêta pancréatiques humaines.

Nous avons récemment montré que la régulation en amont de la mitophagie dans les cellules bêta repose sur la formation d'un complexe protéique comprenant les ligases E3 CLEC16A et NRDP1 et les usP81. NRDP1 et USP8 ont été montrés indépendamment pour affecter la mitophagie par l'action sur l'initiateur de mitophagie clé PARKIN6,7. NRDP1 cible PARKIN pour l'ubiquitination et la dégradation pour éteindre la mitophagie6, et USP8 spécifiquement deubiquitinates K6-lié PARKIN pour promouvoir sa translocation aux mitochondries7. La technologie d'essai de ligature de proximité (PLA) a été une avancée récente dans le domaine de la biologie de l'interaction protéique8, permettant la visualisation des interactions protéiques endogènes in situ dans des cellules individuelles, et n'est pas limitée par le matériel d'échantillon rare. Cette méthodologie est particulièrement attrayante pour la biologie des îlettes/bêta humains, en raison de la rareté de la disponibilité de l'échantillon, couplée à la nécessité de comprendre les complexes protéiques physiologiquement pertinents dans les types de cellules hétérogènes.

En utilisant l'approche PLA, nous sommes en mesure d'observer les principaux complexes de mitophagie endogène dans les cellules bêta pancréatiques humaines primaires et les lignées cellulaires neuronales, et de démontrer les effets d'un environnement diabétogénique sur la voie de la mitophagie1. En résumé, l'objectif principal de ce protocole est d'analyser des complexes protéiques mitophatophanes spécifiques dans les tissus dépourvus de matériaux abondants, ou lorsque les études conventionnelles d'interaction des protéines ne sont pas possibles.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'utilisation d'îlots pancréatiques humains de donneurs déidentifiés se fait par l'entremise d'une exemption de la Commission d'examen institutionnel (CISR) et conformément à la politique de la CISR de l'Université du Michigan. Les îlots pancréatiques humains ont été fournis par le Programme intégré de distribution des îlots (IIDP) parrainé par les NIH/NIDDK.

1. Préparation d'échantillons d'islet s'homme

  1. Dissociation à cellule unique
    1. Échantillons d'îflements humains de culture (4000-6000 équivalents d'ît/10 ml de support) pendant au moins 1 jour à 37 oC dans les médias d'îcles pancréatiques (PIM(S)) par un support de 1 mM de glutamine bovine (PIM(G), 100 unités/mL antimycotiques-antibiotiques, 1 mM de pyruvate fœtal de sodium et 10 % de pyruvate fœtal de sodium et 10 % de pyruvate fœtal sérum (FBS) ou sérum AB humain.
    2. Utilisez un microscope léger de dissection au grossissement 3x pour compter les îlots humains individuels de la culture. Choisissez 40 îlots par traitement/condition d'intérêt (comme la glucolipotoxicité) dans des tubes de 1,5 ml dans le support des îlots.
    3. Îlots centrifuges à 400 x g pendant 1 min à 10 oC de sédiments.
    4. Laver les échantillons, par brève inversion des tubes à température ambiante, deux fois avec 1 ml de phosphate tamponné saline (PBS) contenant 50 M PR619 (un inhibiteur deubiquitinase; pour préserver les interactions protéiques dépendantes de l'ubiquitine), avec centrifugation entre chaque lavage à 400 x g pendant 1 min à 10 oC.
    5. Dissocier les îlots en cellules individuelles avec 125 l de trypsine de 0,25 % contenant 50 M PR619 en incubant la trypsine préchauffée (37 oC) pendant 3 min avec des granulés d'îlots. Disperser délicatement les îlots pendant cette période à l'aide d'une pipette douce périodique à l'aide d'une pipette de 200 l.
    6. Désintoxiquer la trypsine avec 1 ml réchauffé (37 oC) PIM(S) média contenant 50 M PR619, puis les cellules sédimentaires en centrifuge à 400 x g pendant 1 min.
    7. Laver les cellules par centrifugation à 400 x g pendant 1 min, deux fois, avec pbS 50 M PR619.
    8. Enfin, resuspend les cellules dans 150 PbS de L contenant 50 M PR619.
  2. Adhérence et fixation à cellule unique
    1. Après la résuspension, faites tourner la solution cellulaire sur des lames de microscope givrées et chargées à l'aide d'une cytocentrifuge à 28 x g pendant 10 min.
    2. Après la cytocentrifugation, définit la zone cellulaire avec un stylo hydrophobe (voir le tableau des matériaux) pour minimiser les volumes de solutions d'anticorps/APL nécessaires. Fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde en PBS pendant 15 min à température ambiante.
      CAUTION: PFA est dangereux et doit être manipulé avec soin.
    3. Pour de meilleurs résultats, effectuer la coloration / PLA immédiatement, ou dans les 24 heures. Si nécessaire, conserver les échantillons dans le PBS à 4 oC jusqu'à ce qu'ils ne soient pas tachés pendant plus de 48 h.

2. Immunohistochimie

  1. Blocage
    1. Laver les cellules deux fois avec 1x PBS pendant 5 min à température ambiante.
    2. Solution de cellules de bloc, pour éliminer la coloration de fond, avec 10% sérum d'âne dans PBS contenant le détergent de 0.3% (voir le tableau des matériaux) pour 1 h à la température ambiante.
  2. Coloration
    1. Incuber les cellules avec des anticorps primaires de souris ou de lapin contre USP8 (1:250) et NRDP1 (1:250) respectivement (voir le tableau des matériaux) diluédans de phosphate tamponné saline avec détergent (PBT, voir Tableau des matériaux), à 4 oC pendant la nuit, à détecter la signalisation complexe de mitophagie par l'intermédiaire de PLA.
    2. Co-incuber les cellules avec un marqueur spécifique pour l'identification des cellules bêta qui n'a pas été soulevée chez la souris ou le lapin afin de ne pas interférer avec le signal PLA. Dans ce cas- incubent des cellules avec l'anti-chèvre PDX1 (1:500) dans PBT. Incuber tous les anticorps primaires pendant la nuit à 4 oC, en utilisant du film plastique sur le dessus de la solution pour prévenir l'évaporation.

3. L'assay de ligature de proximité

  1. Sonde et contre-tache de pLA
    1. Préparer la solution de la sonde PLA selon les instructions du fabricant, c'est-à-dire faire 20 l de solution de sonde par échantillon en préparant une concentration finale de la solution 1:5 de la solution de sonde anti-souris et anti-lapin en PBT, et l'incubation pendant 20 min à la pièce température.
    2. Après l'incubation de nuit, laver les cellules deux fois avec 1x PBS pendant 5 min chacun, sur un rocker.
    3. Juste avant l'incubation avec la solution de sonde, ajouter l'anti-chèvre Cy5 secondaire à une concentration finale de 1:600 à la solution de sonde (pour la détection du PDX1 endogène). Ajouter une solution de sonde de 20 l à chaque condition cellulaire, couvrir délicatement de film plastique et incuber à 37 oC pendant 1 h.
  2. Ligature
    1. Laver les cellules deux fois, à température ambiante, avec le tampon A (voir la table des matériaux pour la recette) pendant 5 min chacun, sur un rocker.
    2. Préparer la solution de ligature (une partie des réactifs de détection, voir Tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant. Pour cela, diluer le stock de ligature (5x) 1:5 dans l'eau traitée par le pyrocarbonate de diéthyle (DEPC). Immédiatement avant l'incubation ajouter 0,025 U/mL ligase. Ajouter une solution de ligation de 20 L aux cellules. Couvrir de pellicule plastique et incuber à 37 oC pendant 30 min.
  3. amplification
    1. Laver les cellules deux fois à température ambiante avec le tampon A pendant 2 min chacun.
    2. Faire une solution d'amplification (une partie des réactifs de détection, voir Tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant. Tampon d'amplification dilué (5x) 1:5 dans de l'eau traitée par DEPC et garder dans l'obscurité jusqu'à utilisation. Ajouter une dilution 1:80 de polymérase (une partie des réactifs de détection, voir Tableau des matériaux) à la solution immédiatement avant d'ajouter la solution aux cellules.
    3. Ajouter 20 L de solution d'amplification aux cellules. Couvrir de pellicule plastique et placer dans l'obscurité à 37 oC pendant entre 1 h 40 min et 2 h pour un signal maximal.
  4. Préparation à l'imagerie
    1. Laver les cellules deux fois avec le tampon B (voir la table des matériaux pour la recette) pendant 10 min à température ambiante, sur un rocker.
    2. Enfin, laver les cellules une fois dans 0.01x Buffer B, pendant 2 min à température ambiante sur un rocker.
    3. Montez des échantillons en ajoutant une goutte de support de montage contenant 4,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et en plaçant soigneusement une feuille de couverture sur les échantillons à l'aide d'une lame de scalpel pour presser toutes les bulles formées. Scellez les couvertures à l'aide de vernis à ongles transparent sur les bords.
    4. Des échantillons d'images sur un microscope capable de capturer plusieurs plans focaux, tels qu'un microscope confocal à balayage laser, ou un microscope à fluorescence inversée avec des capacités de déconvolution, prenant au moins 9 images différentes de plan focal.
      1. Capturez des images à 100x grossissement, avec environ 0,45 mm z-pile hauteur. Capturez l'ALP à 550 nm d'excitation, 570 nm d'émission; contre-tache à 650 nm d'excitation, 670 nm d'émission; et DAPI à 405 nm excitation, 450 nm émission.
    5. Pour s'assurer que les signaux de fond de l'image de fluorescence et la lumière parasite sont réduits au minimum pour l'analyse en aval des événements de pLA (en particulier sur les microscopes à large champ), les images de processus utilisant un algorithme de déconvolution bidimensionnelle (voisin le plus proche) à l'aide d'un logiciel standard de traitement d'image de choix.
      REMARQUE : Pour l'utilisation d'Olympus CellSens, Nikon utilise NIS-Elements, Leica utilise LAS X, Zeiss - ZEN, Metamorph, MATLAB, Huygens Software, ainsi que plusieurs Plugins disponibles via Image-J. Pour l'analyse, le nombre total d'interactions sur l'ensemble des z-stacks doit être analysé à l'aide du logiciel Image-J, en veillant à ce que seules les cellules positives Pdx-1 soient analysées (section 3.5).
  5. Quantification des interactions pLA
    1. Ouvrez l'application logicielle gratuite Image-J et ouvrez l'image PLA. Commencez à partir de la première image PLA fortement en ligne.
    2. Cliquez sur l'onglet image, et sélectionnez ajuster, puis seuil (Figure 1A). Ajuster le seuil pour supprimer tout signal PLA non spécifique, prendre note de l'ajustement du seuil et essayer de le garder cohérent tout au long de l'analyse.
    3. Cliquez sur l'onglet processus, et sélectionnez binaire, puis faire binaire (Figure 1B). Utilisez l'image binaire pour mesurer les particules, en cliquant sur l'onglet «analyser» et en appuyant sur les particules d'analyse (Figure 1C).
    4. Pour l'analyse assurez-vous que les paramètres sont les suivants: Taille '0'Infinity, Circularité '0'1.0, Afficher 'Outlines, cocher les cases pour les résultats d'affichage, et les résultats clairs (Figure 1D). Cliquez OK. Prenez note du nombre de particules analysées dans une feuille de calcul indiquant l'échantillon, et la position z-stack.
    5. Répétez les étapes 3.5.2-3.5.4 jusqu'à ce que toutes les z-stacks in-focus pour l'échantillon aient été analysés. Sommez le nombre total de particules pour l'échantillon dans la feuille de calcul pour quantifier le nombre total d'interactions.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons mené des expériences initiales dans la lignée de cellules bêta pancréatiques MIN6 et la lignée cellulaire de neuroblastome SH-SY5Y, afin d'optimiser et de confirmer à la fois la spécificité des anticorps et les interactions protéiques visualisées. Les cellules MIN6 ont été plaquées sur des couvertures à 30 000 cellules/mL et laissées à adhérer pendant 48 h, les cellules SH-SY5Y ont été plaquées sur des plaques de couverture à 15 000 cellules/mL et laissées à adhérer pendant 24 ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici nous décrivons une approche simple et efficace pour employer NRDP1:USP8 PLA dans les tissus/cellules d'intérêt pour quantifier la formation des complexes de mitophagie en amont. Nous avons précédemment confirmé la formation du complexe de mitophagie cLEC16A-NRDP1-USP8 dans les cellules bêta pancréatiques par plusieurs méthodologies, y compris des expériences de co-immunoprécipitation, des études d'interaction sans cellules, et in vitro aussi bien que des cellules-basées ubiquitination tests, et a démontré comment ce ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs reconnaissent le soutien financier de la FRDJ (CDA-2016-189 et SRA-2018-539), de l'Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales, des National Institutes of Health (R01-DK-108921), de la famille Brehm et de la famille Anthony. Le Prix de développement de carrière de la FRDJ à S.A.S. est en partie soutenu par l'Académie danoise du diabète, qui est soutenue par la Fondation Novo Nordisk.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,25 % trypsine-EDTA 1XLife Technologies25200-056
Antibiotique-AntimycosiqueLife Technologies15240-062
Solution en blocUtilisation maison1X PBS, ajoutez 10 % de sérum d’âne et 0,3 % de détergent Triton X-100.
Pourfaire 1L : Mélanger 8,8 g de NaCl, 1,2 g de base Tris, 500ul Tween-20, avec 750mL ddH20. pH à 7,5 avec HCl, et remplir à 1L. Filtrer la solution et conserver à 4C. Apporter à RT avant utilisation expérimentale
Tampon BMaisonPour faire 1L : Mélanger 5,84 g de NaCl, 4,24 g de base Tris, 26 g de Tris-HCl avec 500 ml de ddH20. pH à 7,5, et remplissez à 1L. Filtrez la solution et stockez un 4C. Apporter à RT avant utilisation expérimentale
Cy5-conjugué AffiniPure âne anti-chèvreJackson Labs705-175-147
détection RedSigma- Aldrich AldrichDU092008-100RXNKit contenant : stock de solution de ligature (5X), ligase, stock de solution d’amplification (5X) et polymérase.
Sonde PLA DuoLink anti-souris MINESSigma- AldrichDU092004-100RXN
Sonde PLA DuoLink anti-lapin PLUSSigma- AldrichDU092002-100RXN
fœtal bovin
Chèvre polyclonal anti-PDX1 (clone A17)Santa CruzSC-14664RRID : AB_2162373
HEPES (1M)Life Technologies15630-080
Lignée cellulaire pancréatique MIN6Cadeau de D. StoffersLignée cellulaire d’insulinome de souris, utilisée pour des tests cellulaires.
Anticorps monoclonal anti-USP8 de souris (clone US872)Sigma- AldrichSAB200527
Pap-penResearch Products International195505
ParafilmÀ utiliser pour sceller les solutions d’anticorps et de sonde sur vos cellules afin d’empêcher l’évaporation lors de l’utilisation de petits volumes de solution.
PBT (solution saline tamponnée au phosphate avec triton)MaisonPour faire 50mL : 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA (solution 100mg/mL), 1mL 10 % triton X-100 solution dans ddH20)
Pénicilline-Streptomycine (100X)Life Technologies15140-122
Saline tamponnée au phosphate, 10XFisher ScientificBP399-20
PIM(ABS) Sérum AB humainProdo LabsPIM-ABS001GMP
PIM(G) (glutamine)Prodo LabsPIM-G001GMP
PIM(S) mediaProdo LabsPIM-S001GMP
PR619Apex BioA812
Réactif anti-décoloration Prolong Gold avec DAPILife Technologies (sondes moléculaires)P36935
Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1)Bethyl LaboratoriesA300-049ARRID : AB_2181251
cellules SH-SY5YDon de la lignée cellulaire de neuroblastome humain L. Satinutilisée pour des tests cellulaires.
Pyruvate de sodium (100X)Life Technologies11360-070
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Tween-20Fisher ScientificBP337-100
Eau pour le travail de l’ARN (eau DEPC)Fisher ScientificBP361-1L
Réactifs deSérum ,

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
  2. Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
  3. Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. (0), (2015).
  4. Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
  5. Soleimanpour, S. A., et al. Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells. Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).
  6. Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).
  7. Durcan, T. M., et al. USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin. The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).
  8. Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction. PLoS ONE. 10 (6), e0128701(2015).
  9. Silva Xavier, D. a, G, The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54(2018).
  10. Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
  11. Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334(2006).
  12. Brissova, M., et al. Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
  13. Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis. Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).
  14. Poitout, V., et al. Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell. Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).
  15. Pearson, G., Soleimanpour, S. A. A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells. Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).
  16. Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
  17. DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
  18. Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
  19. Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nature Communications. 7, 11756(2016).
  20. Dorrell, C., et al. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).
  21. Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).
  22. Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
  23. Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
  24. Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -E. No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. , (2018).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Interaction NRDP1 USP8contre coloration PDX1isolement des cellules des lotsfixation par cytospinanalyse des particules via ImageJquantification de la mitophagierecherche sur le diab te

Articles connexes