Article de méthode

Induction de l'échec ventriculaire droit par constriction pulmonaire d'artère et évaluation de la fonction ventriculaire droite chez les souris

DOI :

10.3791/59431

⸱

13 mai 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, State Key Laboratory of Organ Failure Research, Nanfang Hospital, Southern Medical University, 2The Third Clinical Medical College, Guangzhou Medical University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous fournissons une approche utile pour étudier le mécanisme de l'échec ventriculaire droit. Une approche plus pratique et plus efficace de la constriction d'artère pulmonaire est établie utilisant des instruments chirurgicaux faits en interne. En outre, des méthodes pour évaluer la qualité de cette approche par l'échocardiographie et le cathétérisation sont fournies.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le mécanisme de l'échec ventriculaire droit (RVF) exige la clarification due à l'unicité, à la morbidité élevée, à la mortalité élevée, et à la nature réfractaire de RVF. Des modèles précédents de rat imitant la progression de RVF ont été décrits. Par rapport aux rats, les souris sont plus accessibles, économiques et largement utilisées dans les expériences animales. Nous avons développé une approche de constriction d'artère pulmonaire (PAC) qui est composée de bander le tronc pulmonaire chez les souris pour induire l'hypertrophie ventriculaire droite (RV). Une aiguille de loquet chirurgicale spéciale a été conçue qui permet une séparation plus facile de l'aorte et du tronc pulmonaire. Dans nos expériences, l'utilisation de cette aiguille de loquet fabriquée a réduit le risque d'artériorrhexis et a amélioré le taux de réussite chirurgical à 90%. Nous avons utilisé différents diamètres d'aiguille de rembourrage pour créer précisément la constriction quantitative, qui peut induire différents degrés d'hypertrophie de RV. Nous avons quantifié le degré de constriction en évaluant la vitesse de flux sanguin de l'AP, qui a été mesurée par l'échocardiographie transthoracique non invasive. La fonction de RV a été précisément évaluée par le cathéterization droit de coeur à 8 semaines après chirurgie. Les instruments chirurgicaux fabriqués en interne étaient composés de matériaux communs en utilisant un processus simple qui est facile à maîtriser. Par conséquent, l'approche PAC décrite ici est facile à imiter à l'aide d'instruments fabriqués en laboratoire et peut être largement utilisée dans d'autres laboratoires. Cette étude présente une approche PAC modifiée qui a un taux de réussite plus élevé que les autres modèles et un taux de survie post-chirurgicale de 8 semaines de 97,8 %. Cette approche DE PAC fournit une technique utile pour étudier le mécanisme de la FVR et permettra une meilleure compréhension de la FVR.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le dysfonctionnement de RV (RVD), défini ici comme évidence d'une structure ou d'une fonction anormale de RV, est associé aux résultats cliniques pauvres. RVF, comme l'étape finale de la fonction de RV, est un syndrome clinique avec des signes et des symptômes de l'insuffisance cardiaque qui résultent du RVD progressif1. Avec des différences dans la structure et la fonction physiologique, l'échec ventriculaire gauche (LV) et rVF ont des mécanismes pathophysiologiques différents. Quelques mécanismes pathophysiologiques indépendants dans RVF ont été rapportés, y compris la surexpression du récepteur adrénergique de'2signalant 2, inflammation3, remodelage transversal de tubule, et dysfonctionnement de manipulation de Ca2 '4 .

La VVR peut être causée par la surcharge de volume ou de pression du VR. Les modèles animaux précédents ont utilisé SU5416 (un inhibiteur puissant et sélectif du récepteur du facteur de croissance endothéliale vasculaire) combiné avec l'hypoxie (SuHx)5,6 ou la monocrotaline7 pour induire l'hypertension pulmonaire, qui résultats en RVF secondaire à la maladie vasculaire pulmonaire2. Les chercheurs menant ces études se sont concentrés sur la vascularisation au lieu de la progression pathologique de la FVR. En outre, la monocrotaline a des effets extra-cardiaques qui ne peuvent pas représenter précisément la maladie cardiogénique. D'autres modèles ont utilisé des shunts artérioveineux pour induire la surcharge de volume et RVF8. Cependant, cette chirurgie est difficile à effectuer et inappropriée pour les souris, qui nécessitent de longues périodes d'induction pour la production de RVF.

Les modèles Rat PAC utilisant des clips de baguage existent également9,10. Par rapport aux rats, les souris ont de nombreux avantages en tant que modèles animaux de maladies cardiaques, tels que la reproduction plus facile, une utilisation plus répandue, des coûts réduits, et l'accès à la modification des gènes11. Cependant, les diamètres des clips de baguage varient généralement de 0,5 mm à 1,0 mm, qui sont trop grands pour les souris9. En outre, le clip de baguage est difficile à produire, imiter et populariser dans d'autres laboratoires.

Nous fournissons un protocole pour développer un modèle reproducteur modifié de souris de RVF basé sur des études rapportées, qui emploie PAC pour imiter la tétralogie du syndrome de Fallot et de Noonan ou d'autres maladies hypertendues artérielles pulmonaires12,13, 14,15,16,17,18,19. Cette approche PAC est créée en ligaant le tronc pulmonaire des souris à l'aide d'un loquet et d'une aiguille de rembourrage fabriquées à l'interne pour contrôler le degré de constriction. L'aiguille de loquet est faite d'une seringue d'injection incurvée de 90 degrés avec une suture de soie tressée passée à travers la seringue. L'aiguille est faite à partir de matériaux communs en utilisant un processus qui est facile à maîtriser. L'aiguille de rembourrage est courbée à 120 degrés de l'aiguille de la jauge. Des aiguilles de rembourrage de diamètres différents (0,6 à 0,8 mm) sont utilisées, selon le poids des souris (20-35 g). En outre, nous établissons un critère d'évaluation pour déterminer la stabilité et la qualité du modèle de FVR par l'échocardiographie et le cathétérisation de coeur droit. Nous utilisons des souris comme animal modèle en raison de leur utilisation répandue dans d'autres expériences. Les aiguilles fabriquées en laboratoire sont faciles à reproduire et peuvent être largement utilisées dans d'autres laboratoires. Cette étude offre une bonne approche pour les chercheurs d'étudier le mécanisme de la FVR.

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Protocole

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Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux lignes directrices institutionnelles pour la recherche sur les animaux, qui sont conformes au Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire publié par les National Institutes of Health des États-Unis (PUBLICATION 85-23 des NIH, révisé en 1996). C57BL/6 souris mâles (8-10 semaines, pesant 20-25 g) ont été fournis par le Centre Animal de l'Université Médicale du Sud. Après l'arrivée, les souris ont été logées sous un cycle sombre/léger de 12/12 h, avec suffisamment de nourriture et d'eau.

1. Préparation des instruments chirurgicaux et fabrication des aiguilles

  1. Préparer les instruments chirurgicaux stériles (Figure 1A), une suture de soie tressée 6-0 (Figure 1B[a]) pour la ligature, et une suture en nylon 5-0 pour la fermeture de l'incision (Figure 1B[b]).
  2. Passer la suture de soie tressée 6-0 (figure1B[a]) à travers une aiguille de 25 G démontée d'une seringue d'injection de 1 ml. Ensuite, courbez l'aiguille à 90 degrés avec des forceps hémostatiques pour faire une aiguille de loquet (figure1C[a]). Courbez l'aiguille de 22 G 120 degrés (figure1C b)) pour faire une aiguille de rembourrage.

2. Préparation pour la chirurgie

  1. Autoclave tous les instruments chirurgicaux avant la chirurgie. Ajuster le coussin chauffant à 37 oC. Anesthésiez les souris par injection intrapéritonéale avec un mélange de xylazine (5 mg/kg) et de kétamine (100 mg/kg) pour soulager la douleur. Placez les souris dans des boîtes individuelles pour attendre l'inset des stupéfiants.
    REMARQUE: Il est également recommandé d'utiliser 1,5% isoflurane pour l'anesthésie inhalante.
  2. Surveillez l'adéquation de l'anesthésie par la disparition du réflexe de sevrage de la pédale. Gardez les souris en position de supine sur le coussin chauffant en fixant les incisives avec une suture et en fixant les jambes avec du ruban adhésif. Vérifiez le réflexe à nouveau pour assurer la profondeur de l'anesthésie.
  3. Appliquer la pâte dépilatoire sur la peau du cou au processus xiphoïde. Désinfecter la zone avec de l'iode suivi de 75% d'alcool.
  4. Effectuer l'intubation endotrachéale.
    1. Ajustez les paramètres du miniventilateur animal (figure1D)et fixez le taux respiratoire à 150/min et le volume des marées à 300 l.
    2. Sortez légèrement la langue à l'aide de pinces pointues, élèvez la mandibule à l'aide d'une spatule faite en laboratoire Figure 1C[c]) pour exposer la glotte, et insérez doucement une canule de trachée faite en laboratoire (figure1C[d]) à travers la glotte pendant qu'une source de lumière froide est dirigé sur le larynx.
    3. Connectez le tube et le ventilateur pour vérifier si la canule a été insérée dans la trachée. Fixez la trachée à l'aide de ruban adhésif si la canule a été insérée correctement.

3. Chirurgie

  1. Ouvrez la poitrine.
    1. Faire une incision dans la peau parallèle à la deuxième côte, d'environ 10 mm de longueur, avec des ciseaux ophtalmiques. Assurez-vous que l'incision commence à partir de l'angle sternal et se termine sur la ligne axillaire antérieure gauche. Identifiez le deuxième espace intercostal en comptant les côtes de l'angle sternal.
    2. Séparez et coupez les pectoralis majeurs et les pectoralis muscles mineurs avec des ciseaux et des pinces de coude au-dessus du deuxième espace intercostal pour exposer cet espace.
      REMARQUE : Il est également recommandé de séparer, de mobiliser et de déplacer les muscles pectoralis vers la droite et cranially.
    3. Pénétrer carrément le deuxième espace intercostal avec des pinces à coude et ouvrir cet espace. Ensuite, séparer carrément le parenchyme et le thymus jusqu'à ce que le tronc pulmonaire soit visible.
  2. Resserrer l'artère pulmonaire.
    1. Séparer carrément le tronc pulmonaire et l'aorte ascendante avec une pince à coude. Passer la suture à travers le tissu conjonctif entre le tronc pulmonaire et l'aorte ascendante avec une aiguille de loquet.
    2. Placez l'aiguille de rembourrage (voir l'étape 1.2) sur le tronc pulmonaire et, ensuite, ligate le tronc pulmonaire avec l'aiguille de rembourrage, en utilisant la suture de soie tressée 6-0. Retirez l'aiguille de rembourrage immédiatement après l'observe du remplissage du conus pulmonaire et coupez les extrémités de la suture.
    3. Observez le remplissage du conus pulmonaire pour évaluer s'il y a une constriction présente. Évaluer à nouveau le réflexe de l'animal pour assurer le succès de la ligature.
      REMARQUE: Effectuer une chirurgie fictive en suivant toutes les étapes ci-dessus, sauf pour la constriction.
  3. Fermez la poitrine et la peau avec la suture en nylon 5-0. Désinfecter à nouveau la peau avec 75% d'alcool.
  4. Injecter 0,5 ml de solution saline sous-cutanée pour remplacer tout liquide perdu pendant la chirurgie. Placez la souris dans la cage séparément avec un coussin chauffant pour favoriser la récupération. Retournez les souris dans leurs cages dans une salle de cycle clair/sombre de 12/12 h lorsque la conscience revient. Traiter les souris avec de la buprénorphine via leur eau potable pendant les 3 jours suivants.
  5. Portez une attention particulière à la guérison de la plaie de thoracotomy en surveillant les souris 2x par jour pendant la première semaine pour détecter tout signe de guérison insuffisante, de mobilité altérée, ou de perte de poids.

4. Évaluation échocardiographique de la fonction de RV après chirurgie

REMARQUE : Des changements échocardiographiques peuvent être détectés 3 jours après la chirurgie.

  1. Anesthésier les souris avec 3% d'isoflurane par inhalation et maintenir la profondeur de l'anesthésie avec 1,5% d'isoflurane. Fixez une souris sur la plate-forme, collez ses griffes à l'électrode et maintenez l'animal en position de supine. Maintenir la fréquence cardiaque de la souris entre 450-550 battements/min en ajustant la concentration d'isoflurane entre 1,5% et 2,5%.
  2. Retirez les cheveux sur la poitrine de la souris avec de la crème dépilatoire et appliquez du gel à ultrasons sur la peau de la poitrine.
  3. Évaluer la constriction pulmonaire du tronc à l'égard d'une sonde de 30 MHz.
    1. Maintenez la sonde à 30 degrés dans le sens inverse des aiguilles d'une montre par rapport à la ligne parasternale gauche, tout en orientant l'encoche dans la direction caudale. Réguler l'axe yet x-axe sous le mode B jusqu'à ce que la valve mitrale, l'aorte et la chambre LV soient clairement visibles.
    2. Faites pivoter la sonde de 30 à 40 degrés sur son axe yvers la poitrine. Réguler l'axe yet x-axe jusqu'à ce que le conus pulmonaire soit clairement visible.
    3. Placez le curseur à l'extrémité des folioles de la valve pulmonaire pour mesurer la vitesse maximale du débit. Utilisez le mode Color Doppler en appuyant sur Color, suivi de PW, puis en déplaçant le curseur pour placer la ligne PW-dashed parallèle à la direction du flux sanguin.
    4. Mesurez la vitesse maximale de l'artère pulmonaire. Enregistrez les données et l'image avec Cine Store et Frame Store.
  4. Évaluez les paramètres de RV à l'égard d'une sonde de 30 MHz.
    1. Ajuster le côté gauche du pad de sorte qu'il soit plus bas que le côté droit. Maintenez la sonde orientée à 30 degrés vers l'horizon le long de la ligne axillaire antérieure droite avec l'encoche pointée dans la direction caudale. Réguler l'axe yet x-axe jusqu'à ce que le RV soit clairement indiqué.
    2. Appuyez sur M-Mode 2x pour afficher la ligne d'indicateur. Mesurez la dimension de chambre de RV, le raccourcissement fractionnel, et l'épaisseur de mur de RV. Enregistrez les données et l'image avec Cine Store et Frame Store.
  5. Arrêtez l'inhalation d'isoflurane pour permettre aux souris de reprendre conscience, puis retournez les animaux dans leurs cages dans une salle de cycle de 12 h.

5. Cathétéisme de coeur droit pour évaluer la fonction de RV

REMARQUE : Le cathéterization droit de coeur a été exécuté 8 semaines après chirurgie pour évaluer la fonction de RV, utilisant un cathéter de 1.0 F et un système de surveillance.

  1. Autoclave tous les instruments chirurgicaux. Anesthésiez l'animal par injection intrapéritonéale avec un mélange de xylazine (5 mg/kg) et de kétamine (100 mg/kg).
  2. Après la disparition du réflexe de retrait de la pédale, fixez la souris sur la plate-forme, collez ses griffes à l'électrode et maintenez la souris en position de supine. Retirer les cheveux dans la zone chirurgicale avec de la crème dépilatoire.
  3. Désinfecter la peau de la zone chirurgicale avec 75% d'alcool. À l'aide de pinces pointues, retirez légèrement la langue, élèvez la mandibule à l'aide d'une spatule fabriquée à l'interne pour exposer la glotte, et insérez doucement la canule de trachée faite à l'intérieur par la glotte tandis qu'une source de lumière froide est dirigée sur le larynx. Utilisez un ventilateur (Figure 1E) pour aider à la ventilation.
  4. Ouvrez la cavité thoracique au moyen d'une incision bilatérale de 1,5 cm sous le processus xiphoïde à travers le diaphragme avec des ciseaux et des forceps ophtalmiques. Couper à travers le diaphragme et les côtes avec des ciseaux ophtalmiques pour exposer le cœur. Pénétrer le mur sans VR avec une aiguille de 23 G et enlever l'aiguille; appuyez doucement sur le point de perforation à l'œil d'un coton-tige pour arrêter tout saignement. Perforer le ventricule avec la pointe du cathéter à travers la plaie.
    REMARQUE: Il est également recommandé d'effectuer le cathéterisation du cœur droit via la veine jugulaire droite6. Lorsque la pointe du cathéter est dans le ventricule, le moniteur affiche la courbe de pression du VR.
  5. Enregistrez la pression artérielle systolique de RV, la pression fin-diastolique de RV, le RV dP/dt, la fréquence cardiaque de la souris, et la constante exponentielle de temps de RV de relaxation (Tau) pendant 10 min quand la courbe est stable. À l'aide du logiciel, cliquez sur Sélectionnez, puis cliquez sur Analyser.
  6. Réguler la pointe du cathéter vers le tube de sortie rv. Retirez le cathéter une fois l'enregistrement terminé. Placez le cathéter en salin lorsque les mesures sont terminées.
  7. Euthanasier les souris par injections intrapéritonéales de pentobarbital sodium 150 mg/kg, suivies d'une luxation cervicale. Ensuite, récoltez le cœur, les poumons et le tibia pour des analyses histomorphologiques et moléculaires biologiques.

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Résultats

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Dans cette étude, des souris ont été aléatoirement assignées au groupe PAC (n ' 9) ou au groupe d'opération fictif (n - 10). L'échocardiographie a été exécutée à 1, 4, et 8 semaines après la chirurgie. Huit semaines après chirurgie, suivant les dernières évaluations d'échocardiographie et de cathétérisme, les souris ont été euthanasiées, et leurs coeurs ont été moissonnés pour une évaluation morphologique et histologique.

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les augmentations pathologiques des pressions de remplissage de RV ont comme conséquence un décalage vers la gauche du septum, qui peut altérer la géométrie de LV21. Ces changements contribuent à la réduction de la production cardiaque et de la fraction d'éjection LV (LVEF), qui peut causer un trouble hémodynamique du système circulatoire22. Par conséquent, un modèle efficace, stable et économique pour étudier le mécanisme de la FVR est précieux.

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces travaux ont été soutenus par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (81570464, 81770271; à M. Liao) et par les Projets de planification municipale de la technologie scientifique de Guangzhou (201804020083) (au Dr Liao).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Ventilateur ALC-V8SSHANGHAI  ; ALCOTT  ; BIOTECH  ; COALC-V8SVentilation assistée
Mini ventilateur pour animauxHaverdType 845Ventilation assistée
Système d’échographie pour animaux VEVO2100Visual Sonic  ; VEVO2100Échocardiographie
Illuminateur à lumière froideOlympusILD-2
Light Coussin chauffant - système chirurgical thermostatique (ALC-HTP-S1)SHANGHAI  ; ALCOTT  ; BIOTECH  ; COALC-HTP-S1Chauffage
IsofluraneRWD sciences de la vieR510-22Anesthésie par inhalation
Matrx VIP 3000 Vaporisateur d’isofuraneMidmark CorporationVIP 3000Anesthésie Suture
médicale en soie tressée (6-0)Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.6-0
Ligation Suture médicale en nylon (5-0)Ningbo Medical Needle Co.5-0Suture
Cathéter Millaire (1.0 F)Instruments AD1.0FPour le cathétérisme cardiaque droit
Sel de sodium pentobarbitalMerck25MGAnesthésie
Système d’enregistrement physiologique multidirectionnel PowerLabInstruments AD4/35Enregistrer le résultat du cathétérisme cardiaque droit
Balance électronique de précisionInstrument DenverTB-114Capteur de pesage
verrouillage faite maisonSéparer l’aorte et le tronc pulmonaire
Aiguille de rembourrage faite maisonConstriction
Intubation trachéale faite maison Intubationtrachéale  ;
Matériel de microchirurgie pour petits animauxNapoxMA-65Instruments chirurgicaux
Transmission GelGuang Gong pai250MLÉchocardiographie
Crème dépilatoire VeetReckitt BenchiserRQ/B 33 Type 2Enlever les poils des souris
Stérilisateur à vapeur à pression électrothermique automatique verticalHefei Huatai Medical Equipment Co.LX-B50LNettoyage automatique des instruments chirurgicaux
Microscope vertical de chirurgie des petits animauxYihua Optical InstrumentY-HX-4APour le cathétérisme cardiaque droit
Aiguille de

Références

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