Article de méthode

Une méthode sans enzyme s'est d'isolement et d'expansion des cellules souches mésenchymales dérivées de l'adipose humaine

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DOI :

10.3791/59419

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16 décembre 2019

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1Department of Medicine, Division of Hematology/Oncology, New Jersey Medical School, Rutgers Biomedical and Health Sciences, 2Rutgers School of Graduate Studies at New Jersey Medical School, Rutgers Biomedical and Health Sciences, 3Department of Surgery, Division of Plastic Surgery, New Jersey Medical School, Rutgers Biomedical and Health Sciences

Dans cet article

Résumé

Ce protocole fournit une méthode sans enzyme s'est dissipée des cellules souches mésenchymales à partir d'échantillons d'abdominoplastie et de lipoaspirate à l'aide d'une méthode d'explantation. L'absence d'enzymes dures ou d'étapes de centrifugation prévoit des cellules souches cliniquement pertinentes qui peuvent être utilisées pour des études in vitro ou transférées à la clinique.

Résumé

Les cellules souches mésenchymales (MSC) sont une population de cellules multipotentes qui peuvent être isolées de divers tissus adultes et foetaux, y compris le tissu adipeux. En tant que type de cellule cliniquement pertinent, des méthodes optimales sont nécessaires pour isoler et étendre ces cellules in vitro. La plupart des méthodes d'isolement des MSC dérivées de l'adipeux (ADSC) reposent sur des enzymes dures, comme la collagène, pour digérer le tissu adipeux. Cependant, bien qu'efficaces pour décomposer le tissu adipeux et produire une récupération élevée d'ADSC, ces enzymes sont chères et peuvent avoir l'effet préjudiciable sur les ADSC - y compris les risques d'utiliser des composants xénogéniques dans des applications cliniques. Ce protocole détaille une méthode pour isoler les ADSC des échantillons frais de lipoaspirate et d'abdominoplastie sans enzymes. En bref, cette méthode repose sur la dissociation mécanique de tout tissu en vrac suivie d'un système de culture de type explante. Les ADSC sont autorisés à migrer hors des tissus et à la plaque de culture tissulaire, après quoi les ADSC peuvent être cultivés et étendus in vitro pour n'importe quel nombre d'applications de recherche et/ou cliniques.

Introduction

Les cellules souches mésenchymales (MSC) sont une classe de cellules souches adultes multipotentes qui peuvent être isolées de divers tissus adultes et foetaux, y compris des tissus adipeux. Ces cellules sont un type de cellules attrayant pour la recherche fondamentale et les applications cliniques en raison de leur plasticité pour différencier en cellules de toutes les couches germinales in vitro, traverser les barrières allogéniques, la maison à des zones d'inflammation, et supprimer l'inflammation (révisé dans Sherman, et al.1). Les MSC dérivés de l'adipose (AsPc) sont particulièrement attrayants en raison de leur facilité d'obtention, car le tissu adipeux est généralement considéré comme tissu de rejet suivant des procédures courantes de liposuccion et d'abdominoplastie. Cependant, une fois obtenus, les échantillons sont généralement soumis à des conditions difficiles - soit une condition enzymatique ou une centrifugation - afin d'isoler les ASC2,3. Cette méthode illustre une procédure simple pour isoler les ASC à l'aide d'une méthode d'explantation, en l'absence de mesures enzymatiques ou de centrifugation sévères.

La méthode la plus courante d'isoler les ASC consiste à laver un échantillon adipeux, à digérer l'échantillon avec de la collagène, à centrifuer l'échantillon, et enfin à lyser les globules rouges avant de cultiver les ASC4. Bien qu'il soit efficace pour isoler un rendement élevé des ASC, l'utilisation de composants xénogéniques (p. ex., digestion enzymatique avec collagène) est considérée comme plus que « minimalement manipulée » par la Food and Drug Administration des États-Unis, et peut poser des risques tels que la réaction immunitaire, interdisant l'utilisation des cellules dans la clinique5,6. Pour minimiser les risques des composants xénogéniques, de nombreux groupes ont suggéré des enzymes non animales dérivées et fabriquées pour digérer le tissu adipeux. Cependant, ces enzymes sont encore dures, et peuvent altérer le phénotype cellulaire7.

D'autres méthodes d'isolement des ASC incluent la centrifugation à grande vitesse, l'utilisation de forces aussi élevées que 1 200 x g,et le vortex ingagépour isoler les ASC8. Même des forces aussi basses que 400 x g étaient suffisantes pour isoler les ASC viables9. Bien que ces cellules produisent une grande quantité de cellules viables, de nombreux protocoles n'ont pas proliférer au-delà de 14 jours8. En outre, l'isolement mécanique donne moins de cellules récupérées que la digestion enzymatique, mais une proportion plus élevée de cellules isolées étaient des ASC par rapport à d'autres cellules endogènes pour adipeux tissu au passage 010.

L'isolement d'une population plus pure et plus viable d'ASC en moins de temps, couplé avec le coût et les risques des composants xénogéniques, rend la digestion enzymatique de moins en moins attrayante pour la traduction à la clinique. Bien que l'isolement mécanique soit d'abord une approche favorable, il existe une disparité importante dans les méthodes utilisées, et le volume de tissu traité est limité à la taille des unités centrifuges spécialisées, et peut dépendre de la cohérence de l'opérateur2.

Tandis que la digestion enzymatique et la centrifugation produisent rapidement un volume élevé d'ASC, ces cellules isolées montrent des changements phénotypiques, donnant des questions au sujet de leur comportement une fois retournés à un patient2. Une méthode d'isolement à base d'explantation, telle que décrite dans ce protocole, est ainsi utilisée par certains groupes, par lequel les AsC migrent à partir de petits morceaux de tissu adipeux solide3,11,12. Cette migration est probablement un effet des cellules étant attirées vers les médias riches en nutriments. Comme d'autres populations de MSC, les NAs adhèrent au plastique, et survivent et prolifèrent dans les médias utilisés de culture de tissu (composants ci-dessous), permettant leur isolement des autres types de cellules du tissu adipeux. Tandis que moins de cellules sont au commencement récupérées — prenant souvent la semaine jusqu'à ce que les cellules soient visibles sur la plaque de culture de tissu - ces ASC non manipulés prolifèrent in vitro, permettant l'expansion des cellules aux volumes médicalement pertinents11,12,13.

Protocole

L'utilisation d'échantillons de lipoaspirate et d'abdominoplastie a été approuvée par la Commission d'examen institutionnel (CISR) de l'Université Rutgers — Campus de Newark.

1. Préparation des médias de culture tissulaire

  1. Préparer sterilely 500 ml de médias de culture tissulaire avant d'isoler les ASC. Pour préparer les médias de culture, ajoutez 10 % de sérum foetal défini de veau (FCS) et de pénicilline-streptomycine (10 000 U/100 ml) au média essentiel minimal de Dulbecco (DMEM) avec un taux élevé de glucose et 2 mM de L-glutamine. Le support peut être stocké à 4 oC jusqu'à 3 semaines et doit toujours être utilisé chaud (entre la température ambiante et 37 oC).
    1. Si un média différent est préféré pour la culture des cellules souches, préparez-le plutôt.

2. Isolement des ASC du tissu adipeux

  1. Obtenir des lipoaspirates ou un échantillon d'abdominoplastie. Après l'approbation de la CISR, obtenir des échantillons comme le tissu de rejet à la suite de diverses interventions chirurgicales. Transporter les lipoaspirates au laboratoire dans n'importe quel navire le chirurgien a enlevé le tissu; transporter des échantillons d'abdominoplastie dans un sac ou un contenant de spécimens de salle d'opération.
  2. Conserver l'échantillon à température ambiante jusqu'à 6 h ou à 4 oC jusqu'à 24 h si ce n'est pas le traitement immédiat. Les échantillons de tissus traités au-delà des périodes susmentionnées auront probablement une diminution du rendement cellulaire. Gardez les échantillons d'abdominoplastie humides par l'ajout de 1x phosphate stérile tamponné salin.
  3. À partir de ce moment, effectuez toutes les étapes d'une hotte à débit laminaire dans des conditions aseptiques. Portez des gants pour une protection personnelle. Gardez 10 % d'eau de Javel, 70 % d'éthanol et des serviettes en papier à proximité pour nettoyer rapidement tout déversement biologique. Éliminé de tout excès de tissu comme déchets biomédicaux.
  4. Émincer les échantillons en morceaux de 1 mm. Si le bloc d'abdominoplastie est trop grand pour fonctionner avec, couper une taille gérable de tissu hors du bloc avant de hacher. Transférer le tissu abdominoplastie sur le couvercle d'une plaque stérile de 100 mm. Utilisez une aiguille stérile pour maintenir un morceau de tissu en place et utilisez un scalpel stérile pour hacher les morceaux en coupant ou en détritant doucement le tissu en vrac.
    1. Cette étape n'est généralement pas nécessaire pour les lipoaspirates. Cependant, si de gros morceaux de tissu sont observés dans le lipoaspirate, enlever ces morceaux avec des forceps stériles et le processus comme ci-dessus.
  5. Transférer le tissu dans un tube frais et inverser ou secouer l'échantillon 5 à 6 fois pour assurer le mélange de toutes les couches. Facultatif : si le lipoaspirate est complètement installé, retirez et jetez la couche d'huile avant le mélange.
  6. Transférer 2,5 à 5 ml de tissu dans une plaque de culture de tissu traitée au plasma de 100 mm(tableau des matériaux). Mesurer le volume de l'échantillon en versant dans un tube de centrifugeuse fraîche. Si nécessaire, utilisez une spatule stérile pour aider au transfert du tissu.
  7. Ajouter un volume équivalent de supports de culture tissulaire à la plaque. Faites tourbillonner doucement la plaque pour mélanger le contenu.
  8. Incuber les pâtés à 37 oC dans 5 % de CO2 jusqu'à ce qu'un nombre suffisant de cellules soient observés sur la base de la plaque. Au fil du temps, les cellules migreront de l'intérieur du tissu sur la surface de la plaque, à ce moment-là, ils adhéreront au plastique. À leur sortie du tissu, les cellules apparaissent sous forme de petits groupes autour des morceaux de tissu.
  9. Tous les 24 h, retirer autant de liquide que possible et remplacer par une quantité similaire de médias. Laissez les morceaux de tissu en place, si possible.
  10. Une fois qu'un nombre suffisant de cellules sont notés sur la plaque (les grappes de 15 à 25 cellules restantes sur la plaque) ou après 7 jours, selon le plus tôt, enlever tous les morceaux de tissu restants.
  11. Culture les ASC dans les milieux de culture tissulaire jusqu'à ce qu'ils atteignent 70% de confluence ou jusqu'à ce que les grappes deviennent denses (-5 grappes denses de cellules sur la plaque, chacun avec un diamètre d'environ 500 'm), à quel point les cellules doivent être passages.

3 Culture des ASC

  1. Passer les NAC lorsque la plaque mère atteint environ 70% de confluence. Veillez à éviter la surconsommation des cultures ASC.
  2. Rincer délicatement la plaque avec 1x phosphate tamponné saline et trypsiniser les cellules adhérentes. Pour trypsiniser les cellules, aspirer le phosphate tamponné saline et ajouter 1 ml de trypsine avec 0,25% EDTA à chaque plaque et incuber à 37 oC pendant 5 min. Après 5 min, confirmer la désadhérence par microscopie. Si les cellules sont encore adhérentes, remettez les cellules à l'incubateur pendant 5 min supplémentaires.
  3. Ajouter une petite quantité de support (environ 25% du volume total de trypsine) à la plaque pour désactiver la trypsine, et laver doucement la base de la plaque en utilisant le média / trypsine. Pour laver la plaque, maintenez la plaque à un léger angle et doucement pipette le média / trypsine du haut de la plaque vers le bas, desserrer toutes les cellules attachées hebdomadaires de la plaque. Les cellules peuvent être re-plaquées à un rapport 1:3 ou ensemencées à une densité de 120 000 à 500 000 cellules par plaque.
    1. Si l'ensemencement est basé sur le nombre de cellules, transférez la trypsine/média de la plaque dans un tube conique de centrifugeuse, et pelletez les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 7 min. Resuspendre les cellules dans le support de culture tissulaire (environ 1 ml par plaque initiale) et compter les cellules avant l'ensemencement. Pour compter les cellules, transférez 10 l l de la suspension cellulaire dans l'hémocytomètre et comptez les cellules présentes dans le quadrant 4 x 4 à chaque coin de la grille. Moyenne de ces valeurs ensemble et de multiplier la valeur par 104 pour calculer le nombre de cellules.
    2. Ajouter le support à la plaque avant d'ensemencer les cellules. Ajouter les cellules d'une manière dropwise, puis tourbillonner la plaque pour assurer une distribution uniforme à travers la plaque.
      REMARQUE : Après 3 passages, les cellules adhérentes doivent apparaître asymétriques et en forme de fuseau. Le phénotype et le comportement de l'ASC peuvent être confirmés à l'aide de la cytométrie du débit et des tests de différenciation.
  4. Confirmation du phénotype et du comportement assominaux à l'aide de la cytométrie du débit et des tests de différenciation
    1. Cytométrie de flux
      1. Recueillir et granuler les cellules comme décrit ci-dessus. Laver les granulés avec 1x phosphate tamponné saline et étiqueter les cellules avec le fabricant des volumes recommandés d'anticorps. Un protocole détaillé pour la cytométrie de flux, une procédure de laboratoire commune, peut être trouvé ici12,14,15.
      2. Sélectionnez des panneaux de marqueurs de surface de ce qui suit pour confirmer le phénotype ASC : négatif pour CD14, CD31, CD34, CD45 et CD106; et positif pour CD29, CD36, CD44, CD73, CD90, et CD10516,17,18,19. La présence de CD36 et l'absence de CD106 discernent les ASC des MSC dérivés de la moelleosseuse 20.
    2. Résultats de différenciation : Confirmer la différenciation multilinéaire à l'aide d'un kit de différenciation MSC. Des kits sont disponibles auprès de plusieurs fabricants pour confirmer la capacité de différenciation adipogénique, ostéogénique et chondrogénique. Modifier les supports fournis par le kit tous les 3 à 4 jours selon les protocoles du fabricant pendant 3 semaines ou jusqu'à ce que la différenciation morphologique soit observée.
  5. Culture des cellules pour de multiples passages; le nombre de passages nécessaires dépendra de l'application. À chaque passage, confirmer la morphologie et le phénotype des cellules MSC à l'aide des marqueurs de surface des cellules susmentionnés, et s'assurer que la capacité de différenciation multilinéaire n'a pas été perdue. Bien que le potentiel d'expansion diffère d'un donneur à l'autre, la plupart des échantillons peuvent être étendus jusqu'à 6 à 9 passages.
  6. Cryopreserve les cellules et stocker dans l'azote liquide pour une utilisation future.

4 Cryoconservation des AsC

  1. Préparer 10 ml de solutions de congélation A et B.
    1. Pour la solution de congélation A, ajouter 20% de FCS à DMEM avec un taux de glucose élevé.
    2. Pour la solution de congélation B, ajouter 20 % de FCS et 20 % de sulfure de diméthyle (DMSO) à DMEM avec un taux de glucose élevé.
  2. Pelleter les cellules en centrifuge anticifiant 300 x g pendant 5 min. Resuspendre les cellules dans un petit volume de solution de congélation A et compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre comme à l'étape 3.3.1.
  3. Calculez le volume final dans lequel les cellules seront remises en suspension pour atteindre une concentration cellulaire finale de 500 000 à 1 000 000 de cellules/mL. Utilisez la solution de congélation A pour resuspendre la pastille dans 50 % de ce volume final. Ajouter lentement un volume égal de solution de congélation B goutte à goutte tout en agitant le tube pour atteindre la concentration cellulaire finale.
  4. Congelez immédiatement les cellules en cryovials d'une vingtaine de ml. Congeler les cryovials dans un congélateur à débit contrôlé ou dans un contenant de congélation placé à -80 oC, ce qui diminue la température de 1 oC/min. Après le gel contrôlé (pendant la nuit pour un contenant de congélation), transférer les cellules à l'azote liquide pour le stockage à long terme.

Résultats

En utilisant la méthode détaillée ici, les ASC ont été isolés avec succès à partir d'échantillons de lipoaspirate et d'abdominoplastie (figure 1). Après trois passages, les cellules isolées se sont avérées pour avoir une morphologie de MSC (asymétrique, forme de fuseau) et phénotype, semblable aux ASC suivant la digestion enzymatique (figure 2). Des études antérieures de notre groupe et d'autres ont montré que ces ASC se différencient en adipocytes, ostéocytes et neurones comme d'autres MSC, y compris les ASC isolés par d'autres moyens11,21.

Dans la plupart des cas, la migration des ASC sur la plaque de culture tissulaire peut être visualisée dans les 3 à 5 jours par microscopie lumineuse. Cependant, dans certains cas, seules les cellules clairsemées seront visibles après 7 jours. Dans de rares cas, les cellules ne migreront pas sur la plaque et/ou ne prolifèrent pas jusqu'au troisième passage. Ce résultat est généralement corrélé avec un retard dans le traitement de l'échantillon de tissu.

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Figure 1 : Représentation schématique de l'isolement de l'ASC par l'abdominoplastie et les échantillons de lipoaspirate. Des échantillons d'abdominoplastie et de lipoaspirate ont été obtenus comme tissu de rejet suivant des procédures chirurgicales courantes. Des échantillons d'abdominoplastie ont été déchiquetés, après quoi des échantillons d'abdominoplastie ou de lipoaspirate ont été plaqués comme explants dans les médias de culture de tissu. Les ASC ont migré hors du tissu, vers les médias riches en nutriments. Après 1 semaine, les explants ont été enlevés et les ASC cultivés pour l'expérimentation en aval et/ou l'application clinique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 2 : ASC isolés avec une morphologie et un phénotype MSC. Les ASC isolés par la méthode d'explantation sans enzymes ont une morphologie et un phénotype MSC au passage 3. (A) Comme d'autres MSC, ces AsC ont une forme asymétrique et fuselée, qu'elles soient isolées par une méthode d'explantation ou enzymatique (p. ex. la collagène). Les ASC isolés à l'aide de la méthode enzymatique produisent une morphologie plus longue et plus étroite que les ASC isolés d'explantation; ces derniers ressemblent plus à des MSC dérivés d'autres méthodes d'isolement sans enzymes, telles que la moelle osseuse dérivée-MSCs. (B) Comme d'autres MSC, les ASC isolés d'explantation sont négatifs pour CD45 et positifs pour CD73, CD90, et CD105. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Les AsC sont une source attrayante de MSC en raison de l'accès facile du tissu. Pour les applications cliniques et de recherche, les scientifiques doivent garder à l'esprit la variabilité des donneurs lors de l'isoler et de la culture de ces cellules. Pour des raisons qui n'ont pas encore été élucidées, les MSC de différents donneurs montrent des capacités différentes de proliférer in vitro, ce qui affectera par la suite la migration de l'ASC hors de la capacité d'explantation et de prolifération adipeuses. Bien que la variabilité puisse être observée dans le temps qu'il faut aux ASC isolés de ces explants exempts d'enzymes pour atteindre la confluence, il était rare qu'un échantillon ne prolifère pas in vitro.

Au-delà de la variabilité du donneur, la source la plus probable de l'échec des cellules à migrer hors du tissu et/ou à proliférer in vitro est la durée pendant laquelle le tissu a été stocké avant le traitement. Lorsque les échantillons ont été autorisés à s'asseoir pendant 12 h avant le traitement ou n'ont pas été maintenus humides entre la récolte et le traitement, des taux de migration et de prolifération plus faibles ont été observés. Les seuls échantillons qui souvent n'ont pas prolifèrent étaient des échantillons d'abdominoplastie qui n'étaient pas conservés humides avec une solution saline : dans ces cas, le tissu au centre du bloc tissulaire était souvent assez humide pour être traité, mais devait parfois être jeté. Il est donc essentiel de garder le tissu humide du moment de la récolte jusqu'au traitement.

Dans les cas où les ASC ne sont pas observés sur la plaque à la marque d'une semaine, les explants adipeux doivent toujours être retirés des plaques de culture tissulaire de peur que la nécrose tissulaire se produise. Parfois, il y a trop peu de cellules pour s'identifier facilement, mais ces quelques cellules seront capables de s'étendre dans le système culturel. Si les cellules ne sont toujours pas observées à 3 semaines, l'isolement doit être considéré comme échoué.

Dans certains cas, en particulier de l'abdominoplastie, il n'est pas possible d'obtenir un échantillon véritablement aseptique en raison des limitations dans l'arène chirurgicale. S'il n'est pas possible d'utiliser un vaisseau stérile pour transporter le tissu de la salle d'opération à une hotte à écoulement laminaire, enlever le 1 cm externe du tissu est généralement suffisant pour prévenir la contamination par les microorganismes. Si l'échantillon d'abdominoplastie est attaché à la peau, la peau peut être essuyée avec 70% d'éthanol pour stériliser cette surface avant de mincing le tissu adipeux.

Pendant le processus de mincing, il est essentiel que le tissu soit haché en petits morceaux fins. Si les explants sont trop gros, il n'y aura pas suffisamment de surface pour que les ASC migrent hors du tissu et sur la plaque. En outre, il est essentiel que le tissu ne reste pas dans la plaque plus longtemps que nécessaire de peur que le tissu devienne nécrotique.

Une limitation de cette méthode est l'utilisation d'une enzyme (dans le protocole décrit, trypsine) pour détacher les ASC pendant le processus de culture tissulaire. D'autres enzymes non animales, comme l'Accutase, peuvent être remplacées pour éliminer le besoin de produits d'origine animale, mais cela augmentera le coût de la culture tissulaire. Pour cette raison, entre autres, de nombreux groupes étudient des méthodes de culture tissulaire non bidimensionnelles telles que les bioréacteurs et les systèmes à base d'échafaudages pour augmenter le potentiel de croissance du SMS tout en minimisant la nécessité de détacher les cellules de leur substrat22.

Lors du déplacement des AsC à la clinique, une limitation majeure de la méthode d'isolement des explantations est la dépendance à une bonne pratique de fabrication (GMP) installation de culture tissulaire de niveau, que de nombreux centres médicaux manquent. Dans ces cas, n'importe laquelle des méthodes auto-fermées disponibles dans le commerce à base d'enzymes ou de centrifugation devrait être utilisée. Toutefois, à mesure que les installations de GMP deviennent plus répandues, on s'attend à ce que cet effet soit limité. En attendant, même de telles installations dépourvues d'installations de culture tissulaire GMP peuvent envisager d'utiliser la méthode d'explantation pour étudier les ASC in vitro: moins la manipulation, plus ces cellules sont semblables à leurs homologues in vivo11.

Cette méthode fournit un moyen simple d'isoler les ASC du tissu adipeux — à la fois les lipoaspirates et les abdominoplasties — en l'absence d'enzymes dures ou d'étapes de centrifugation. Bien que le rendement initial des ASC soit inférieur à celui des autres méthodes, les AsC prolifèrent in vitro, minimisant ainsi l'effet du rendement initial inférieur. L'absence de manipulation excessive ou énergique rend les ASC isolés d'une manière particulièrement pertinente, puisqu'il y a moins de questions (c.-à-d. si les effets observés sont dus aux cellules elles-mêmes ou à la manipulation des cellules pendant le processus d'isolement ).

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler

Remerciements

Les auteurs n'ont aucune reconnaissance

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Diméthyl SulfoxydeFisher BioréactifsBP231
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucoseSigma-AldrichD5671
Falcon 3003 Plaques de culture tissulaireCorningCorning
Fetal Bovin SerumSigma-AldrichF2442serum est testé par lots pour s’assurer qu’il soutient la croissance du MSC
L-Glutamine solutionSigma-AldrichG7513
Mr. FrostyNalgene5100-0001
Pénicilline-StreptomycineSigma-AldrichP4333
Solution trypsine-EDTASigma-AldrichT4049

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Mots-clés

Isolation sans enzymedissociation m canique des tissussyst me de culture d explantsanalyse par cytom trie en fluxessais de diff renciationmarqueurs CD73 CD90 CD105expansion en culture tissulaireprotocole de m thode de hachageproc dure de trypsinisation

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