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Article de méthode

Génération rapide de cultures de murine primaire et de fibroblaste

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DOI :

10.3791/59468

⸱

26 juin 2019

 ,  , 
1Department of Cancer Biology and Genetics, The Ohio State University, 2Department of Molecular Genetics, The Ohio State University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode rapide pour générer simultanément des cultures de mlanocytes et de fibroblastes à partir de la peau de souris de 0 à 4 jours. Ces cultures primaires peuvent être maintenues et manipulées in vitro pour étudier une variété de processus physiologiquement pertinents, y compris la biologie des cellules de la peau, la pigmentation, la cicatrisation des plaies et le mélanome.

Résumé

Les défauts dans la fonction de fibroblaste ou de maulanocyte sont associés aux maladies de peau, y compris la fonction pauvre de barrière, la guérison défectueuse de blessure, les défauts de pigmentation et le cancer. Des expériences dans les cultures primaires de fibroblaste et de mélinocytes sont essentielles à la compréhension et à l'amélioration de ces maladies. Néanmoins, les protocoles actuels pour l'isolement de mlanocyte exigent que les couches épidermiques et cutanées de la peau soient trypsinisées et manuellement dissociées. Ce processus prend du temps, est techniquement difficile et contribue à des rendements incohérents. En outre, les méthodes pour générer simultanément des cultures pures de fibroblaste à partir du même échantillon de tissu ne sont pas facilement disponibles. Ici, nous décrivons un protocole amélioré pour isoler des mlanocytes et des fibroblastes de la peau des souris les jours postnatals 0-4. Dans ce protocole, la peau entière est mécaniquement homogénéisée à l'aide d'un hachoir à tissu, puis brièvement digérée avec de la collagène et de la trypsine. Les populations cellulaires sont ensuite isolées par placage sélectif suivi du traitement G418. Cette procédure entraîne des rendements cohérents de mlanocyte et de fibroblaste d'une souris simple en moins de 90 min. Ce protocole est également facilement évolutif, permettant aux chercheurs de traiter de grandes cohortes d'animaux sans une augmentation significative du temps pratique. Nous montrons à travers des évaluations cytométriques de flux que les cultures établies à l'aide de ce protocole sont fortement enrichies pour les mlanocytes ou les fibroblastes.

Introduction

La peau des mammifères est un organe multicouches qui protège le corps contre les agents pathogènes étrangers et l'irradiation ultra-violette (UVR). La peau joue également un rôle critique dans les processus homéostatiques tels que la cicatrisation des plaies, la régulation de la température et la production de vitamine D1,2,3. La peau des mammifères se compose de trois principaux types de cellules : les mlanocytes, les fibroblastes et les kératinocytes. Ces types de cellules peuplent différentes couches de la peau, avec des kératinocytes constituant l'épiderme, des fibroblastes résidant dans le derme et les mlanocytes se localisant à la jonction épidermique-dermique et les follicules pileux4. Ici, nous détaillons une procédure simple qui permet la génération simultanée des cultures primaires de maulanocyte et de fibroblaste de peau murine.

Les mlanocytes sont des cellules productrices de pigments que l'on trouve dans de nombreux endroits du corps humain, y compris l'épiderme basal, l'iris, la cochlée, le cerveau et les follicules pileux5. La fonction principale des mélonocytes est de générer et de sécréter des vésicules contenant de la mélanine appelées mélanosomes5,6. Les mélanosomes contiennent deux grandes classes de mélanine : l'eumélanine brune/noire et la phéomélanine jaune/rouge6,7. Les processus biochimiques dans le mlanocyte régulent l'abondance relative de chaque espèce de mélanine et aident à déterminer la couleur des cheveux, de la peau et des yeux8,9. La mélanine sert également à absorber les rayons UV et à protéger les tissus exposés au soleil de la mutagénèse10.

Le dysfonctionnement de mlanocyte peut causer des défauts pigmentaires et augmenter la susceptibilité de cancer de peau. Par exemple, les taches hyper-pigmentées de peau caractéristiques du mélasma sont le résultat de la surproduction focale de mélanine, alors que les mutations génétiques germinales qui compromettent des gènes impliqués dans la synthèse de mélanine mènent à l'albinisme11,12 . Une connaissance intime de la biologie des mlanocytes est nécessaire pour élaborer des stratégies qui corrigeront ces défauts pigmentaires et, en fin de compte, amélioreront le bien-être psychosocial des personnes atteintes de ces maladies. Les déficits dans la production de mélanine et/ou la synthèse préférentielle de la phéomélanine sont également associés au risque accru de cancer de la peau10. On pense que ce risque résulte d'une protection réduite contre les rayons UV6,13. Ainsi, les méthodes pour améliorer ou restaurer la production d'eumélanine dans les mlanocytes peuvent réduire l'incidence du cancer de la peau dans ces populations.

Les fibroblastes mésenchymales établissent le tissu conjonctif et le soutien structurel pour tous les organes du corps, y compris la couche cutanée de la peau14. L'excrétion de protéines telles que le collagène, l'élastine, la lamininine et la fibronectine permettent aux fibroblastes de former la matrice extracellulaire (ECM) qui est essentielle à l'intégrité des tissus1,14. Les fibroblastes jouent également un rôle essentiel dans des processus tels que la cicatrisation des plaies, l'inflammation, l'angiogenèse et la formation/progression du cancer1,15,16.

Semblable aux mlanocytes, les défauts dans l'activation et la fonction de fibroblaste peuvent favoriser la tumorigenesis et la maladie. Par exemple, l'activation inappropriée de fibroblaste mène généralement à la formation de la fibrose, résultant du dépôt accru des composants excédentaires d'ECM dans le tissu environnant. Comme les fibroblastes maintiennent une grande partie de l'intégrité structurelle du corps, la fibrose favorise les maladies qui affectent de nombreux tissus et organes, y compris la fibrose pulmonaire idiopathique, la sclérose systémique, la cirrhose du foie et la fibrose cardiaque15. Les fibroblastes jouent également un rôle essentiel dans le cancer16. Les fibroblastes associés au cancer (CAF) sont les cellules non malignes les plus abondantes dans le microenvironnement de nombreuses tumeurs. Il a été démontré que les FCA favorisent la prolifération, la progression et la résistance thérapeutique des tumeurs en modulant la rigidité des tissus, la production locale de cytokine et la fonction immunitaire16.

Les cultures cellulaires primaires fournissent aux chercheurs des modèles génétiquement traitables pour identifier et atténuer les défauts de mlanocyte et de fibroblaste qui mènent à la maladie. Cependant, les méthodes actuelles pour établir les cultures de mlanocytes sont longues et techniquement provocantes. Le besoin de trypsinisation et de séparation délicate de l'épiderme et du derme contribue à la variabilité du rendement expérimental et rend difficile l'exécution d'expériences à grande échelle. En outre, les protocoles pour isoler simultanément les mlanocytes et les fibroblastes de la peau entière font actuellement défaut dans le domaine.

Nous avons mis au point une méthode pour réduire les étapes de traitement, la variabilité et le temps requis pour établir les cultures de mlanocytes et de fibroblastes à partir du même échantillon de peau entier. À l'aide d'une méthode d'homogénéisation mécanique suivie d'une brève digestion, notre stratégie diminue considérablement le temps pratique nécessaire pour isoler les mlanocytes primaires tout en permettant l'isolement simultané du fibroblaste. La vitesse, l'efficacité et la cohérence accrues de ce protocole, combinées à la capacité d'isoler les mlanocytes des souris de 0 à 4 jours, offrent aux chercheurs la flexibilité nécessaire pour effectuer un plus large éventail d'expériences qu'auparavant.

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Protocole

Obtenez l'approbation de votre comité d'éthique animale institutionnel avant de commencer cette étude ou toute autre étude impliquant des animaux. Les expériences effectuées dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC, protocole #2012A00000134) de l'Université d'État de l'Ohio.

1. Préparation du protocole

REMARQUE: Les instructions de préparation de réactifs suivantes sont appropriées pour la génération de 9 cm2 cultures de milocytes et de fibroblastes à partir d'une seule souris. Consultez le guide de préparation du réactif du tableau 1 pour les isolements à plus grande échelle.

  1. Préparer 1,5 ml de solution de collagène contenant 50 g/mL de collagène dans de l'acide acétique glaciaire de 0,1 M.
  2. Dans une armoire à débit laminaire, enrober un puits d'un plat de culture cellulaire de 6 puits avec une solution de collagène de 8 g/cm2 (1,44 ml). Assurez-vous que le puits est entièrement couvert par la solution de collagène. Incuber le plat à 37 oC pendant 3 h ou à 4 oC toute la nuit. Avant d'utiliser, lavez le bien enrobé de collagène deux fois avec 1,35 ml de phosphate stérile tamponné salin (PBS) (150 OL de PBS par 1 cm2).
  3. Assembler l'hélico de tissu dans une armoire à débit laminaire en plaçant soigneusement un disque de hachage sur la plate-forme d'hélico de tissu et en fixant une lame stérile au bras mobile.
  4. Préparer 3 mL de 1x Solution antibiotique/antimycotique en diluant 100x antibiotique / solution de stock antimycotique dans le PBS stérile.
  5. Préparer 3 mL de tampon frais de digestion de la peau contenant 10% de sérum bovin foetal, 1% de pénicilline/streptomycine solution, 1% L-glutamine, 10 mg/mL de collagène de type I, 0,25% de trypsine porcine et 0,02 mg/mL deoxyribonuclease I dans RPMI 1640.
  6. Préparer 6 mL de Mélanocyte frais Media contenant 10% de sérum bovin fœtal, 7% sérum de cheval, 1% de pénicilline/streptomycine solution, 1% L-glutamine, 0.5 mM di-butyryl cyclic AMP (dbcAMP), 20 nM tetradecanoylphorbol 13-acétate (TPA) et 200 pM de toxine de choléra (CT) en toxine de choléra (CT) Nutrient Mix F-12 Ham's media.
    REMARQUE: Des solutions de stock dbcAMP, TPA et CT concentrées peuvent être faites, aliquoted et stockées pour 'gt;1 année à -80 'C. Les supports de base dépourvus de ces composants peuvent être stockés jusqu'à 1 mois à 4 oC.
  7. Préparer 4 mL de fibroblaste Media contenant 10 % de sérum bovin fœtal, 1 % de pénicilline/streptomycine et 1 % de L-glutamine dans le milieu aigle modifié de Dulbecco. Ce support peut être stocké à 4 oC jusqu'à 1 mois.
  8. Préparer 40 ml de solution de paraformaldéhyde de 4 % en diluant 16 % de paraformaldéhyde dans le PBS. Conserver tout excédent à 4 oC pendant 1 mois ou à -20 oC jusqu'à 1 an.
  9. Préparer une solution de 1 % de stock de saponine en mélangeant 0,5 g de saponine dans 50 ml de PBS à 37 oC jusqu'à ce que la saponine soit complètement dissoute. Stérilisez la solution pour le stockage à long terme à l'aide d'une seringue de 50 ml équipée d'un filtre PES de 0,2 m. La solution de stock de saponine qui en résulte peut être maintenue à 4 oC pendant 1 mois.
  10. Préparer 200 l de 0,1 % de solution de saponine par souris en diluant une solution de 1 % de stock de saponine dans pbS contenant 3 % d'albumine bovine (BSA).
  11. Préparer 1 ml de solution de viabilité en diluant 1 ll de colorant de viabilité réparable dans 1 ml de PBS.

2. Isolement du ménocyte et du fibroblaste

  1. Euthanasiez les chiots C57Bl/6J mâles et/ou femelles de 0 à 4 jours par décapitation et enlevez les extrémités des souris euthanasiées à l'aide de ciseaux chirurgicaux.
  2. Dans une armoire à débit laminaire, rouler brièvement le tronc de chaque souris dans un plat stérile Petri contenant 70% d'éthanol. Retirer le tronc de l'éthanol et le placer dans un plat Petri vide et stérile.
  3. À l'aide de ciseaux chirurgicaux, stérilisés à 70 % d'éthanol, faire une incision dans la peau sur le côté ventral du tronc à partir du cou à la queue. Peler la peau du tronc de la souris à l'aide de forceps stériles.
  4. Placer le côté derme de la peau vers le bas dans un plat de 6 puits contenant 3 ml de 1x Antibiotique / Solution antimycotique et incuber à température ambiante pendant 2-3 min.
  5. Allumez l'hélico de tissu avec les réglages suivants en place : Épaisseur de tranche : 1 m ; Force de lame : 60 % du maximum ; Vitesse : 50 % du maximum.
  6. Transférer la peau, côté derme vers le bas, sur un disque d'hélico tissu l'insterile et passer la peau complètement à travers l'hélico de tissu activé 3 fois.
  7. Transférer la peau homogénéisée dans un tube conique stérile de 15 ml contenant 3 ml de tampon de digestion de la peau. Mélanger la suspension résultante en pipetting de haut en bas 10-15 fois avec une micropipette P1000.
  8. Encapors le tube conique et incuber l'échantillon dans un bain d'eau de 37 oC pendant 15 min, en inversant le tube toutes les 3-5 minutes.
  9. Pelleter les cellules de la peau homogénéisent en centrifugeant le tube conique dans un rotor de seau oscillant à 750 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
  10. À l'aide d'une micropipette P1000, retirez lentement et complètement le tampon de digestion de la peau en prenant soin de ne pas déranger la pastille.
    REMARQUE: Une partie de la peau entière peut être sauvée à ce stade et utilisée comme un contrôle pour l'étape 3: Confirmation de la pureté cellulaire. Passer ces cellules à travers une passoire cellulaire de 70 m, puis commencer à l'étape 3.5 pour un traitement ultérieur.
  11. Resuspendre complètement la pastille cellulaire dans 1 ml de Melanocyte Media en faisant monter et descendre 15-20 fois avec une micropipette P1000. Ajouter la solution cellulaire résultante dans le sens goutte à un puits non couché d'un plat de 6 puits contenant 1 ml de Mlanocyte Media.
  12. Placer la peau plaquée homogénéisante dans un incubateur de culture tissulaire fixé à 37 oC et 5 % de CO2. Laisser les cultures incuber pendant 40 min.
    REMARQUE: Pendant ce temps, certains fibroblastes dans l'homogénéité de la peau adhéreront au plat non couché tandis que les mlanocytes et les kératinocytes restent en suspension.
  13. Transférer le supernatant de culture du plat non enrobé à un puits d'un plat prélavé et enrobé de collagène 6-puits. Ajouter G418 aux médias de sorte que la concentration finale est de 100 ng/mL.
  14. Ajouter 2 ml de fibroblaste Media à un puits du plat non couché, contenant maintenant des fibroblastes adhérents.
  15. Incuber les deux cultures du jour au lendemain dans unincubateur de culture tissulaire fixé à 37 oC et 5 % de CO 2.
  16. Aspirer séparément les médias et les débris de chaque culture, 16-24 h après le placage. Laver chaque plat deux fois avec 1 ml de PBS stérile, puis ajouter 2 mL de Mélanocyte Média frais plus 100 ng/mL G418 à la culture des mélanocytes et 2 mL de fibroblaste séreindaux frais à la culture du fibroblaste.
  17. Après que les cultures de mélanocytes aient été traitées avec G418 pendant 48 h, lavez les cellules deux fois avec 1 ml de PBS stérile et ajoutez 2 ml de médias frais de Melanocyte sans G418 à la culture.
    REMARQUE: Pendant que les fibroblastes dans la culture de mélanocyte continuent à mourir outre du traitement post-G418, lavez le plat avec le PBS stérile pour enlever les cellules mortes et ajoutez les médias frais de Melanocyte. Les cultures de mlanocytes et de fibroblastes devraient être passages lorsqu'elles atteignent 70-80% de confluence.

3. Confirmation de la pureté cellulaire

  1. Aspirez les médias de chaque culture et lavez soigneusement chaque plat avec 1 ml de PBS stérile.
  2. Ajouter 0,7 ml de trypsine de 0,25 % à chaque culture et incuber les cultures en trypsine à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 1 min.
  3. Déloger les cellules en pipetilage de la trypsine contre le fond du plat à l'aide d'une micropipette P1000.
  4. Ajoutez 0,7 ml du support approprié à chaque culture trypsinisée et transférez la solution cellulaire dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml.
  5. Pelleter les cellules par centrifugation à 750 x g pendant 2 min à température ambiante. Retirez soigneusement et jetez le supernatant à l'aide d'une micropipette P1000.
    REMARQUE: Les étapes 3.1-3.5 peuvent être utilisées pour faire passer les cultures de mlanocytes et de fibroblastes. Les granulés qui en résultent doivent être suspendus dans le support approprié et placés dans un nouveau plat non couché (fibroblastes) ou prélavé, recouvert de collagène (milanocytes).
  6. Resuspendre la pastille cellulaire dans 0,5 ml de PBS glacé.
  7. Énumérer et transférer 0,5 million de cellules dans un tube microcentrifuge préréfrigéré de 1,5 mL.
  8. Répétez l'étape 3.5, puis resuspendles les cellules dans 100 l de la solution de viabilité. Incuber la suspension cellulaire pendant 30 min à 4 oC dans l'obscurité.
  9. Répétez les étapes 3.5-3.6 deux fois.
  10. Répétez l'étape 3.5, puis fixez les cellules en rependant la pastille dans 100 lde de la solution de paraformaldéhyde à froid. Incuber la suspension pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité.
  11. Répétez l'étape 3.5 deux fois, chaque fois en rependant la pastille dans 0.5 ml de BSA de 3% en 1x PBS.
  12. Répétez l'étape 3.5, puis resuspendre le granule de cellule en 100 l de 0,1% Solution de saponine. Incuber la suspension pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité.
  13. Répétez l'étape 3.5, puis resuspendre le granule cellulaire en 100 'L de 0.1% Solution de saponine contenant 0.5 'g d'anticorps anti-gp100 de lapin, 0.5 'g de lapin anti-Fibroblast-spécifique protéine 1 (FSP1) anticorps et 0.025 'g de souris anti-Cytokeratin 14 (K14) anticorps. Incuber la suspension pendant 1 h à température ambiante dans l'obscurité.
    REMARQUE: Bien que l'anticorps K14 ait été acheté avant la conjugaison d'Alexa Fluor 647, les anticorps gp100 et FSP1 ont été conjugués aux FC 555 et CF 488, respectivement. La coloration des populations témoins devrait également commencer à cette étape. Les populations de cellules témoins doivent être isolées de la culture et traitées comme décrit aux étapes 3.5-3.12.
  14. Répétez l'étape 3.11 deux fois, pour enlever tout anticorps non lié.
  15. Répétez l'étape 3.5, puis resuspendre la pastille cellulaire en 200-400 'L de 3% BSA en 1x PBS.
  16. Passez la solution cellulaire à travers une passoire cellulaire de 40 m dans un tube à fond rond en polystyrène de 5 ml et analysez les cellules tendues par cytométrie d'écoulement.

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Résultats

Les souris mâles et femelles de C57Bl/6J ont été euthanasiées les jours postnatals 0-4 et la peau tronquée a été soumise à la dissociation mécanique comme décrit ci-dessus. Après le hachage, la peau a formé une boue visqueuse sans aucun signe de tissu structurel. La centrifugation de cette boue a entraîné la formation d'une grosse pastille cellulaire au fond du tube conique et d'une couche d'adipose flottant au-dessus du supernatant. Cette couche adipeuse a été jetée avec le supernatant tandis que le granule de cellule r...

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Discussion

La culture in vitro des mlanocytes primaires et des fibroblastes a mené à des progrès significatifs dans notre compréhension de la biologie de peau et de la maladie. Ce protocole améliore les méthodes antérieures d'isolement des mlanocytes en réduisant le temps et le sens technique nécessaires pour générer des cultures cohérentes de mlanocytes tout en permettant l'isolement simultané des fibroblastes de peau. Un élément nouveau et salvateur de cette procédure est que le derme et l'épiderme n'ont pas besoin d'être séparés...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient la Fondation Damon Runyon (Prix de l'innovation #38-16 ans à C.E.B.) et Pelotonia (B.M.M.) pour leur soutien financier. Nous sommes reconnaissants à C. Haines et C. Wormsbaecher qui ont fourni des commentaires pour améliorer le texte du manuscrit. Ce travail a bénéficié de l'Ohio State Comprehensive Cancer Center's Analytical Cytometry Shared Resource qui est soutenu par NIH P30 CA016058.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,2 et micro ; m PES filtre à seringue stérileVWR28145-501
10 cm boîte de culture cellulaireCorning430167
40 µ ; Filtre à cellules mFisher Scientific22363547
5 mL tubes à fond rond en polystyrèneFisher Scientific352008
6 puitsSigma-AldrichSIAL0516
70 µ ; Filtre à cellules mFisher Scientific22363548
Solution antimycosique antibiotique (100x)Sigma-AldrichA5955
Albumine sérique bovineFisher ScientificBP9706-100
CF 488A Mix-n-Stain Kit de marquage d’anticorpsBiotium92273
CF 555 Mix-n-Stain Kit de marquage d’anticorpsBiotium92274
Toxine cholériqueSigma-AldrichC8052
Collagène de la queue de ratSigma-AldrichC7661
Collagénase de type IWorthington BiochemicalsLS004156
Corning Pénicilline/Streptomycine SolutionFisher Scientific30-002-CL
Cytokératine 14 Anticorps Alexa Fluor 647Novus BiologicalsNBP2-34403AF647
Déoxyribonucléase IWorthington BiochemicalsLS002058
Di-butyryl cyclique AMPSigma-AldrichD0627
Dulbecco’s Modified Eagle MediumGibco12800-082
Dulbecco’s Phosphate Buffered SalineSigma-AldrichD8537
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780Thermo Fisher65-0865-14
Éthanol, 200 proofFisher Scientific22032601
Sérum de veau fœtalSigma-Aldrich12306C
FSP1/S100A4anticorps Millipore Sigma07-2274
G418 DisulfureP212121LGB-418-1
Acide acétique glacialVWRVWRV0714
Sérum de chevalFisherScientific 26050088
HyClone L-GlutamineFisherScientific SH3003402
McIlwain Tissue ChopperTed Pella10180
Mélanome gp100 anticorpsAbcamab137078
Nutrient Mix F-12 Ham’s MediaSigma-AldrichN6760
Phorbol 12-Myristate 13-acétateSigma-AldrichP8139
Pierce 16 % FormaldéhydeThermo Fisher28908
Trypsine porcineSigma-Aldrich85450C
RPMI 1640 médiaSigma-AldrichR8758
SaponinSigma-AldrichS-7900
Lame de hachoirTed Pella121-6
Hachoir en tissu Disque en plastiqueTed Pella10180-01
TrypsineVWRVWRL0154-0100

Références

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