Chromatographie d’échange ionique (IEX) couplée à la diffusion de la lumière multi-angle (MALS) pour la caractérisation et la séparation de protéines

Résumé

Ce protocole décrit l’utilisation de la chromatographie d’échange ionique haute spécificité avec multi-angle diffusion de la lumière pour une détermination précise de masse molaire des protéines complexes de protéines et peptides dans un échantillon hétérogène. Cette méthode est utile pour l’évaluation de la qualité, aussi bien en ce qui concerne la caractérisation d’oligomères natives, variantes de l’accusation et échantillons mixtes-protéine.

Résumé

Chromatographie d’échange ionique avec multi-angle diffusion de la lumière (IEX-Lam) est une méthode puissante pour la séparation de protéines et de caractérisation. La combinaison de la technique de séparation de haute spécificité IEX avec l’analyse de masse molaire précise réalisée par MALS permet la caractérisation des échantillons de protéines hétérogènes, y compris les mélanges de formes oligomères ou les populations de protéines, même avec très masses molaires similaires. Par conséquent, les IEX-MALS fournit un niveau supplémentaire de caractérisation des protéines et est complémentaire de la chromatographie d’exclusion standard avec la technique de diffusion de la lumière multi-angle (SEC-MALS).

Nous décrivons ici un protocole pour une base IEX-MALS expérimenter et illustrent cette méthode sur l’albumine sérique bovine (BSA). IEX sépare des BSA à ses formes oligomères permettant une analyse de masse molaire de MALS de chaque forme individuelle. Optimisation d’une expérience de IEX-MALS est également présentée et démontrée sur BSA, réalisation excellente séparation entre BSA monomères et oligomères plus grandes. IEX-MALS est une technique utile pour l’évaluation de la qualité de protéines car elle garantit la séparation fine tant de détermination de la masse molaire de plusieurs espèces de protéines qui existent dans un échantillon.

Introduction

Une caractérisation quantitative des produits protéiques est de plus en plus indispensable comme moyen de contrôle de la qualité (CQ), tous deux à des fins réglementaires dans l’industrie biopharmaceutique et de garantir la fiabilité et l’intégrité de la science de la vie de recherche^{1 , 2}. tel que décrit sur les sites Web de protéine réseaux Protein Production et Purification de partenariat en Europe (P4EU) et l’Association des ressources pour la recherche biophysique en Europe et de la biophysique moléculaire en Europe (ARBRE-MOBIEU) (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs et https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control, respectivement), protéine QC doit caractériser non seulement la pureté du produit final, mais aussi son état oligomère, homogénéité, identité, conformation, structure, modifications post-traductionnelles et autres propriétés^3,4.

Une des méthodes plus courantes QC de caractérisation est SEC-MALS. Dans cette méthode, une colonne analytique de la SEC est couplée au MALS et détecteurs spectrophotométriques et réfractométrique, ce qui permet des mesures précises de la masse molaire de chaque pic⁵. SEC-MALS détermine la masse molaire des pics éluées indépendamment le volume d’élution et surmonte l’inexactitude de l’étalonnage de la colonne analytique SEC. L’ajout d’un module dynamique en diffusion de la lumière (DLS) ajoute des capacités de mesure de taille permettant la détermination du rayon hydrodynamique. Dans la recherche universitaire, SEC-MALS est généralement utilisée pour déterminer l’état oligomère d’une protéine, sa conformation, le niveau de pureté, le niveau d’agrégation et des protéines modifiées, telles que des glycoprotéines ou des protéines de la membrane lipidique solubilisée (déterminer la la masse molaire des protéines et conjuguer les composants individuellement)^6,7,8.

Dans de nombreux cas, la protéine finale d’un processus de purification n’est pas une espèce moléculaire bien définies mais plutôt comprend une hétérogénéité. Les protéines dans un tel mélange peuvent varier en termes de structure (par exemple, différentes formes oligomères), conformations ou isoformes protéiques. Hétérogénéité de protéine peut également être le résultat de différences chimiques mineures causées par le traitement de lysine C-terminal ou de désamination de l’asparagine/glutamine, menant à facturer variation^9,10. Différences entre les modifications post-traductionnelles telles que glycosylation peuvent aussi conduire à des échantillons hétérogènes avec des variations de charge⁹. Ces différents types d’hétérogénéité sont reflétées dans les caractéristiques biophysiques de la protéine et peuvent influer sur la stabilité et l’activité biologique de la protéine cible¹¹.

Contrôle fiable de la qualité des analyses de ces échantillons hétérogènes nécessitent une technique de séparation analytique hautement résolutive. Il y a des cas où la bonne séparation peut être contestée à réaliser avec des colonnes SEC analytiques, en raison de leur limitée de résolution et de la séparation capacités¹², résultant dans l’analyse de SEC-MALS viciée. Alliant une technique de séparation de haute spécificité comme IEX avec MALS peut surmonter la limitation des SEC-MAUXE dans échantillons hétérogènes et fournir une méthode complémentaire pour la caractérisation des protéines (tableau 1 en Amartely et al.¹²). Contrairement à la SEC, qui sépare les macromolécules par leur taille hydrodynamique¹³, IEX sépare les macromolécules par leur charge superficielle¹⁴. Échangeuse d’anions (AIEX) et échange de cations (CIEX) matrices bind négativement et positivement chargées des variantes, respectivement. Avec une séparation fine entre les populations de protéine qui partagent une masse relativement étroite ou une forme, IEX-MALS détermine avec succès la masse molaire de chaque état de protéines individuelles dans un échantillon de mélange¹².

Nous présentons ici un protocole standard pour l’exécution d’une expérience de IEX-MALS de séparation et d’analyse de formes oligomères BSA existant dans le même échantillon. Le choix d’une colonne IEX pour une protéine spécifique est important et sont examinées, ainsi que les conditions de pH et de conductivité des tampons. L’analyse des données expérimentales IEX-MALS est également décrit étape par étape. Bien que la séparation des oligomères de BSA est bonne et suffisante à SEC-MALS, BSA est un bon exemple pour montrer les capacités de IEX-MALS et de démontrer l’optimisation d’une expérience. Exemples de mauvaise séparation réalisé par SEC-MALS et une bonne séparation et analyse activé par IEX-MALS sont discutés dans une précédente étude¹².

Protocole

1. préparation du système

1. Installer le système de chromatographie liquide (FPLC) protéine rapide et MALS/réfraction détecteurs index (RI) (voir la Table des matières) ainsi que leurs logiciels respectifs pour contrôle d’acquisition de données et analyse par les manufacturiers instructions.
2. Connecter les détecteurs MALS et RI en aval de détecteurs d’UV et de la conductivité de la FPLC. Contourner le détecteur de pH à moins qu’il est absolument nécessaire pour des gradients de pH, afin de minimiser le volume d’interdetector entre les détecteurs UV et MALS. Utilisez des tubes capillaires de 0,25 à 0,5 mm diamètre (d.i.) entre la colonne et de détecteurs et de tube capillaire, i.d. 0,75 mm à la sortie du détecteur RI au collecteur de déchets ou de la fraction.
3. Veiller à ce que les branchements nécessaires entre les FPLC et détecteurs ont été établis, y compris une sortie analogique UV du détecteur à l’entrée Aux MALS FPLC et sortie numérique de la FPLC au MALS Autoinject In, par l’intermédiaire de la boîte d’e/s.

2. préparation de l’échantillon et le tampon

1. Filtrer tous les réactifs, y compris les tampons de lavage et d’élution, avec un filtre de 0,1 µm. Filtrer les premiers 50 – 100 mL de tampon dans une bouteille pour eaux usées afin d’éliminer les particules des filtres secs et garder le reste de la mémoire tampon dans une bouteille propre et stérile qui a été lavée avec de l’eau filtrée et plafonnée pour empêcher la poussière d’entrer.
2. Ajuster un échantillon de BSA à un pH et la concentration ionique (p. ex., pH = 8, 50 mM NaCl) qui permettent la liaison à la colonne IEX au cours de la dilution, l’ultrafiltration ou procédures d’échange de mémoire tampon.
   Remarque : Il est recommandé de préfiltrer l’échantillon de protéines à la taille des pores plus petite qui ne supprime pas les documents d’intérêt (0,02 à 0,1 µm). Alternativement, l’échantillon peut être centrifugé à haute vitesse (13 000 à 16 000 x g) pendant 10 min permettre à la précipitation de grosses particules.
3. Préparer au moins 0,3 à 0,5 mg de BSA (voir Table des matières) pour l’injecter dans une colonne de 1 mL (5/50 mm) pour la réalisation d’une analyse MALS de bonne qualité. Notez que le volume d’injection est illimité.

3. choix et élaboration d’une méthode IEX pour une protéine

1. Calculer le point isoélectrique (pI) de la protéine basé sur la séquence principale, pour quels serveurs comme outil de Protparam sur l’ExPASy site Web peut être utilisé¹⁵. Notez que le pI de BSA est de 5,8.
2. Sélectionnez les paramètres de type et de la mémoire tampon de colonne.
   1. Utiliser différents tampons pour AIEX et CIEX, selon le pK_un de la mémoire tampon et la nature ionique de la mémoire tampon. Utilisez cationiques tampons lors de l’exécution de la colonne AIEX et anioniques tampons lors de l’exécution de la colonne CIEX avec petites contre-ions. Dans cet exemple, utilisez un tampon 20 mM Tris-HCl, pH 8, pour l’analyse des BSA sur une colonne AIEX.
   2. Pour une protéine avec un pI inférieur à 7, tels que le BSA, utilisez une colonne AIEX et tampon dont le pH est plus élevé que le pI par au moins deux unités. Pour une protéine dont le pI supérieur à 7, utilisez une colonne CIEX et tampon dont le pH est inférieur à la pI de la protéine par au moins deux unités.
   3. Optimiser le pH tampon selon la force de liaison entre la protéine et la matrice de la colonne. Si une protéine ne lie pas bien à la colonne, utilisez un pH plus éloigné de la pI. Assurez-vous que la protéine est stable au pH utilisé.
   4. Utilisez une faible concentration de sel dans la liaison et laver les tampons pour autoriser la liaison de la protéine de la matrice, puisque la liaison aux protéines dépend de la force ionique de l’échantillon chargé. Protéines exigent habituellement peu de sel pour leur stabilité. par conséquent, utiliser 50 mM NaCl (ou autre sel) au cours des étapes de protéine-chargement et colonne de lavage.
   5. Pour la mémoire tampon d’élution, utilisez un maximum de 0,5 M de NaCl pour détacher la protéine de la colonne.
      Remarque : Des concentrations plus élevées de sels ne sont pas recommandées lorsque vous travaillez avec le réfractomètre de RI-modèle standard en raison de la limitation de la portée de l’instrument. Toutefois, un forte concentration modèle peut être utilisé et peuvent accueillir 2 M NaCl.
3. Exécuter une méthode initiale comme suit.
   1. Charge 1 mg de BSA (170 µL de 6 mg/mL) dans ~0.5 mL d’un tampon de charge d’un tampon 20 mM Tris-HCl, pH 8, contenant 50 mM NaCl. Laver la colonne avec le même tampon pour un volume de colonne de 10 – 15 (CV) permettre l’élution complète des molécules non liés et particules du système jusqu'à la diffusion de la lumière (LS), UV, et RI signaux sont entièrement stabilisées.
   2. Effectuer un dégradé court, linéaire de sel de 20 à 30 CV, à l’aide de la mémoire tampon d’élution de 20 mM Tris-HCl, pH 8, contenant 0,5 M de NaCl pour détacher la protéine de la colonne. Réaliser une pente de 0 à 100 % (ou gradient généralisé alternative) du tampon d’élution ou la diviserait à deux gradients : 0 – 50 % de la mémoire tampon d’élution suivie d’un gradient supplémentaire de 50 – 100 % de la mémoire tampon d’élution, chaque dégradé pour 10 à 20 CV. Pour BSA, utiliser un dégradé très répandu de 15 % à 70 % pour les 30 CV pour la méthode initiale.
      Remarque : Dans certains cas, la méthode initiale peut assurer l’espacement pour une analyse fiable des MALS et pistes supplémentaires ne sont pas nécessaires. Dans de nombreux cas, la méthode initiale apporte seulement pour l’optimisation de la méthode supplémentaire.
4. Optimiser la méthode IEX pour augmenter la résolution et d’améliorer la séparation pointe en modifiant les différents paramètres.
   1. Modifier la pente gradient et la longueur. Dégradés courts avec des pentes élevées fournissent des pics intenses avec un espacement de moins, tandis que longs dégradés avec des pentes douces fournissent pics inférieurs avec meilleure séparation. Trouver l’équilibre entre l’intensité maximale de résolution et de signal pour l’analyse optimale des MALS.
      Remarque : Une plus grande quantité de protéine de chargement peut augmenter LS, UV, et RI signaux mais le fait au détriment de la résolution.
   2. Utiliser un profil de concentration saline par étapes pour l’élution. N’oubliez pas qu’une combinaison de mesures et de dégradé linéaire est couramment utilisée.
   3. Diminuer le débit afin d’améliorer la séparation des pics.
      Remarque : Pour les matrices avec de très petites particules, ce n’est pas très important.
   4. Changer le pH tampon pour augmenter la variation de la charge entre les populations de protéines dans l’échantillon et d’améliorer la séparation entre ces variantes. Notez que les protéines qui ne sont pas séparées correctement à un pH peuvent être séparées à un pH différent.
   5. Utilisez un pH gradient, linéaire ou par étapes, pour détacher les protéines de la colonne IEX. Utilisez des gradients d’élution qui combinent le pH et les variations de concentration en sel si nécessaire.
   6. Des sels plus forts, tels que le MgCl₂ou sels plus faibles, tels que l’acétate de sodium permet d’augmenter la sensibilité et la résolution¹⁶.
   7. Utilisation plus longue IEX colonnes ou une matrice colonne différente avec des particules plus petites pour améliorer les capacités de séparation.
   8. Changer le type de colonne (AIEX/CIEX) pour fournir un modèle différent de la séparation. Notez que les matrices avec fortes, faibles ou combinées des ligands (mode mixte) sont également disponibles et peuvent améliorer la résolution de certains échantillons.
   9. Utiliser une colonne d’un fournisseur différent avec le même ligand qui est attaché aux résines de matrice différente. La résine elle-même, indépendamment du ligand, peut interagir différemment avec les protéines et affectent le profil de séparation.
   10. Inclure les additifs (molécules qui stabilisent la protéine dans la solution) dans les mémoires tampons pour améliorer la stabilité des protéines et éviter l’agrégation des protéines, afin d’améliorer l’expérience IEX.
       Remarque : Sont des exemples de tels additifs détergents non ioniques ou zwitterioniques, urée, alcools, sucres et sels de chaotropes et kosmotropic^17,18.

4. IEX-MALS expérimenter

1. Ouvrez New\Experiment de méthode dans le logiciel MALS et sélectionnez la méthode en ligne dans le dossier de méthodes de système de Diffusion de la lumière . Si le module de listes de distribution est disponible et données DLS doivent être acquis, sélectionnez la méthode en ligne dans le sous-dossier de Lumière Scattering\With QELS .
2. Définissez les paramètres de la course au titre de la section de Configuration .
   1. Régler le débit de fuite dans la section Générique pompe au débit utilisé dans le FPLC (1,5 mL/min), puis entrez ou vérifiez les paramètres de mémoire tampon dans la section de solvant .
   2. Entrez le nom de protéine (BSA), indice de réfraction (dn/dc, la norme est de valeur pour les protéines 0,185 mL/g), coefficient d’extinction UV à la longueur d’onde de 280 nm (0,66 g/L^-1·cm^-1) et la concentration de l’échantillon de protéines (6 mg/mL) en l’onglet d’échantillon en vertu de la section de l’injecteur . Insérez le volume de l’échantillon pour injection (170 µL) aussi bien dans la même section.
   3. Dans l’onglet de la Collection de base , en vertu de la section de la procédure , cochez la case détente sur Autoinject et régler la durée de la course afin que la collecte de données se poursuivra pendant au moins 5 min après le gradient a atteint son valeur finale.
3. Définissez les paramètres de l’expérience dans le logiciel FPLC.
   1. Créer une nouvelle expérience dans l’onglet Éditeur de méthode . L’expérience initiale sera un dégradé linéaire de sel ou de pH (voir l’étape 3.3). Pour la méthode optimisée, créer un dégradé plus spécifique ou un programme par étapes selon les résultats d’élution pendant la méthode initiale (voir étape 3.4 et Figure 1). Inclure une impulsion dans la méthode qui déclenchera la collecte de données dans le logiciel MALS.
   2. Laver la colonne et des robinets avec les tampons pertinentes : 20 mM Tris-HCl, pH 8, avec 50 mM NaCl pour le tampon de lavage (une vanne) et le même tampon avec 500 mM NaCl pour la mémoire tampon d’élution (vanne B). Assurez-vous que le lavage de la dernière colonne utilise le tampon de liaison, contenant une faible concentration de sel, pour permettre la liaison de la protéine de la matrice colonne. Pour un lavage massif des impuretés fortement liés, utilisez 0,5 M NaOH avant de vous laver avec les tampons pertinentes, suivies d’un lavage de tampon de neutralisation.
   3. Placer l’échantillon de protéine dans la boucle à l’aide d’une seringue. Si plus de 10 mL de l’échantillon est chargé, utilisez un superloop ou la pompe-valve de l’instrument FPLC tout en contournant la pompe du filtre et le mélangeur de la FPLC.
4. Commencez tout d’abord l’expérience dans le logiciel MALS en cliquant sur le bouton exécuter , puis dans le logiciel FPLC. On recueillera des données après avoir reçu le signal d’impulsion de l’instrument FPLC via le détecteur MALS.
5. Appliquer les mêmes paramètres de la course et les instructions décrites aux points 4.1 à 4.4 si l’IEX-MALS est exécutée manuellement avec un mode de flux continu au lieu d’une méthode autonome.
6. Une fois que la dernière méthode a été vérifiée et exécute, effectuer exactement la même méthode à l’aide d’une injection de vide (tampon de charge au lieu de l’échantillon). Il est important que le timing entre le pouls de l’autoinject et la pente de la piste vide est identique à celle des échantillons.

5. l’analyse des données expérimentales IEX-MALS

1. Effectuer l’analyse étape par étape, en vertu de la section de la procédure dans le logiciel MALS. La vue de Collection de base affiche la collection de données brutes de l’expérience.
   1. Utilisez l’onglet Despiking pour lisser les chromatogrammes si elles présentent beaucoup de bruit. Normalement, utilisez le niveau normal .
   2. Définir le niveau de référence pour tous les signaux (tous LS, UV et IR détecteurs) dans l’affichage de la ligne de base .
   3. Définir les pics pour l’analyse de l’affichage des sommets . Vérifiez les valeurs correctes de dn/dc et le coefficient d’extinction UV pour la protéine sous chaque pic.
      Remarque : Pour les protéines, il est courant d’utiliser une valeur d’incrément RI standard de 0,185 mL/g, mais d’autres macromolécules, dn/dc différentes valeurs devraient être utilisées, selon la nature de la molécule. La moyenne dn/dc de polynucléotides (ADN/ARN) est de 0,17 mL/g¹⁹, tandis que saccharides, tels que saccharose, ont une valeur moyenne dn/dc 0,145 mL/g²⁰ et les valeurs de dn/dc des lipides et détergents varient entre 0,1 – 0.16 mL/g²¹.
   4. Analyser la masse molaire et le rayon en utilisant les paramètres d’ajustement et la fonction de corrélation sous le point de vue de masse molaire & rayon de LS et R_h de QELS .
2. Les modifications de signal RI significativement durant l’IEX-MALS exécutent en raison de l’augmentation de la concentration en sel. Par conséquent, soustraire le signal de base de l’apport de blanc pour les calculs de massives qui requièrent des données de RI.
   1. Ouvrir la protéine et des expériences IEX-MALS blancs. Faites un clic droit sur le nom d’expérience de protéine, sélectionnez la Méthode à appliqueret choisir le dossier de la Soustraction de la base de la boîte de dialogue fichier. Sélectionnez le bon type de méthode (par exemple, en ligne) pour une analyse de masse molaire standard. Notez que les paramètres et les paramètres définis pour l’expérience de la protéine seront sauvegardés sur la nouvelle méthode ouverte.
   2. En vertu de l’avis de la Soustraction de la ligne de base , cliquez sur Vide importer pour importer les signaux de la course blanche. En vertu d' Instruments (à côté du bouton Import vierge ), vérifier tous les détecteurs à soustraire.
   3. De l’avis de pics , ajuster les valeurs de dn/dc (si nécessaire) en raison de la conductivité de la solution à la surface de pic de protéine, puisque le RI de la solution est modifié pendant l' exécution de¹².
3. Calibrer le système IEX-MALS avec monomère de BSA.
   Remarque : Normalement, le système IEX-MALS est étalonné périodiquement pour l’alignement de la pointe, élargissement de la bande et de la normalisation des détecteurs angulaires au détecteur 90° grâce à une protéine monodispersés avec un rayon de giration (R_g) de < 10 nm, comme monomère de BSA. Dans cet exemple, BSA sert aussi bien que la molécule de calibration et lui-même fait l’objet de l’analyse de masse molaire.
   1. Aligner les pics, conformément aux procédures > vue de Configuration .
   2. Effectuer la normalisation sous la vue de la normalisation , entrant 3,0 nm comme la valeur de_g R.
   3. Au titre de l' Élargissement de la bande dans le même onglet de Configuration , choisissez le pic et correspondre les signaux UV et LS au signal RI, en utilisant le bouton Exécuter Fit .
4. Le graphique des résultats s’affiche dans la vue Montage de résultats . Changer l’échelle de l’axe et d’autres paramètres du graphique en faisant un clic droit sur le graphique, choisissez modifieret puis en cliquant sur le bouton avancé . Une figure graphique avec plusieurs options d’affichage est aussi disponible dans l’onglet Graphique EASI : sélectionnez La masse molaire dans le menu déroulant Afficher en haut de la fenêtre.
5. Notez que tous les résultats, y compris la masse molaire, rayon, degré de pureté et d’autres, sont disponibles dans la vue de rapport (sommaire ou détaillée) en vertu de la section résultats . Le bouton Générateur de rapports permet d’ajouter plus de résultats ou de paramètres, ainsi que des chiffres, le rapport.

Résultats

BSA est une protéine commune qui est utilisée en chromatographie pour l’étalonnage du système expérimental²² et est parfaitement adapté pour la pratique des IEX-MAUXE ainsi que SEC-MALS. Il est principalement monomère avec une masse théorique de monomère de 66,7 kDa et intègre généralement un petit nombre de dimères et supérieur oligomères²³.

BSA a été analysée sur IEX-MALS à l’aide d’une colonne analytique échangeuse d’anion (voir Table des matières). Un large linéaire dégradé composé de 30 CV de 75 mM à 350 mM NaCl séparé des monomères de BSA des oligomères plus élevés. Analyse en aval de MALS a entraîné une masse molaire du monomère calculée de 66,8 ± 0,7 kDa et une masse molaire calculée dimère de 130 ± 5 kDa (Figure 1A).

Se fondant sur la conductivité de tampon sur les pics d’élution, le dégradé a été changé pour un programme différent : une étape longue de 175 mM NaCl suivie d’un dégradé linéaire de 175 mM à 500 mM NaCl. Le gradient de nouveau a grandement amélioré la résolution et l’excellente séparation entre monomère de BSA (avec une masse molaire calculée de 66,1 ± 0,7 kDa) et de ses espèces supérieures oligomériques (avec une masse moyenne calculée de 132 ± 2 kDa) (Figure 1B). Afin de se concentrer également sur l’espèce oligomérique élevé et pour calculer les masses molaires de chaque forme oligomérique individuel de BSA, un programme par étapes de 200 mM et 250 mM NaCl a été appliqué. Cette expérience a donné lieu à une excellente séparation entre BSA monomère (avec une masse calculée de 62,4 ± 0,4 kDa), dimère (dont la masse calculée de 130 ± 10 kDa) et trimère (dont la masse calculée de 170 ± 10 kDa) (Figure 1C). Toutes les expériences de IEX-MALS montrent que BSA élué principalement sous forme d’un monomère d’une pureté de 80 %, en accord avec les résultats de SEC-MALS où les monomères de BSA éluer avec une pureté de 85 %¹².

Figure 1 : Optimisation de l’expérience de IEX-MALS pour BSA. (A) IEX-MALS expérimenter de BSA avec un programme gradient de 75 à 350 mM NaCl. (B) IEX-MALS expérimenter de BSA avec un programme d’une étape de 175 mM NaCl suivie d’un programme de gradient linéaire de 175 à 500 mM NaCl. (C) IEX-MALS de BSA expérimenter un programme de l’étape de 200 mM et 250 mM NaCl. Les chromatogrammes affichent le UV à diffusion à un angle de 90° (rouge) et l’indice de réfraction (rose) et les courbes de la conductivité (gris) ainsi que la masse molaire de chaque pic calculé par MALS (noir) de la lumière nm (bleu), 280. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

IEX-MALS est une méthode puissante pour la séparation de protéines et de caractérisation qui permet la détermination précise de masse molaire des protéines pures aussi bien à partir d’échantillons hétérogènes, caractérisant les natifs oligomères, agrégats non indigènes, covalentes et non covalentes complexes et protéines conjuguées. Un programme constitué d’un dégradé linéaire ou une série de mesures de la concentration en sel peut atteindre une bonne séparation des populations protéine et permettent une analyse correcte de chaque pic individuel par les MALS. Optimisation en faisant varier les différents paramètres, comme le gradient de pente (voir l’étape 3.4 du protocole), peut être effectué s’il faut une meilleure résolution. IEX-MALS peut être un test de contrôle de la qualité de protéines précieuses car elle fournit un niveau supplémentaire, critique de caractérisation des protéines, complémentaire à d’autres méthodes telles que SEC-MALS.

MALS-SEC est une technique standard et commune pour la détermination de la masse molaire protéine, la relativement faible résolution des colonnes SEC analytiques standards peut limiter les mesures de masse molaires précis obtenus par MALS¹². Quelques exemples de limites de SEC-MALS solutions qui contiennent des oligomères consécutives, des niveaux élevés d’agrégation qui ne sont pas entièrement séparées de la crête de monomère et des populations hétérogènes avec des masses molaires similaires, tels que les protéines modifiées.

IEX est une méthode de chromatographie en phase plus complexe à concevoir et réaliser à SEC, mais les informations obtenues par une expérience IEX-MALS peuvent compléter et parfois être encore plus informatif que l’analyse de SEC-MALS. IEX-MALS a caractérisé avec succès les variantes d’anticorps qui partagent les mêmes oligomères molaires de mass, qui ne sont pas complètement séparés sur SEC et de petits peptides qui sont difficiles à analyser par SEC^12,24. En outre, des assemblages macromoléculaires qui sont trop gros pour être séparés par la SEC, comme plein (contenant l’ADN viral) et particules vides d’adeno-associated virus (AAV), peuvent être résolus en IEX²⁵ avant l’analyse MALS. Comparé au SEC, IEX offre plus diversifiée de capacités de séparation¹⁴ et il a la possibilité de régler plusieurs paramètres pour augmenter la résolution maximale, comme tampon pH, types de sel, de types et de longueur de la colonne et d’autres. Contrairement à SEC, il n’y a aucune limite de volume pour l’injection de l’échantillon en IEX et n’importe quelle molécule peut être analysée indépendamment de sa taille (voir tableau 1 en Amartely et al.¹²). Il s’agit d’un grand avantage des IEX-MALS, principalement pour les échantillons ayant une faible intensité de LS, tels que de très petites protéines ou protéines dilués avec une tendance à l’agrégation à la concentration. Étant donné que les colonnes IEX analytiques sont plus stables et ont tendance à libérer moins de particules que les colonnes de la SEC, IEX-MALS nécessite un temps très court de l’équilibration et signaux LS sont stabilisés très vite. Cela permet le déroulement des expériences individuelles, comme décrit dans le présent protocole et l’arrêt de la course selon les besoins.

Contrairement à SEC, qui fournit généralement des bons résultats avec une seule expérience (à l’aide d’une colonne avec la gamme bon fractionnement), IEX peut exiger plusieurs expériences visant à parvenir à une résolution optimale en réglant les paramètres de la méthode. Dans les expériences de IEX-MALS qui sont effectuées avec un gradient de sel, la conductivité de la mémoire tampon et, par conséquent, le RI changer radicalement pendant la course, avec des changements au signal RI. Cela nécessite un vide supplémentaire exécuté pour chaque expérience IEX-MALS et une analyse avec soustraction de base (comme indiqué au point 5.2 du protocole), sauf si l’analyse de la concentration est limitée à la détection UV (nécessitant une connaissance a priori de l’extinction coefficients pour chaque pic). L’analyse avec soustraction de base est robuste pour des dégradés linéaires, quoique plus loin le développement de la méthode est toujours requis pour la soustraction de base réussie des programmes de sel par étapes. Les valeurs de dn/dc de chaque pic doivent être ajustées selon la conductivité de mémoire tampon spécifique au sommet éluée (calculs peuvent être trouvés dans la littérature¹²). Si une protéine éluée à une concentration de NaCl inférieure à 200 mM (comme dans l’exemple de BSA), cet ajustement est négligeable.

La quantité relativement importante de protéine utilisé à IEX-MALS (comme détaillé dans étape 2.3 du protocole) par rapport au SEC-MALS est importante pour surmonter le changement radical du signal RI causé par le gradient de sel et les fluctuations de la RI en raison d’un mélange imparfait de la tampons de gradients. Si une seule détection UV est utilisée pour la mesure de masse, plus petites quantités peuvent être utilisées. La quantité de protéine à injecter dépend de la masse molaire de la protéine, homogénéité, la pureté et le coefficient d’extinction UV. La masse injectée nécessaire devrait être plus élevé pour les protéines plus petites et plus faible pour les plus grandes protéines (~ 1 mg pour un 20 kDa protéine et ~0.2 mg pour une protéine de 150 kDa). Échantillons hétérogènes requièrent l’injection de l’échantillon plus puisque la quantité est répartie entre plusieurs populations. Analyse chromatographie liquide (HPLC) peut exiger moins de matière qu’un système FPLC.

Récemment, l’analyse en ligne à l’aide de MALS au cours de la procédure de purification a été rapportée. Une telle analyse en temps réel est très efficace pour la détection des produits d’agrégation qui surviennent pendant la purification et peuvent éliminer la nécessité d’une analyse ultérieure de la protéine après purification²⁶. Chromatographie d’IEX est fréquemment utilisée comme une étape intermédiaire de purification ; ainsi, la combinaison de colonnes préparatives IEX MALS peut être utile non seulement comme une méthode de caractérisation analytique mais aussi comme une analyse en temps réel des procédures de purification à grande échelle. Enquêteurs IEX colonnes sont aussi stables, avec un faible degré de la libération de particules et, par conséquent, peuvent être utilisés avec les MALS. Autres techniques de séparation, par exemple la chromatographie d’affinité ou chromatographie échangeuse hydrophobe, peuvent également être associés MALS lorsqu’elles sont soumises à des échantillons relativement pures (pour éviter la contamination des détecteurs MALS et RI). Cela nécessitera l’adaptation et optimisation de la méthode d’obtenir non seulement séparation bon pic mais aussi suffisamment propres LS et RI des signaux pour une analyse réussie des MALS.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ä ; KTA pure	GE Healthcare	29-0182-26	FPLC  ;
0,02 et micro ; m Anotop Whatman Filter 10 mm	GE Healthcare	6809-1002	Filtre d’échantillonnage
0.1 µ ; m Anotop Whatman Filter 10 mm	GE Healthcare	6809-1012	Filtre d’échantillonnage
0.1 µ ; m Anotop Whatman Filter 25 mm	GE Healthcare	6809-2012	Filtre de phase mobile
BSA (pureté >97 %)	Sigma  ;	A1900	Albumine sérique bovine
miniDAWN TREOS  ;	Wyatt Technology	WTREOS	MALS
mono Q HR 5/50 GL	GE Healthcare	17-5166-01	Colonne analytique échangeuse d’anions
Optilab T-rEX	Wyatt Technology	WTREX
0,1 mm PES 1000 mL Stericup	Millipore	SCVPU11RE	Filtre de phase mobile
Chlorure de sodium	Sigma  ;	71382	HPLC grade NaCl
TRISMA base	Sigma  ;	T-1503	Tampon TRIS