Nous présentons un protocole pour un test colorimétrique de l'activité de synthase de citrate pour la quantification de la masse mitochondriale intacte dans les homogénéités de tissu de Drosophila.
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Article de méthode
Une description colorimétrique de l'activité de Synthase Citrate dans Drosophila Melanogaster
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les mitochondries jouent les rôles les plus importants dans le métabolisme cellulaire en produisant de l'ATP par phosphorylation oxydative et en régulant une variété de processus physiologiques. Le dysfonctionnement mitochondrial est une cause primaire d'un certain nombre de maladies métaboliques et neurodégénératives. Les mitochondries intactes sont essentielles à leur bon fonctionnement. La synthase de citrate d'enzyme est localisée dans la matrice mitochondriale et peut ainsi être employée comme marqueur quantitatif d'enzyme de la masse mitochondriale intacte. Étant donné que de nombreuses molécules et voies qui ont des fonctions importantes dans les mitochondries sont fortement conservés entre les humains et Drosophila, et qu'un éventail d'outils génétiques puissants sont disponibles dans Drosophila, Drosophila sert de bon système modèle pour l'étude de la fonction mitochondriale. Ici, nous présentons un protocole pour la mesure rapide et simple de l'activité de synthase de citrate dans l'homogénéisation de tissu des mouches adultes sans isoler des mitochondries. Ce protocole convient également à la mesure de l'activité de synthase de citrate dans les larves, les cellules cultivées et les tissus mammifères.
Introduction
Les mitochondries sont surtout connues comme les organites producteurs d'énergie dans la plupart des organismes eucaryotes, qui produisent la monnaie de l'énergie, l'ATP, à travers le cycle de l'acide tricarboxylique (c.-à-d. le cycle Debs) et la phosphorylation oxydative. Les mitochondries jouent également un rôle important dans un grand nombre d'autres processus physiologiques, tels que la régulation de l'apoptose1, Ca2 ' homéostasie2,3, espèces d'oxydation réactive (ROS) génération4, et réticulum endoplasmique (ER)-réponse au stress
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Protocole
1. Colorimétrique Citrate Synthase Activity Assay pour D. melanogaster16
- Recueillir dix mouches adultes pour chaque échantillon. Recueillir au moins des échantillons tripler pour chaque génotype.
- Préparer 500 l de tampon d'extraction à froid contenant 20 mM HEPES (pH à 7,2), 1 mM EDTA et 0,1 % de triton X-100 dans un tube à essai de 1,5 mL pour chaque échantillon.
- Anesthésier les mouches adultes avec du CO2 sur un coussin et isoler les tissus désirés. Pour isoler les thoraxes mouche adultes, par exemple, fixer les thoraxes mouche par une paire de forceps, puis isoler les abdomens de mouche en co....
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Résultats
La figure 1 présente un exemple des courbes cinétiques de l'absorption de l'OD à 412 nm au fil du temps obtenue s'appuyant sur l'analyse colorimétrique de l'activité de synthase de citrate pour mesurer les homogénéités du tissu thorax Drosophila de différents génotypes. Il est bien connu que PGC-1 est un régulateur principal de la biogenèse mitochondriale. PgC-1 est fonctionnellement conservé entre la drosophile et l'homme. Drosophile
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Discussion
Les études métaboliques utilisant Drosophila comme modèle doivent prendre en considération le fond génétique, l'alimentation, et l'entretien de stock des mouches18. Afin d'éviter les effets de différents milieux génétiques sur la mesure de l'activité de la synthase du citrate, différentes souches de Drosophila doivent être rétrocroisées à la souche témoin pendant 10 générations. Le fond génétique de toutes les souches de Drosophila utilisées dans nos expériences est .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par les subventions de la National Natural Science Foundation of China (31401013 et 31471010), de la Science and Technology Commission of Shanghai Municipality, du Shanghai Pujiang Program (14PJ1405900) et de la Natural Science Foundation of Shanghai (19ZR1446400).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Acide 2-[4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinyl]éthanesulfonique (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxyméthyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acétyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Acide dithio-bis-nitrobenzoïque (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacétate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pilon à granulés | Sangon | F619072 | |
| Moteur pilon à granulés | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Lecteur de plaques | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Kit de dosage | Beyotime | P0010S | |
| Ciseaux | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
Références
- Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans. Cell. 157 (4), 897-909 (2014).
- Sarasija, S., Norman, K. R.
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Réimpressions et autorisations
