Une description colorimétrique de l'activité de Synthase Citrate dans Drosophila Melanogaster

Ping Wei; Qihong Liu; Wen Xue; Jiwu Wang

doi:10.3791/59454

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Article de méthode

Une description colorimétrique de l'activité de Synthase Citrate dans Drosophila Melanogaster

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DOI :

10.3791/59454

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16 janvier 2020

Ping Wei^*¹ , Qihong Liu^*² , Wen Xue² , Jiwu Wang²

¹Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People's Hospital, ²Department of Anatomy of Physiology, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole pour un test colorimétrique de l'activité de synthase de citrate pour la quantification de la masse mitochondriale intacte dans les homogénéités de tissu de Drosophila.

Résumé

Les mitochondries jouent les rôles les plus importants dans le métabolisme cellulaire en produisant de l'ATP par phosphorylation oxydative et en régulant une variété de processus physiologiques. Le dysfonctionnement mitochondrial est une cause primaire d'un certain nombre de maladies métaboliques et neurodégénératives. Les mitochondries intactes sont essentielles à leur bon fonctionnement. La synthase de citrate d'enzyme est localisée dans la matrice mitochondriale et peut ainsi être employée comme marqueur quantitatif d'enzyme de la masse mitochondriale intacte. Étant donné que de nombreuses molécules et voies qui ont des fonctions importantes dans les mitochondries sont fortement conservés entre les humains et Drosophila, et qu'un éventail d'outils génétiques puissants sont disponibles dans Drosophila, Drosophila sert de bon système modèle pour l'étude de la fonction mitochondriale. Ici, nous présentons un protocole pour la mesure rapide et simple de l'activité de synthase de citrate dans l'homogénéisation de tissu des mouches adultes sans isoler des mitochondries. Ce protocole convient également à la mesure de l'activité de synthase de citrate dans les larves, les cellules cultivées et les tissus mammifères.

Introduction

Les mitochondries sont surtout connues comme les organites producteurs d'énergie dans la plupart des organismes eucaryotes, qui produisent la monnaie de l'énergie, l'ATP, à travers le cycle de l'acide tricarboxylique (c.-à-d. le cycle Debs) et la phosphorylation oxydative. Les mitochondries jouent également un rôle important dans un grand nombre d'autres processus physiologiques, tels que la régulation de l'apoptose¹, Ca^{2 '} homéostasie²^,³, espèces d'oxydation réactive (ROS) génération⁴, et réticulum endoplasmique (ER)-réponse au stress⁵. Le dysfonctionnement mitochondrial peut affecter n'importe quel organe dans le corps à n'importe quel âge et est une cause primaire des maladies métaboliques, liées au vieillissement^6,et neurodegenerative^7. Les mitochondries intactes sont mécanistes liées à la fonction mitochondriale. Ainsi, la quantification appropriée de la masse mitochondriale intacte est très importante pour évaluer la fonction mitochondriale^8. La synthase de citrate, une enzyme de limitation de taux dans la première étape du cycle d'acide tricarboxylique^9,est localisée dans la matrice mitochondriale dans les cellules eucaryotes, et peut ainsi être employée comme marqueur quantitatif pour la présence de la masse mitochondriale intacte⁹^,¹⁰. L'activité de synthase de citrate peut également être employée comme facteur de normalisation pour les protéines mitochondriales intactes¹¹^,¹².

La mouche des fruits, Drosophila melanogaster, est un excellent système modèle pour l'étude de la fonction mitochondriale, comme de nombreuses molécules et les voies qui jouent des rôles pivots dans les mitochondries sont évolutivement conservés de Drosophila à l'homme¹³^,¹⁴^,¹⁵. Ici, nous présentons un protocole pour une méthode rapide et simple pour la mesure de l'activité de synthase de citrate par un test colorimétrique dans le tissu de Drosophila homogénéise¹⁶ dans un format de plaque de puits 96. Dans l'analyse de l'activité de synthase de citrate, la synthase de citrate dans le tissu de Drosophila homogénéise catalyse la réaction de l'oxaloacetate avec la coenzyme acétyle A (acétyl CoA) pour former le citrate CoA-SH et^H. CoA-SH réagit par la suite avec 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) pour générer un produit coloré, 2-nitro-5-thiobenzoate (TNB), qui peut être facilement mesuré spectrophotometrically à 412 nm. L'activité de synthase de citrate peut être reflétée par le taux de production de couleur.