Article de méthode

Améliorer l'engraftment des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l'homme par l'intermédiaire d'une inhibition transitoire de l'activité de Rho Kinase

DOI :

10.3791/59452

⸱

10 juillet 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, School of Engineering, University of Alabama at Birmingham, 2Division of Cardiovascular Diseases, School of Medicine, School of Engineering, University of Alabama at Birmingham, 3Department of Cardiac Surgery, The Second Xiangya Hospital of Central South University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans ce protocole, nous démontrons et élaborons sur la façon d'utiliser les cellules souches pluripotentes induites par l'homme pour la différenciation et la purification des cardiomyocytes, et en outre, sur la façon d'améliorer son efficacité de transplantation avec l'inhibiteur de kinase de protéine Rho-associé prétraitement dans un modèle d'infarctus du myocarde de souris.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un facteur crucial dans l'amélioration de l'efficacité de la thérapie cellulaire pour la régénération myocardique est d'augmenter en toute sécurité et efficacement le taux d'engraftment cellulaire. Y-27632 est un inhibiteur très puissant de la kinase de protéine rho-associée, enroulée-contenante de cire (RhoA/ROCK) et est employé pour empêcher l'apoptose de cellules dissociation-induite (anoikis). Nous démontrons que le prétraitement de Y-27632 pour les cardiomyocytes pluripotents induits par l'homme de cellules souches (hiPSC-CMs'RI)avant l'implantation a comme conséquence une amélioration de taux d'engraftment de cellules dans un modèle de souris de l'infarctus aigu du myocarde (MI). Ici, nous décrivons une procédure complète de différenciation, de purification, et de prétraitement cellulaire de hiPSC-CMs avec Y-27632, aussi bien que la contraction cellulaire résultante, les mesures transitoires de calcium, et la transplantation dans les modèles de MI de souris. La méthode proposée fournit une méthode simple, sûre, efficace et peu coûteuse qui augmente considérablement le taux d'engraftment cellulaire. Cette méthode ne peut pas seulement être utilisée en conjonction avec d'autres méthodes pour améliorer davantage l'efficacité de la transplantation cellulaire, mais fournit également une base favorable pour l'étude des mécanismes d'autres maladies cardiaques.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les thérapies à base de cellules souches ont montré un potentiel considérable comme traitement pour les dommages cardiaques causés par MI1. L'utilisation de hiPSC différenciés fournit une source inépuisable de hiPSC-CMs2 et ouvre la porte au développement rapide de traitements révolutionnaires. Cependant, de nombreuses limitations à la traduction thérapeutique demeurent, y compris le défi du taux d'engraftment sévèrement bas des cellules implantées.

Dissociation des cellules avec trypsine initie anoikis3, qui n'est accélérée qu'une fois que ces cellules sont injectées dans des environnements difficiles comme le myocarde ischémique, où l'environnement hypoxique accélère le cours vers la mort cellulaire. Parmi les cellules restantes, une grande proportion est lavée du site d'implantation dans la circulation sanguine et répandue dans toute la périphérie. L'une des principales voies apoptotiques est la voie RhoA/ROCK4. Basé sur des recherches antérieures, la voie RhoA/ROCK régule l'organisation cytosquelettique actine5,6, qui est responsable du dysfonctionnement cellulaire7,8. L'inhibiteur ROCK Y-27632 est largement utilisé lors de la dissociation et de la passification somatiques et des cellules souches, pour augmenter l'adhérence cellulaire et réduire l'apoptose cellulaire9,10,11. Dans cette étude, Y-27632 est utilisé pour traiter les hiPSC-CMs avant la transplantation dans une tentative d'augmenter le taux d'engraftment cellulaire.

Plusieurs méthodes visant à améliorer le taux d'engraftment cellulaire, telles que le choc thermique et le revêtement de matrice de membrane de sous-sol12,ont été établies. Mis à part ces méthodes, la technologie génétique peut également favoriser la prolifération des cardiomyocytes13 ou inverser les cellules nonmyocardiques en cardiomyocytes14. Du point de vue de la bioingénierie, les cardiomyocytes sont ensepépins sur un échafaudage biomatériau pour améliorer l'efficacité de la transplantation15. Malheureusement, la majorité de ces méthodes sont compliquées et coûteuses. Au contraire, la méthode proposée ici est simple, rentable et efficace, et elle peut être utilisée comme traitement basal avant la transplantation, ainsi que dans la conjugaison avec d'autres technologies.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les procédures relatives aux animaux de cette étude ont été approuvées par le Comité institutionnel des soins et de l'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université de l'Alabama à Birmingham et étaient fondées sur les Lignes directrices sur les soins et l'utilisation des animaux des National Institutes of Health Laboratory (Publication des NIH No 85-23).

1. Préparation des plaques de la culture et des médias culturels

  1. Préparation moyenne
    1. Pour le milieu hiPSC, mélanger 400 ml de milieu basal pluripotent humain (hPSC) (Tableaudes matériaux 1) et 100 mL de supplément hPSC 5x; conserver le mélange à 4 oC.
    2. Pour le RPMI 1640/B27 moins l'insuline (RB-) moyen, mélanger 500 ml de RPMI 1640 et 10 ml de supplément B27 moins l'insuline.
    3. Pour le milieu RPMI 1640/B27 (RBMD), mélangez 500 ml de RPMI 1640, 10 ml de supplément B27 et 5 mL d'antibiotique pénicilline-streptomycine (pen-streptocoque).
    4. Pour le milieu de purification16, mélanger 500 mL de RPMI sans glucose 1640, 10 ml de supplément B27, 5 ml d'antibiotique pen-streptocoque, et 1 000 l de solution de sodium DL-lactate (à une concentration finale de 4 mM).
    5. Pour la solution neutralisante, mélanger 200 mL de RPMI 1640, 50 ml de sérum bovin fœtal (FBS), 2,5 mL d'antibiotique pen-streptocoque et 50 oL de Y-27632 (à une concentration finale de 10 M).
    6. Pour le milieu de congélation, mélanger 9 ml de FBS, 1 ml de sulfoxide de diméthyle (DMSO) et 10 l de Y-27632 (à une concentration finale de 10 M).
    7. Pour la solution de matrice extracellulaire (SME), décongeler concentré matrice extracellulaire (Tableau des matériaux 1) à 4 oC jusqu'à ce qu'il ait atteint un état liquide uniformément cohérente. Précool pipette pointes et tubes avant de faire des aliquots de matrice de 350 L chacun sur la glace, et de stocker les aliquots à -20 oC. Avant d'enrober les plaques, diluer un aliquot décongelé en 24 ml de milieu DMEM/F12 glacé (SME); maintenir le SME à 4 oC jusqu'à 2 semaines.
      REMARQUE: Effectuer toutes les étapes de revêtement sur la glace pour empêcher la solidification de la matrice de la membrane du sous-sol.
    8. Pour la solution de Tyrode, prenez 90 % du volume final requis d'eau de qualité de culture tissulaire, ajoutez la quantité appropriée des réactifs suivants et remuez jusqu'à dissolution. Ensuite, utilisez 1 N NaOH pour ajuster le pH à 7,4. Ajouter de l'eau supplémentaire à une concentration finale de 140 mmol/L de chlorure de sodium, 1 chlorure de magnésium mmol/L, 10 mmol/L HEPES, 5 mmol/L de chlorure de potassium, 10 mmol/L de glucose et 1,8 mmol/L de chlorure de calcium. Stériliser par filtration, à l'aide d'une membrane de 0,22 m.
  2. Revêtement de plaque de culture cellulaire
    1. Pour les plaques de culture hiPSC, appliquer 1 ml d'EMS sur chaque puits d'une plaque de 6 puits et incuber la plaque pendant au moins 1 h à 37 oC. Aspirez la solution DMEM/F12 avant d'ensemencer des cellules.
    2. Pour le revêtement de gélatine, dissoudre 0,2 g de poudre de gélatine dans l'eau de qualité de culture tissulaire pour faire une solution de 0,2 % (w/v). Stériliser en autoclactant à 121 oC, 15 psi pendant 30 min. Enrober chaque puits d'une assiette de 6 puits avec 2 ml de la solution et couver pendant 1 h à 37 oC. Avant de passer les cellules, aspirez la solution et laissez la plaque sécher pendant au moins 1 h à température ambiante à l'intérieur du capuchon de culture tissulaire.

2. entretien hiPSC et ddifférenciation cardiomyocyte

  1. Culture les hiPSCs dans le milieu hiPSC (voir l'étape 1.1.1) avec un changement quotidien de milieu jusqu'à ce que les cellules atteignent 80%-90% confluence par puits.
    REMARQUE: Pour des raisons d'entretien, les hiPSC sont généralement prêts pour le passage tous les 4 jours.
  2. Pour passer hiPSCs, aspirer le milieu et laver le puits 1x avec 1x phosphate tamponné saline (PBS). Ajouter 0,5 ml de solution de détachement de cellules souches (tableaudes matériaux 1) à chaque puits et incuber à 37 oC pendant 5 à 7 min.
    REMARQUE: Le temps d'incubation dépend de la densité des cellules et du taux de dissociation, qui peut être observé au microscope.
  3. Neutraliser la solution de détachement de cellules souches avec 1 ml de milieu hiPSC complété par 5 M Y-27632. Recueillir le mélange dans un tube centrifugeuse de 15 ml. Centrifuger le tube pendant 5 min à 200 x g, aspirer le supernatant sans déranger le granule cellulaire, puis, resuspendre les cellules dans 1 ml de milieu hiPSC contenant 5 M Y-27632.
  4. Ensemencez les hiPSC sur une nouvelle plaque de 6 puits recouverte de SME à un rapport entre 1:6 à 1:18. Changer le milieu à hiPSC milieu sans Y27632 après 24 h.
  5. Pour congeler les cellules, resuspendre les hiPSC dissociés dans un milieu de congélation à une concentration de 0,5 à 1 million/500 l, placer la suspension dans des cryovials et les conserver dans un congélateur de -80 oC. Transférer les flacons congelés à l'azote liquide après 24 h.
  6. Pour différencier, remplacez le milieu hiPSC par 2 ml de RB- milieu complété par 10 'M GSK-3' inhibiteur CHIR99021 (CHIR) à 80%-90% de la confluence cellulaire. Remplacer le milieu par 3 ml de RB- moyen après 24 h et couver pendant 48 h supplémentaires (jour 3).
  7. Le jour 3, changer le milieu à 3 ml de RB- milieu avec 10 M Wnt inhibiteur IWR1 pendant 48 h (jour 5), puis remplacer le milieu par 3 ml de RB- moyen et maintenir pendant 48 h (jour 7).
  8. Le jour 7, remplacer le milieu par 3 ml de rb moyen et changer le milieu tous les 3 jours à l'avenir. Le battement spontané des hiPSC-CMs devrait être observé entre les jours 7-10.

3. hiPSC-CMs Purification et prétraitement des petites molécules

REMARQUE: Des enzymes de dissociation cellulaire hautement purifiées et recombinantes (tableaudes matériaux 1) ont été utilisées pour dissocier les hiPSC-CM.

  1. Le jour 21 après la différenciation hiPSC-CM, aspirer le milieu et laver les cellules 1x avec PBS stérile. Incuber les cellules avec 0,5 ml d'enzymes de dissociation cellulaire par puits pendant 5 à 7 min à 37 oC. Pipette à plusieurs reprises la suspension de la cellule à l'aide d'une pipette de 1 ml afin de dissocier complètement les cellules.
  2. Après que les cellules soient dissociées, ajouter 1 ml de solution neutralisante à chaque puits, recueillir le mélange de cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 ml et centrifugeuse à 200 x g pendant 3 min. Jeter le supernatant et resuspendre les cellules dans la solution neutralisante.
  3. Replantez les cellules sur des plaques de 6 puits recouvertes de gélatine à une densité de 2 millions de cellules par puits.
  4. Après 24 à 48 h, remplacer le milieu de culture par un milieu de purification pendant 3 à 5 jours.
    REMARQUE: La purification est complète lorsque plus de 90 % des cellules de chaque champ de vision du microscope battent. Pour éviter d'autres dommages aux cardiomyocytes, ne prolongez pas la durée de purification au-delà de 5 jours. Si le premier tour ne donne pas la pureté nécessaire, remplacez le milieu de purification par un milieu RBMD pendant 1 jour, puis complétez un deuxième cycle de purification.
  5. Avant la transplantation, la culture des cellules dans le groupe de traitement pendant 12 h dans le milieu de RBmD complété avec 10 'M Y-27632. De la même façon, effectuez un traitement verapamil sur les cellules du milieu de la RBavec 1 m verapamil pendant 12 h (hiPSC-CM- VER).
  6. Après le traitement, laver le hiPSC-CMs 1x avec PBS et couver les cellules avec 0,5 ml d'enzymes de dissociation cellulaire par puits pendant un maximum de 2 min. À plusieurs reprises pipette la suspension cellulaire, à l'aide d'une pipette de 1 ml, pour dissocier soigneusement les cellules. Neutraliser les cellules avec une solution neutralisante, recueillir le mélange cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 ml, et centrifugeuse à 200 x g pendant 3 min. Resuspendre les cellules en PBS à une concentration de 0,1 million de cellules/5 l en préparation à l'injection.

4. Infarctus du myocarde et transplantation cellulaire

REMARQUE: Tous les instruments chirurgicaux sont presterilisés avec autoclave et sont maintenus dans un état aseptique pendant les chirurgies multiples par l'intermédiaire d'un stérilisateur chaud de perle (tableau des matériaux 2).

  1. Anesthésiez les souris NOD/scid(tableau des matériaux 2) avec l'isoflurane inhalé (1,5 % à 2 %). Surveillez les niveaux d'anesthésie par les réponses des souris à une pincée d'orteil. Placez l'onguent optique vétérinaire sur les yeux pour les empêcher de sécher pendant la chirurgie.
  2. Fournir 0,1 mg/kg de buprénorphine sous-cutanée pour la gestion de la douleur avant la chirurgie.
  3. Placez et fixez la souris en position de supine sur une table d'opération chauffée, retirez les cheveux de la région du cou ventral et du thorax gauche à l'aide d'une crème dépilatoire, exposez la peau et désinfectez-la avec 70 % d'alcool.
  4. Couper une incision de 0,5 cm au centre du cou à l'aide de ciseaux chirurgicaux, séparer la graisse sous-cutanée avec des forceps stériles, et exposer la trachée. Introduire oralement la canule d'intubation dans la trachée, connecter la canule à un petit ventilateur animal, et ajuster les paramètres de ventilation (régler le volume de marée à 100 à 150 l et le taux de respiration à 100x -150x par min).
  5. Après la stabilisation de la souris, couper une incision de 0,5 cm au milieu de la peau de la poitrine gauche. Utilisez des forceps pour séparer la couche musculaire et faire une petite incision dans le cinquième espace intercostal pour exposer la cavité thoracique. Placez le rétracteur dans l'incision pour ouvrir la cavité thoracique et localiser l'artère coronaire descendante gauche (LAD). Sous un microscope chirurgical disséquant, ligate le LAD avec un 8-0 suture non absorbable.
  6. Immédiatement après l'induction de l'IM, injectez 5 ll de hiPSC-CM-RI, hiPSC-Cms'RI, hiPSC-CMs-VER, hiPSC-CMs'VER, ou un volume égal de PBS dans le myocarde de la souris à chaque site (3 x 105 cellules/animal, 1 x 105 cellules/site), une dans la zone infarctus et deux dans les zones autour de l'infarctus.
    REMARQUE: Étant donné que 5 L est un volume très faible, il n'est pas facile de contrôler avec précision le volume en le suçant directement avec une seringue. Le couvercle d'un plat stérile Petri peut être retourné, et 5 l des cellules peuvent d'abord être déposés sur le couvercle avec une pipette. En raison de la tension de surface, il ne se propagera pas mais se condensera en une petite masse liquide. Cela peut être facilement absorbé et injecté dans le myocarde de la souris.
  7. Éliminez l'air résiduel dans la cavité thoracique en le remplissant d'une solution saline isotonique chaude. Coudre les côtes, les muscles et la peau dans l'ordre avec une suture absorbable 6-0. Éteignez l'injection d'anesthésie isoflurane. Gardez les animaux de chirurgie sur le coussin chauffant et observez-les de près pendant qu'ils reprennent conscience. Ensuite, placez les animaux dans une cage propre. Ne remettez pas les animaux en compagnie d'autres animaux jusqu'à ce qu'ils soient complètement récupérés.
  8. Après la chirurgie, injecter aux souris par voie intrapéritone de buprénorphine (0,1 mg/kg) tous les 12 h pendant 3 jours consécutifs et leur injecter de l'ibuprofène (5 mg/kg) tous les 12 h pendant une journée. Effectuer des études d'analyse ultérieures à des moments précis.
    REMARQUE: Suivez les directives de votre comité local de soins aux animaux pour l'analgésie.

5. Enregistrement de la passagère et de la contractilité du calcium

  1. Plaquedh de 15 mm de diamètre (Tableaudes matériaux 2) et pinceà d'œil dans un petit bécher en verre à 121 oC, 15 psi pendant 15 min. Prérefroidir les couvercles et les pinces à 4 oC.
  2. À l'aide de la pince à épiler, placez le bordereau de couverture dans une plaque de 12 puits et une pipette de 300 l de matrice extracellulaire sur chaque bordereau.
    REMARQUE: Ne laissez pas la matrice dépasser le bord de la glissière de couverture pour éviter de réduire la quantité de revêtement de matrice. Incuber la plaque de 12 puits dans un incubateur de culture cellulaire de 37 oC pendant 1 h.
  3. Aspirez le milieu dans la plaque de 6 puits recouverte de gélatine avec hiPSC-CM purifiés, lavez-le 1x avec du PBS, puis digérez-le avec 0,5 ml d'enzymes de dissociation cellulaire pendant 1,5 min. Ajouter 1 ml de solution neutralisante, pipette à plusieurs reprises pour pas plus de 5x-10x avec une pipette de 1 ml avec une pipette de 1 ml avec une pipette de 1 ml avec une pipette de 1 ml , et centrifuger le mélange à 200 x g pendant 3 min.
  4. Aspirez la matrice extracellulaire enduite des couvertures. Comptez le numéro de cellule et resuspendez les cellules dans la solution neutralisante à une concentration de 40 000/300 l, puis ajoutez 300 L de la suspension cellulaire sur chaque bordereau. Culture de l'assiette dans un incubateur de 37 oC.
  5. Après 24 h, aspirez doucement la solution neutralisée, ajoutez 500 l de moyenne de RB à chaque puits de la plaque, et continuez à la culture pendant 2 jours.
  6. Ajouter Y-27632 (10 M), Rho kinase activateur (RA, 100 nM), verapamil (1 M), ou un volume égal de PBS dans le milieu de culture de hiPSC-CMs, 12 h avant la détection de la passation de calcium et de la contractilité.
    REMARQUE: En plus de la détection du taux de calcium transitoire et de la contractilité des cellules après 12 h de traitement chimique, la détection de ces paramètres a également été testée à 12, 24, 48 et 72 h après retrait chimique.
  7. Sortir l'assiette, jeter le milieu et laver la plaque 1x avec du PBS. Changer le milieu à un DMEM sans phénol contenant 0,02 % (w/v) de polyol surfactant (Tableau des matériaux 1), indicateur de calcium de 5 M ( Tableau desmatériaux 1), et le Y-27632 correspondant (10 M), RA (100 nM), verapamil (1 M), ou un volume égal PBS, et incuber la plaque pendant 30 min à 37 oC.
  8. Jeter le supernatant, laver les cellules 3x avec un milieu DMEM sans colorant, et laisser reposer le milieu pendant 30 min pour désestersifier le colorant cartographique.
  9. Placez la plaque de couverture ensemiée de cellules dans une chambre de bain ouverte et insérez la chambre dans un système de microincubation à 37 oC avec un contrôleur automatique de température (Tableau des matériaux 2), perférez-le avec la solution de Tyrode, et ajoutez continuellement Inhibiteur de kinase de Rho (RI), RA, ou PBS à la solution de perfusion.
  10. Utilisez un microscope à fluorescence inversée (Tableau des matériaux 2) et une tête de balayage laser ( Tableau desmatériaux 2) pour enregistrer le calcium spontané transitoire en utilisant un balayage de ligne x-t, en utilisant un laser argon 488 nm pour l'excitation de teinture et un 515 - 10 nm filtre de barrière pour recueillir la lumière d'émission. Enregistrez la contraction spontanée des hiPSC-CM s'appuyant sur la fonctionnalité contrastant différentiel d'interférence du microscope confocal (Tableaudes matériaux 2).
    REMARQUE: Les enregistrements transitoires de calcium ont été traités et analysés à l'aide du logiciel MATLAB R2016A (Tableau des matériaux 4). Les essais de changement de contraction cellulaire ont été effectués à l'aide du logiciel ImageJ (Tableau des matériaux 4).

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Résultats

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Les hiPSC-CMs utilisés dans cette étude ont été dérivés de l'origine humaine avec le gène de journaliste de luciferase ; par conséquent, le taux de survie des cellules transplantées in vivo a été détecté par imagerie par bioluminescence (BLI)17 (figure 1A, B). Pour les sections cardiaques histologiques, les cellules à double positif de la troponine cardiaque spécifique à l'homme (HcTnT) et de l'antigène nucléaire humai...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les principales étapes de cette étude comprennent l'obtention de l'hiPSC-MC pur, l'amélioration de l'activité des hiPSC-MC par le prétraitement Y-27632, et enfin, la transplantation d'une quantité précise de hiPSC-MC dans un modèle MI souris.

Les principaux problèmes abordés ici étaient que, d'abord, nous avons optimisé les méthodes de purification sans glucose19 et mis en place un nouveau système de purification efficace. La procédure du système comprenait l'applicatio...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient le Dr Joseph C. Wu (Université Stanford) d'avoir aimablement fourni la construction Fluc-GFP et le Dr Yanwen Liu pour l'excellente assistance technique. Cette étude est soutenue par les subventions RO1 des National Institutes of Health HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (à J.Z.), et HL121206A1 (à L.Z.), et une subvention R56 HL142627 (à W.Z.), une subvention de développement scientifique de l'American Heart Association 16SDG30410018, et l'Université de l'Alabama à Birmingham Faculty Development Grant (à W.Z.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
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Accutase (solution de décollement de cellules souches)STEMCELL Technologies#07920
B27 moins insulineFisher ScientificA1895601
supplément B27Fisher Scientific17-504-044
CHIR99021Stem Cell Technologies72054
DMEM (1x), taux élevé de glucose, HEPES, sans rouge de phénolThermofisher20163029
Sérum fœtal bovinAtlanta BiologicalsS11150
Fluo-4 AM (indicateur de calcium)Invitrogen/ThermofisherF14201
RPMI sans glucose 1640Fisher Scientific11879020
IWR1Stem Cell Technologies72562
Matrigel (matrice extracellulaire)Fisher ScientificCB-40230C
mTeSR (milieu de cellules souches pluripotentes humaines)STEMCELL Technologies85850
Antibiotique Pen-streptocoqueFisher Scientific15-140-122
Pluronic F-127 (polyol tensioactif)Sigma-AldrichP2443
Rho activator IICytosqueletteCN03
RPMI1640Fisher Scientific11875119
DL-lactate de sodiumSigma-AldrichL4263
TrypLE (enzymes de dissociation cellulaire)Fisher Scientific12-605-010
VerapamilSigma-AldrichV4629
Y-27632STEMCELL Technologies72304
Nom<strong>EntrepriseNuméro de catalogueComments
Equipment and Supplies
IVIS Lumina III Bioluminescence InstrumentsPerkinElmerCLS136334
15 mm CoverslipsWarnerCS-15R15
CentrifugeuseEppendorf5415R
Microscope confocalOlympusIX81
CryostatThermo ScientificNX50
Dual Automatic Temperature ControllerWarner InstrumentsTC-344B
Électrophorèse AlimentationBIO-RAD1645050
Microscope à fluorescenceOlympusIX83
Caméra haute vitessepco1200 s
Tête de balayage laserOlympusFV-1000
Profile Open Bath Chamber (se monte dans le système de micro-incubation ci-dessus)Warner InstrumentsRC-42LP
Microincubation SystemWarner InstrumentsDH-40iL
Minivent Mouse VentilatorHarvard Apparatus845
souris NOD/SCIDJackson Laboratory001303
Gels de protéines préfabriquéesBIO-RAD4561033
PVDF Système1704156
Trans-Blot BIO-RADStérilisateur
billes chaudes FineScienceTools 18000-45
Nom EntrepriseNuméro de catalogueComments
Antibody
Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647)Abcamab198580
Cardiac Troponin T R& D SystemsMAB1874
Troponine cardiaque CAbcamab137130
Troponine cardiaque IAbcamab47003
Cy5-âne anti-sourisJackson ImmunoResearch Laboratory715-175-150
Cy3-âne anti-lapinJackson ImmunoResearch Laboratory711-165-152
Fitc-âne anti-sourisJackson Laboratoire d’immunorecherche715-095-150
GAPDHAbcamab22555
Troponine cardiaque humaine TAbcamab91605
Intégrine &bêta ; 1Abcamab24693
Ki67EMD Milliporeab9260
N-cadhérineAbcamab18203
Chaîne légère phospho-myosine 2Technologie de signalisation cellulaire3671s
NomEntrepriseNuméro de catalogueComments
Software
MatlabMathWorksR2016A
ImageJNIH1.52g
Low Packs de transfert à

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
  2. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  3. Frisch, S. M., Francis, H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).
  4. Haun, F., et al. Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin. Nature Communications. 9 (1), 3524(2018).
  5. Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
  6. Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions. Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).
  7. Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
  8. Legate, K. R., Fassler, R. Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails. Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).
  9. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  10. Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5 (8), e12148(2010).
  11. Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties. Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).
  12. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
  13. Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle. Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).
  14. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  15. Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
  16. Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
  17. Ong, S. G., et al. Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction. Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).
  18. Zhao, M., et al. Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice. Cardiovascular Research. , (2018).
  19. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  20. Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells. Cell Death & Disease. 5, e1012(2014).
  21. Lelievre, E. C., et al. N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation. PLoS One. 7 (3), e33206(2012).
  22. Murata, K., et al. Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells. Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).
  23. Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).

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Inhibition de la Rho kinasepr traitement au Y 27632taux de prise de greffe cellulairemod le d infarctus du myocardeenzymes de dissociation cellulairemesures des transitoires calciquesmicroscopie confocaleanalyse par Western blotdosage de l activit lucif rase

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