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Un modèle de souris non aléatoire pour la réactivation pharmacologique de Mecp2 sur le chromosome X inactif

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DOI :

10.3791/59449

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22 mai 2019

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1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia School of Medicine, 2Department of Neuroscience, University of Virginia School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Ici, nous décrivons un protocole pour générer un modèle de murin femelle viable avec l’inactivation non aléatoire de chromosome x, c.-à-d. le chromosome x maternellement hérité est inactif dans 100% des cellules. Nous décrivons également un protocole pour tester la faisabilité, la tolérabilité et la sécurité de la réactivation pharmacologique du chromosome X inactif in vivo.

Résumé

L’inactivation des chromosomes x (XCI) est le silençage aléatoire d’un chromosome X chez les femelles pour atteindre l’équilibre posologique génique entre les sexes. En conséquence, toutes les femelles sont hétérozygotes pour l’expression génique liée au X. L’un des régulateurs clés de XCI est Xist, qui est essentiel pour l’initiation et la maintenance de XCI. Des études antérieures ont permis d’identifier 13 facteurs d’inactivation des chromosomes X (XCIFs) TRANS-agissant à l’aide d’un écran génétique à grande échelle et à perte de fonction. L’inhibition des XCIFs, tels que ACVR1 et PDPK1, à l’aide d’ARN à courte épingle à cheveux ou d’inhibiteurs de petites molécules, réactive les gènes liés aux chromosomes X dans les cellules cultivées. Mais il reste à déterminer la faisabilité et la tolérabilité de la réactivation du chromosome X inactif in vivo. Vers cet objectif, un modèle de souris Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP a été généré avec des XCI non aléatoires en raison de la suppression de Xist sur un chromosome X. À l’aide de ce modèle, l’étendue de la réactivation X inactive a été quantitée dans le cerveau de la souris après un traitement par des inhibiteurs de la XCIF. Les résultats récemment publiés montrent, pour la première fois, que l’inhibition pharmacologique de XCIFs réactive Mecp2 du chromosome X inactif dans les neurones corticaux du cerveau de la souris vivante.

Introduction

L’inactivation des chromosomes x (XCI) est un processus de compensation de dosage qui équilibre l’expression génique liée au X en faisant taire une copie du chromosome X chez les femelles1. En conséquence, le chromosome X inactif (XI) accumule les caractéristiques caractéristiques de l’hétérochromatine, y compris la méthylation de l’ADN et les modifications inhibitrices de l’histone, telles que la triméthylation de l’histone H3-lysine 27 (H3K27me3) et l’ubiquitination de l’histone H2A (H2Aub) 2. le régulateur principal du silençage de chromosome x est la région du centre d’inactivation x (XIC), autour de 100 − 500 kb, qui contrôle le comptage et l’appariement des chromosomes x, le choix aléatoire du chromosome x pour l’inactivation, et l’initiation et propagation du silençage le long du chromosome X3. Le processus d’inactivation de X est initié par X transcription spécifique inactive (Xist) qui recouvre le XI dans CIS pour médiate le silençage à l’échelle du chromosome et remodeler la structure tridimensionnelle du chromosome x4. Récemment, plusieurs écrans protéomiques et génétiques ont identifié des régulateurs supplémentaires de XCI, tels que les protéines interdépendantes Xist 5,6,7,8,9 , le 10 , le 11 , 12. par exemple, une étude antérieure utilisant un écran d’interférence d’ARN à l’échelle du génome non biaisé a identifié 13 facteurs XCI TRANS-agissant (xcifs)12. Mécanistiquement, XCIFs réguler l’expression Xist et, par conséquent, interférer avec la fonction xcifs provoque défectueux XCI12. Ensemble, les progrès récents dans le domaine ont fourni des informations importantes sur la machinerie moléculaire qui est nécessaire pour initier et maintenir XCI.

L’identification des régulateurs XCI et la compréhension de leur mécanisme dans XCI est directement pertinente pour les maladies humaines liées aux X, comme le syndrome de Rett (RTT)13,14. La RTT est un trouble neurodéveloppemental rare provoqué par une mutation hétérozygote dans la protéine de liaison méthyl-CpG 2 (MeCP2) liée aux X qui touche principalement les filles15. Parce que MeCP2 est situé sur le chromosome X, les filles de RTT sont hétérozygotes pour la carence de MECP2 avec ~ 50% cellules exprimant le type sauvage et ~ 50% exprimant le mutant MeCP2. Notamment, les cellules mutantes RTT abritent une copie dormante mais sauvage de Mecp2 sur le XI, fournissant une source du gène fonctionnel, qui, si réactivé, pourrait potentiellement atténuer les symptômes de la maladie. En plus de la RTT, il existe plusieurs autres maladies humaines liées à X, pour lesquelles la réactivation de XI représente une approche thérapeutique potentielle, comme le syndrome de DDX3X.

L’inhibition du XCIFs, de la protéine kinase-1 (PDPK1) dépendante du 3-phosphoinositide et du récepteur de type 1 (ACVR1) de l’activine A, soit par l’ARN court en épingle à cheveux (shRNA), soit par des inhibiteurs de petites molécules, réactive les gènes liés au XI12. La réactivation pharmacologique des gènes liés au XI est observée dans divers modèles ex vivo incluant des lignées cellulaires de fibroblastes de souris, des neurones corticaux de souris adultes, des fibroblastes embryonnaires de souris et des lignées cellulaires de fibroblastes dérivées d’un patient de RTT12. Toutefois, il reste à démontrer si la réactivation pharmacologique des gènes liés au XI est réalisable in vivo. L’un des facteurs limitatifs est l’absence de modèles animaux efficaces pour mesurer avec précision l’expression des gènes du XI réactivé. Vers cet objectif, un modèle de souris Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP a été généré qui porte un Mecp2 génétiquement étiqueté sur XI dans toutes les cellules en raison de la suppression hétérozygote dans Xist sur le chromosome X maternel16. Utilisant ce modèle, l’expression de Mecp2 de XI a été quantitée après traitement avec des inhibiteurs de xcifs dans le cerveau des souris vivantes. Ici, la génération du modèle et de la méthodologie de la souris Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP pour quantifier la réactivation XI dans les neurones corticaux à l’aide d’essais à base d’immunofluorescence est décrite.

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Protocole

Le travail impliquant des souris a été approuvé par le Comité d’utilisation et de protection des animaux de l’Université de Virginie (IACUC; #4112).

1. générer un modèle de souris XCI non aléatoire avec génétiquement étiqueté Mecp2 sur XI

Remarque: Les souches de souris utilisées dans l’étude étaient les suivantes: Mecp2-GFP/Mecp2-GFP (Mecp2TM 3.1 Bird, table des matières) et Xist/δxist (B6; 129-Xist < tm5Sado >; fourni par Antonio bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle). Les stratégies d’élevage parmi les souches respectives ont été conçues pour élargir les colonies de souris pour chaque souche.

  1. Effectuer une PCR-génotypage sur toutes les souches de souris et les descendances respectives obtenues après la reproduction à l’aide d’amorces spécifiques au gène énumérées dans le tableau 1.

2. concevez la stratégie de sélection de souris pour générer Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP

  1. Mettre en place une paire de reproducteurs en abritant un mâle Mecp2-GFP/Y et un XistΔ-Mecp2/Xist-Mecp2 femelle ensemble (12 h/12 h: cycle lumière/obscurité) (figure 1a). Idéalement, mettre en place au moins 5 paires de reproduction à la fois en utilisant des souris viables et fertiles. Après que la femelle enceinte donne naissance, lui permettre d’élever sa première litière avec le mâle.
    Remarque: Parce que le Knockout Xist paternel altère les XCI imimprimés, la compensation de dosage et les voies de différenciation17, l’utilisation de souris xistδ-Mecp2/Y dans l’élevage ne produira pas les chiots femelles avec le génotype requis.
  2. Après le sevrage de la litière au jour 21 (P21) post-natal, identifiez et balisez les chiots femelles Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP à l’aide d’un dosage de génotypage à base de PCR (figure 1b).
    Remarque: En ce qui concerne le nombre d’animaux nécessaires par groupe, pour les résultats rapportés ci-dessous, 5 couples reproducteurs ont été mis en place qui ont généré environ 10 femelles Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP souris.
  3. Utilisez des modèles de souris femelles pour toutes les expériences proposées.
    Remarque: Le sexe est une variable biologique importante pour les études XCI, et le modèle masculin ne tient pas compte des effets confusionnels de XCI aléatoire.
  4. Pour être cohérent tout au long des études animales et exclure tous les effets de l’âge animal, effectuer toutes les expériences chez les femelles de 5 − 8 semaines Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP .

3. isolat femelle Xistδ: Mecp2/Xist: fibroblastes embryonnaires de souris Mecp2-GFP (MEFs)

  1. Configurez l’accouplement chronométré entre le mâle Mecp2-GFP/Y et le Xistδ-Mecp2/Xist-Mecp2 femelle. Mettre en place au moins 3 − 4 cages d’accouplement pour augmenter la probabilité de grossesse.
  2. Après avoir confirmé le bouchon vaginal le matin après l’accouplement, séparer la femelle et ce jour est considéré comme le jour embryonnaire 0,5 (E 0.5). Surveillez le gain de poids de la femelle enceinte prospective et inspectez visuellement l’abdomen des souris pour confirmer la grossesse. Sur E 14.5 − 15.5, euthanasier les souris femelles enceintes par la dislocation cervicale.
  3. Sous une hotte laminaire, essuyez l’abdomen de la femelle enceinte avec 70% d’éthanol. En utilisant des ciseaux stériles, disséquez la cavité abdominale et enlevez les cornes utérines contenant les embryons. À l’aide de forceps, enlevez doucement les embryons tout en coupant le tissu abdominal restant (6 − 12 embryons est habituellement attendu).
  4. Placer les cornes utérines contenant les embryons dans un plat de 10 mm de culture tissulaire. En utilisant des ciseaux et des pinces stériles, faire une incision le long des cornes utérines pour isoler les sacs individuels porteurs d’un embryon. Soigneusement, placer les cornes utérines contenant le reste des embryons dans 30 mL de solution stérile de sel équilibré de Hanks (HBSS) sur la glace.
  5. Coupez doucement le sac et isolez l’embryon à l’aide de ciseaux et de forceps stériles. Retirer le placenta en coupant le cordon ombilical.
  6. Décapiter l’embryon.
    Remarque: Alors que le reste du tissu embryonnaire sera transformé, le tissu de la tête d’embryon sera utilisé pour isoler l’ADN pour le génotypage.
  7. Ouvrez l’abdomen en coupant la ligne médiane de l’embryon à l’aide de ciseaux et de forceps stériles. Enlevez les organes viscéraux, tels que le cœur, le foie et les poumons.
  8. Transférer le reste du tissu embryonnaire dans une plaque de culture tissulaire stérile de 60 mm et couper en petits morceaux à l’aide de ciseaux ou d’une lame de rasoir. Pour briser les amas cellulaires, ajouter 3 mL de trypsine-EDTA (0,05%) et incuber à 37 ° c pendant 15 min.
  9. Neutraliser la trypsine-EDTA en ajoutant 5 mL du milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 10 μg/mL de pénicilline/streptomycine (stylo/STREP) à la plaque et dissociez le tissu par pipetage répétitif (environ 20 − 30 fois).
  10. Faire tourner les cellules à 300 x g pendant 5 min et suspendre à nouveau le culot cellulaire dans 4 ml de DMEM avec 10% de FBS et 10 μg/ml de stylo/STREP. Plaque les cellules sur un plat de culture 60 mm, et la culture des cellules à 37 ° c en présence de 5% CO2.
  11. Effectuer les étapes 3.5 − 3.10 pour chaque embryon.
  12. Les MEFs de culture obtenus à l’étape 3,11 pendant au moins 3 − 4 jours.
    Remarque: À ce stade, les MEFs peuvent également être cryopréservés pour des expériences futures.
  13. Pour déterminer le sexe et le génotype de chaque embryon, effectuer le génotypage-PCR à l’aide d’ADN isolé des têtes des embryons à l’aide des amorces et des conditions de PCR énumérées dans le tableau 1.

4. confirmer l’absence d’expression de la protéine fluorescente verte (GFP) dans le cerveau des souris Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP à l’aide d’un test de tri à base de cellules activées par Ffluorescence

  1. À l’aide de ciseaux, séparer le cortex cérébral du reste des hémisphères cérébraux, et placer dans 1 mL de tampon d’isolement de noyaux de glace-froid (NIM) contenant 250 mM de saccharose, 25 mM de chlorure de potassium (KCl), 5 mM de chlorure de magnésium (MgCl2), 10 mm Tris-Cl, complété par 2% de paraformaldéhyde (PFA) et 0,1% de surfactant nonionique (table des matières).
  2. Homogénéiser à l’aide d’un homogénéisateur de verre glacé.
  3. Faire tourner le tissu homogénéisé à 600 x g, 4 ° c pendant 5 min.
  4. Retirer le surnageant et Resuspendre le granule dans 1 mL d’iodixanol à 25% dans la solution NIM.
  5. Ajouter 1 mL de 29% de lodixanol dans la solution de NIM à un tube d’ultracentrifuge de 4 mL (conserver sur la glace jusqu’à ce que les échantillons soient prêts) et mettre délicatement en couche 1 mL d’échantillon (dans 25% de lodixanol).
  6. Centrifuger à 9 000 x g, 4 ° c pendant 10 min dans un ultracentrifuge.
  7. Aspirer le surnageant et le resuspendre dans 500 μL de tampon de tri des cellules activées par fluorescence (FACS) (solution saline tamponnée au phosphate [PBS] additionnée de 1 mM d’EDTA, 0,05% d’azide de sodium et 2% d’albumine sérique bovine [BSA]).
    Remarque: Les échantillons peuvent être stockés à 4 ° c ou jusqu’à 1 semaine.
  8. Ajouter 5 μL de 7-amino-actinomycine D (7-AAD; 50 mg/mL) pendant 5 min à la température ambiante pour tacher l’ADN.
  9. Analysez les échantillons pour le signal de 7-AAD et de protéine fluorescente verte (GFP) utilisant la cytométrie de flux.

5. déterminer la faisabilité du modèle de souris Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP pour la réactivation XI

  1. Semences 1 x 105 cellules/ml femelle Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP MEFs, Mecp2/Mecp2-GFP et Xist-Mecp2/Y MEFs obtenues à l’étape 3,12 dans un format 6 puits et dans des lames de chambre, en DMEM avec 10% FBS et 10 μg/ml PEN/STREP, à 37 ° c présence de 5% de CO2.
    Remarque: Les MEFs Mecp2/Mecp2-GFP et Xist-Mecp2/Y sont utilisés comme témoins positifs et négatifs dans les expériences.
  2. Ajouter le milieu frais aux cellules après 24 h. Pour Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP MEFs, ajouter le milieu complété par des inhibiteurs de xcifs (par exemple, 0,5 μm LDN193189 et 2,5 μm GSK650394), ou seul véhicule. Remplacer le milieu complété par un inhibiteur frais ou un véhicule seul tous les 2 jours. Pour les MEFs Mecp2/Mecp2-GFP et Xist-Mecp2/Y , ajouter le milieu frais tous les 2 jours.
  3. Après 1 semaine de traitement inhibiteur, récolter des MEFs pour l’isolement de l’ARN (plaque de 6 puits) ou fixer des cellules pour l’immunofluorescence (lames de chambre). Utiliser des MEFs isolés des embryons Mecp2/Mecp2-GFP comme des embryons positifs et Xist-Mecp2/Y comme témoins négatifs respectivement.
    1. Pour l’isolement de l’ARN, isolez l’ARN total par le réactif d’extraction d’ARN à base de guanidinium thiocyanate et transcrisez à l’inverse en utilisant la transcriptase inverse. Mesurer l’expression Mecp2-GFP par la transcriptase inverse quantitative (qRT-PCR) à l’aide de Mecp2-WT et Mecp2-GFP, et les amorces énumérées dans le tableau 1, comme décrit précédemment12.
    2. Pour l’immunofluorescence, taches MEFs avec un anticorps primaire anti-GFP (1:100), comme décrit précédemment12,16. Mesurer l’intensité du GFP par immunofluorescence quantitative dans le traitement Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP MEFs, tel que décrit précédemment18.

6. démontrer la réactivation pharmacologique XI dans le cerveau du modèle de souris Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP

  1. Préparez les drogues et contrôlez le véhicule.
    1. Préparer une solution fraîche et stérile de véhicule (0,9% de NaCl, 0,5% de méthylcellulose, 4,5% de diméthyl sulfoxyde [DMSO]) pour les injections cérébrales.
    2. Préparer les inhibiteurs chimiques, y compris 1,5 mM LDN193189 (inhibiteur de la petite molécule de ACVR1) et 1,6 mM GSK650394 (inhibiteur de la petite molécule de SGK1, un effecteur en aval de PDPK1) résuspendu dans le véhicule (0,9% NaCl, 0,5% méthylcellulose, 4,5% DMSO), ou véhicule rien que. Le volume total d’inhibiteurs chimiques ou de véhicules injectés est de 10 μL par dose par animal.
  2. Préparez l’animal pour les injections cérébrales.
    1. Préparez la zone chirurgicale en essuyant le banc et le coussin chauffant avec un désinfectant (solution d’hypochlorite de sodium à 10%).
    2. Anesthésier la souris âgée de 4 semaines avec une injection intrapéritonéale de mélange de kétamine/xylazine à une dose de 140 mg/kg et de 10 mg/kg, respectivement. Utilisez le réflexe de retrait de la pédale pour déterminer le niveau d’anesthésie.
    3. Appliquez l’Onguent ophtalmique aux yeux après l’induction de l’anesthésie pour prévenir le séchage de la cornée.
    4. Rasez la fourrure du cou vers le haut de la tête de la souris.
    5. Positionnez la souris dans la plate-forme stéréotactique en accrochant les dents incisives de la souris dans la barre de morsure du resformateur du museau et en serrant la pince de nez sur le museau tout en veillant à ce que la tête de la souris se trouve sur un plan de niveau.
    6. Ajustez la hauteur des barres d’oreille, si nécessaire, pour atteindre la portion caudale du conduit auditif, en les fixant de telle sorte que la tête de la souris est dans un plan de niveau et immobilisé sur le toucher du doigt.
    7. Désinfecter la tête de la souris avec des lingettes alternées d’un antiseptique topique, comme l’iode povidone et l’éthanol 70%.
  3. Administrer des médicaments.
    1. À l’aide d’un scalpel stérile, faire une incision horizontale de 0,75 cm dans le cuir chevelu moyen.
    2. À l’aide d’une bavure de 0,45 mm, percer deux trous symétriques au-dessus des hémisphères corticaux droite et gauche (2 mm de la suture sagittale et 2 mm de la suture lambdoïde, approximativement au milieu de l’os pariétal).
    3. Fixez fermement une seringue de 10 μL à la plate-forme stéréotactique.
    4. Mélanger la solution d’inhibiteurs chimiques et prélever 10 μL de solution dans la seringue. Évitez les bulles d’air dans la seringue.
    5. Faire avancer l’aiguille de la seringue dans le trou de bavure en maintenant l’aiguille perpendiculaire (90 °) au crâne. Lorsque l’aiguille traverse le crâne, zéro les coordonnées sur l’affichage numérique stéréotactique, puis avancer la pointe de l’aiguille jusqu’à ce qu’elle atteigne une profondeur de 2,5 mm.
    6. Retirer l’aiguille 0,5 mm à la profondeur pour 2 mm.
    7. Injecter lentement 10 μL de solution (~ 1 min). Après l’injection est terminée, laisser l’aiguille dans le cerveau pendant ~ 1 min, puis retirer l’aiguille.
    8. Répéter l’injection pour le deuxième hémisphère (contrôle du véhicule uniquement).
    9. À l’aide de sutures ou de «colle cutanée» fermez la peau de la souris (si la plaie est > 0.5 cm, les deux sutures et la «colle cutanée» doivent être utilisées).
    10. Desserrez les barres d’oreille et retirez la souris de l’appareil stéréotactique.
    11. Administrer des analgésiques (buprénorphine SR 0,5 mg/kg IP) et placer la souris sur un coussin chauffant réglé à 37 ° c jusqu’à ce que l’animal retrouve la conscience.
    12. Une fois que la souris est alerte et réactive, retransférez l’animal dans sa cage d’origine.
    13. Répétez la procédure tous les 2 jours pendant 20 jours. Le perçage répété de la zone n’est pas nécessaire pour les injections ultérieures.
  4. Isoler le cerveau de la souris.
    1. Une fois le schéma posologique terminé, euthanasier la souris dans une chambre CO2 .
    2. Immobilisez la souris sur une surface à l’aide d’aiguilles.
    3. Faire une incision latérale à travers le tégument et la paroi abdominale juste sous la cage thoracique à l’aide de ciseaux et forceps. Séparer soigneusement le foie du diaphragme.
    4. À l’aide de ciseaux, coupez le diaphragme et continuez à couper le long de la cage thoracique pour exposer la cavité pleurale.
    5. À l’aide de ciseaux, faire une incision à l’extrémité postérieure du ventricule gauche.
    6. Immédiatement, commencer à injecter la chambre de coeur droit avec ~ 15 mL de PBS plus de ~ 2 min. changement de couleur du foie du rouge au rose pâle est révélateur d’une bonne perfusion.
    7. Injecter la chambre droite du coeur de la souris avec ~ 10 mL de 4% paraformaldéhyde dans PBS plus de ~ 2 min.
    8. Décapiter la souris, et utiliser des ciseaux pour faire une incision de la ligne médiane du cuir chevelu pour exposer le crâne.
    9. Placez un bout des ciseaux dans le foramen Magnum, et coupez latéralement dans le crâne vers l’œil. Répétez pour l’autre côté. Essayez de garder la fin des ciseaux aussi superficiel que possible pour éviter les blessures du cerveau.
    10. Utilisez des ciseaux pour couper la région entre les yeux et au-dessus du nez de la souris.
    11. Utilisez des pinces pour peler doucement les os crâniens des hémisphères cérébraux.
    12. Soulevez le cerveau avec une spatule, et utilisez des ciseaux pour disséquer soigneusement les fibres nerveuses crâniennes qui le fixent au crâne.
    13. Placez le cerveau sur un plat en plastique, découpez le cervelet et les ampoules olfactives, et placez le cerveau dans un tube de 15 mL rempli de 4% PFA est PBS.
  5. Cryo-section le cerveau de la souris.
    1. Fixer le cerveau dans 4% paraformaldéhyde dans PBS à 4 ° c pendant la nuit.
    2. Rincer le cerveau avec du PBS à 4 ° c au moins 3x pendant 5 min chacun.
    3. Étiqueter les moules jetables pour CRYOPRESERVER les tissus.
    4. Découpez l’avant du cerveau à l’aide de ciseaux et de forceps (commencez à faire des sections de 5 mm des sites d’injection).
    5. Transférez le cerveau vers le cryomold avec l’avant du cerveau vers le bas pour obtenir des sections coronale. Submerger le moule contenant le cerveau dans le composé de température de coupe optimal (OCT).
    6. Versez de l’azote liquide dans une boîte de Petri en plastique de 10 mm et placez le cerveau dans le cryo-moule dans l’azote.
      Remarque: Il est important d’orienter le tissu comme décrit dans l’étape 6.5.5 pour guider la sectionnement du cerveau.
    7. Lorsque l’OPO est blanc fixe, placez le cerveau congelé dans un congélateur de-80 ° c pour le stockage.
    8. Equilibrer le cerveau à-20 ° c pendant au moins 30 min avant de sectionner avec cryostat et cryosection (épaisseur 5 − 6 μM) le cerveau, montage 2 − 3 sections par glissière. Les lames peuvent être stockées à-80 ° c pour une utilisation ultérieure.
  6. Déterminez la réactivation XI à l’aide d’une approche basée sur l’immunofluorescence.
    1. Avant de commencer la procédure de coloration, sécher les sections du cerveau pendant la nuit à 4 ° c.
    2. Immerger les lames dans la solution de récupération d’antigène (0,1 M d’acide citrique, 0,1 M Tris-base, pH = 6,0) sur un bloc chauffant 100 ° c pendant 5 min.
    3. Laver les lames 4x avec 1x PBS pendant 5 min chacune à température ambiante.
    4. Immerger les lames dans la solution de blocage (0,1 M NH4CL/PBS/0,2% gélatine/0,05% surfactant nonionique) pendant 20 min à température ambiante.
    5. Laver les lames 3x avec un tampon de lavage (PBS/0,2% de gélatine) à température ambiante pendant 5 min chacune.
    6. Colorer les sections cérébrales avec des anticorps anti-GFP-AlexaFluor647 (1:100) et anti-MAP2 (1:1000) dans le milieu d’incubation (PBS/0.2% gélatine/1% BSA) et incuber à 4 ° c pendant la nuit.
    7. Collecter des anticorps primaires (peut être réutilisé). Laver les lames 4x avec un tampon de lavage pour un total de 30 min à température ambiante.
    8. Incuber les sections cérébrales avec de l’anticorps secondaire marqué par l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (1:1000) dans le milieu d’incubation et incuber 1 − 2 h à température ambiante dans l’obscurité.
    9. Laver les lames 4x avec un tampon de lavage pour un total de 30 min à température ambiante.
    10. Placer une goutte de milieu de montage avec le 4 ′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) sur une lamelle de 22 mm x 50 mm, puis inverser la lèvre sur une glissière, couvrant toutes les sections de tissu.
    11. Image sur un microscope et ajuster les images pour le contraste et la luminosité. Capturer des images et quantifier le nombre de cellules GFP-positives pour les deux traités médicamenteux et traités par le véhicule Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP souris cerveau hémisphères.

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Résultats

Pour démontrer la faisabilité du modèle de souris Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP pour les études de réactivation XI, la réactivation induite par l’inhibiteur de la xcif du Mecp2-GFP lié au XI a été testée dans des fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs). Les MEFs femelles ont été isolées du jour 15,5 Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP embryons comme décrit dans la section 3 (figure 1a). Les génotypes de la femelle Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP

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Discussion

Auparavant, les XCIFs qui sont sélectivement requis pour le silençage des gènes liés au XI dans les cellules femelles de mammifères ont été identifiés12. Nous avons également optimisé les puissants inhibiteurs de petites molécules pour cibler les XCIFs, tels que les ACVR1 et les effecteurs en aval de PDPK1, qui réactivent efficacement les Mecp2 liées aux XI dans les lignées cellulaires de fibroblastes de souris, les neurones corticaux de souris et une cellule de fibroblastes humaines lign...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient Antonio Bedalov d’avoir fourni des réactifs; Université de Virginia tissue Histology Core pour la cryosectionnement; Université de Virginie flux cytométrie de base pour l’analyse de cytométrie en flux; Christian Blue et Saloni Singh pour l’assistance technique au génotypage. Ce travail a été appuyé par une subvention de recherche double Hoo à Z.Z., et un prix du programme pilote de projet du prix de l’Université de Virginia-Virginia Tech Seed Fund et le prix de recherche biomédicale individuelle de la Fondation Hartwell à

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
MICE
Mecp2tm3.1BirdLe Laboratoire Jackson#014610
B6 ; 129-Xist (tm5Sado)fourni par Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle
REAGENTS
22x22 mm lamelleFISHERfinest (Fisher Scientific)125488
32 % ParaformaldéhydeMicroscopie électronique Sciences15714-S
Seringue de 50 mlMedline IndustriesNPMJD50LZ
Boîte de culture de 60 mmCellStar628160
7-AAD BioLegend420403
chlorure d’ammonium (NH4Cl)Fisher ChemicalA661-3
anti-GFP-AlexaFluor647InvitrogenA-31852
anti-MAP2Aves LabsMAP
BSAPromegaR396D
Buprénorphine SRZoopharm
acide citrique SigmaC-1857
DMSOFisher BioreagentsBP231-100
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Corning Cellgro10-013-CV
EthanolDecon Labs2701
sérum de bovin fœtal (FBS)VWR Life Science89510-198
gélatineSigma-AldrichG9391
lames de verreFisherbrand22-034-486
anti-poulet FITC anticorps secondaire marqué Aves LabsF-1005
GSK650394ApexBioB1051
hamilton 10&mu ; l seringue Hamilton Sigma-Aldrich28615-U
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14025-092
KétamineKetasetNDC 0856-2013-01
Grands ciseaux incurvés émoussés/émoussésOutils de science fine14519-14
LDN193189Cayman Chemicals11802
lodixanolSigma
chlorure de magnésium (MgCl2)Fisher ChemicalM35-212
MethylceluloseSigmaM0262-100G
support de montage avec pointe d’aiguille DAPI VectashieldH-1200
, 26 GA x 1,25PrecisionGlide305111
pommade ophtalmique Refresh Lacri-Lube93468
température de coupe optimale (O.C.T.) ThermoFisher
PCR mix
Pénicilline/Streptomycine (Pen/Strep)Corning30-002-Cl
Solution saline tamponnée au phosphate pH 7,4 (PBS)Corning Cellgro46-103-CM
Chlorure de potassium (KCl)Lamesde
Plateau
colle cutanée/adhésif pour tissus3M Vetbond1469SB
azoture de sodiumFisher ScientificCAS 26628-22-8
Chlorure de sodium (NaCl)Fisher ChemicalS642-212
pince hémostatique standardOutils de sciences fines13013-14
Pince à épiler Science Tools11027-12
Ciseaux à iris droitsFine Science Tools14058-11
saccharoseFisher ScientificBP220-1
Tris-baseFisher BioreagentsBP152-5
Triton X-100Fisher BioreagentsBP151-500
Trypsine-EDTA Gibco15400-054
XylazineAkornNDC : 59399-111-50
ÉQUIPEMENT
Zeiss AxioObserver Microscope à cellules vivantes ZeissZeiss AxioObserver
0,45 mmfraise IDEAL MicroDrill67-1000
BD FACScalibur
centrifugeuse
homogénéisateurde verre
incubateur de culture cellulaireThermo Scientific HERACELL VIOS 160i13-998-213
Leica 3050S cryostat
plate-forme
thermocycleur
minuterie
ultracentrifugeBeckman Coulter Optima L-100 XP
Bain-marie (37 º ; C)Fisher Scientific Isotemp 2239
chèvre 1343517" scalpel Fisher Scientific P330-500 peu profond en verre ou en plastique standard de recherchestéréotaxique

Références

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  9. Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation. Curren Biology. 26 (10), 1383(2016).
  10. Ridings-Figueroa, R., et al. The nuclear matrix protein CIZ1 facilitates localization of Xist RNA to the inactive X-chromosome territory. Genes and Development. 31 (9), 876-888 (2017).
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  17. Borensztein, M., et al. Xist-dependent imprinted X inactivation and the early developmental consequences of its failure. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (3), 226-233 (2017).
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  19. Cseke, L. J., Talley, S. M. A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).

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Mots-clés

Inactivation du chromosome Xr activation de Mecp2injection st r otaxiqueinhibiteurs de XCIFtraitement du tissu c r bralmarquage par immunofluorescenceanalyse par cytom trie en fluxMecp2 marqu la GFP

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