Réduction chirurgicale de la taille du Zébrafish pour l’étude de l’échelle des motifs embryonnaires

Résumé

Ici, nous décrivons une méthode pour réduire la taille des embryons de zébrafish sans perturber les processus de développement normaux. Cette technique permet d’étudier la mise à l’échelle des patrons et la robustesse du développement contre le changement de taille.

Résumé

Dans le processus de développement, les embryons montrent une capacité remarquable à assortir leur modèle corporel à leur taille corporelle; leur proportion corporelle est maintenue même chez les embryons plus grands ou plus petits, dans certaines limites. Bien que ce phénomène de mise à l’échelle ait attiré l’attention depuis plus d’un siècle, la compréhension des mécanismes sous-jacents a été limitée, en partie en raison d’un manque de description quantitative de la dynamique du développement chez les embryons de tailles variées. Pour surmonter cette limitation, nous avons développé une nouvelle technique pour réduire chirurgicalement la taille des embryons de zébrafish, qui ont de grands avantages pour l’imagerie en direct in vivo. Nous démontrons qu’après l’élimination équilibrée des cellules et du jaune au stade blastula dans des étapes distinctes, les embryons peuvent rapidement se rétablir dans les bonnes conditions et se développer en embryons plus petits mais normalement normaux. Comme cette technique ne nécessite pas d’équipement spécial, elle est facilement adaptable et peut être utilisée pour étudier un large éventail de problèmes de dimensionnement, y compris la robustesse du modelage par médiation morphogénique.

Introduction

Les scientifiques ont longtemps connu que les embryons ont une capacité remarquable à former des proportions constantes du corps bien que la taille de l’embryon peut varier grandement à la fois dans les conditions naturelles et expérimentales^1,2,3. Malgré des décennies d’études théoriques et expérimentales, cette robustesse à la variation de taille, appelée mise à l’échelle, et ses mécanismes sous-jacents demeurent inconnus dans de nombreux tissus et organes. Afin de capturer directement la dynamique du système en développement, nous avons établi une technique de réduction de....

Protocole

Toutes les procédures liées au poisson ont été effectuées avec l’approbation du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de la Harvard Medical School.

1. préparation des outils et des réactifs

1. Faire une boucle de fil pour hacher les embryons
   1. Prendre 20 cm de fil d’acier inoxydable rigide et non corrosif d’un diamètre de 40 μm. Boucler le fil dans le capillaire en verre (diamètre extérieur de 1,0 mm, diamètre intérieur 0,5 mm, sans filament), en faisant une petite boucle au sommet (longueur de boucle de 1,0 mm)
   2. Mettre une petite goutte de vernis à on....

Résultats

La réduction du volume du jaune est importante pour la morphologie normale
Comme nous l’avons récemment décrit dans Almuedo-Castillo et al.¹⁷, la réduction de la taille des embryons peut être obtenue sans réduire le volume du jaune. Pour comparer avec et sans réduction du volume du jaune, nous avons effectué deux étapes de hachage (blastula et jaune) et de hachage blastula seulement (figure 2 et film supplémentaire 1). Les embryons.......

Discussion

Historiquement, parmi les animaux vertébrés, la réduction de la taille a été principalement réalisée à l’aide d’embryons d’amphibiens, en bisayant les embryons le long de l’axe animal-végétal à une phase blastula¹². Cependant, il y a principalement deux différences entre les embryons de grenouille et de zébrafish lorsque nous bisect embryons. Premièrement, au stade où les embryons de zébrafish deviennent tolérants au bisou (stade blastula), l’organisateur est situé dan.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîte de Pétri en PYREX 60 mm	CORNING	²nbsp ; 3160-60
Agarose	affymetrix	75817	Pour la fabrication d’un support pour l’imagerie en direct
Agarose, basse température de gélification Type VII-A	SIGMA-ALDRICH	A0701-25G
CaCl2	EMD	CX0130-1	Pour 1/3 Solution de Ringer
CaSO4			Pour l’eau d’œuf
Housse (25 mm x 25 mm, Epaisseur 1)	CORNING	2845-25
Spatule jetable	VWR  ;	80081-188
Carton mousse	ELMER’S	951300	Pour incubateur de microscope
Forcept (N° 55)	FST	11255-20
Pipette en verre	VWR	14673-043
HEPES	SIGMA Life Science	H4034	Pour 1/3 Solution de Ringer
INCUKIT XL Pour Incubateur d’armoire	INCUBATEUR Warehouse.com		Pour incubateur de microscope
Sel de mer instantané	Instant Ocean	138510	Pour l’eau d’œuf
KCl	SIGMA-ALDRICH	P4504	Pour 1/3 Solution de Ringer
Méthylcellulose	SIGMA-ALDRICH	M0387-100G
NaCl	SIGMA-ALDRICH	S7653	Pour 1/3 Solution de Ringer
Boîte de Pétri	Falcon	351029	Pour fabrication d’un support pour l’imagerie en direct
Rouge phénol	SIGMA Life Science	P0290
Pompe pipette	BEL-ART PRODUCTS	F37898
Pronase	EMD Millipore Corp	53702-250KU
Tricaine-S (MS222)	WESTERN CHEMICAL INC
Ultra mince recuit brillant 316L dia. 0,035 mm Acier inoxydable Fils de tissage	Sandra		Le fil que nous avons utilisé a été obtenu il y a ~20 ans et nous n’avons pas pu trouver exactement le même. Ce produit a le même matériau et le même diamètre que celui que nous utilisons.