Article de méthode

Établissement et caractérisation de trois lignées cellulaires résistantes à l'adénocarciane pulmonaire résistante à l'afatinib PC-9 développées avec des doses croissantes d'Afatinib

DOI :

10.3791/59473

⸱

26 juin 2019

 ,  ,  ,  , 
1Advanced Cancer Translational Research Institute, Showa University, 2Division of Breast Surgical Oncology, Department of Surgery, Showa University School of Medicine, 3Division of Allergology and Respiratory Medicine, Department of Medicine, Showa University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une méthode pour établir des lignes cellulaires afatinib-résistance des cellules PC-9 d'adénocarcinome de poumon a été développée, et des cellules résistantes ont été caractérisées. Les cellules résistantes peuvent être employées pour étudier les mécanismes épidermiques de récepteur de kinase de kinase de facteur de croissance de facteur de facteur de tyrosine, applicables pour des patients présentant le cancer du poumon de non-petite cellule.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La résistance acquise aux inhibiteurs moléculaires de cible est un problème grave dans la thérapie de cancer. Le cancer du poumon demeure la principale cause de décès liés au cancer dans la plupart des pays. La découverte de « mutations de conducteur oncogènes »,telles que les mutations épidermiques de facteur de croissance (EGFR) activant, et le développement suivant des agents moléculaires ciblés des inhibiteurs de la kinase de tyrosine d'EGFR (TKIs) (gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib, et osimertinib) ont considérablement modifié le traitement du cancer du poumon au cours des dernières décennies. Cependant, ces médicaments ne sont toujours pas efficaces chez les patients atteints d'un cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC) porteurs de mutations activantes EGFR. Après résistance acquise, la progression systémique de NSCLC demeure un obstacle significatif en traitant des patients présentant le NSCLC mutation-positif d'EGFR. Ici, nous présentons une méthode progressive d'escalade de dose pour établir trois lignées cellulaires afatinib-résistantes acquises indépendantes des cellules PC-9 de NSCLC hébergeant des mutations EGFR-activant des suppressions de paire s'édifiantdansdansdans eegFR exon 19. Des méthodes pour caractériser les trois lignées cellulaires indépendantes d'afatinib-résistance sont brièvement présentées. Les mécanismes de résistance acquis aux TCI EGFR sont hétérogènes. Par conséquent, plusieurs lignées cellulaires ayant une résistance acquise à l'EGFR-TKIs doivent être examinées. Dix à douze mois sont nécessaires pour obtenir des lignées cellulaires avec une résistance acquise en utilisant cette approche d'escalade de dose progressive. La découverte de nouveaux mécanismes de résistance acquis contribuera à l'élaboration de stratégies thérapeutiques plus efficaces et plus sûres.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cinq inhibiteurs de la tyrosine kinase, ciblant le récepteur épidermique du facteur de croissance (EGFR), y compris le gefitinib, l'erlotinib, l'afatinib, le dacomitinib et l'osimertinib sont actuellement disponibles pour traiter les patients atteints de poumon non à petites cellules non à petites cellules mutation EGFR cancer (NSCLC). Au cours de la dernière décennie, les thérapies pour de tels patients ont subi le développement dramatique avec la découverte de nouveaux EGFR-TKIs potentiels. Parmi les patients atteints d'adénocarcinome pulmonaire, des mutations somatiques dans l'EGFR sont identifiées chez environ 50 % des patients asiatiques et 15 % des patients caucasiens1. Les mutations les plus communes dans EGFR sont une mutation de point de L858R dans egFR exon 21 et 15 suppressions de paire de base (bp) dans l'exon d'EGFR 192. Chez les patients egFR mutation-positifs avec NSCLC, EGFR-TKIs améliorer les taux de réponse et les résultats cliniques par rapport à la norme précédente de la chimiothérapie de doublet de platine3.

Le gefitinib et l'erlotinib ont été les premiers inhibiteurs approuvés de petites molécules et sont généralement appelés TKIs EGFR de première génération. Ces EGFR TKIs bloquent l'activité tyrosine kinase en rivalisant avec l'ATP et en se liant de manière réversible aux sites de liaison ATP4. Afatinib est un TKI EGFR de deuxième génération qui se lie de façon irréversible et covalente au domaine de la tyrosine kinase de l'EGFR et se caractérise comme un inhibiteur panhumain de la famille EGFR5.

En dépit de l'avantage dramatique de ces thérapies dans les patients présentant NSCLC, la résistance acquise est inévitable. Le mécanisme de résistance le plus commun contre les TKIs EGFR de première et deuxième génération est l'émergence de la mutation T790M dans l'exon 20 d'EGFR, qui est présent dans 50-70% des échantillons de tumeur6,7,8. D'autres mécanismes de résistance incluent des signaux de déviation (au MET, à l'IGF1R, et au HER2), la transformation au cancer dupoumon à petites cellules, et l'induction de la transition épithéliale-à-mesenchymal, qui se produisent précliniquement et médicalement 9. Les mécanismes de résistance aux TCI EGFR sont hétérogènes. En identifiant de nouveaux mécanismes de résistance dans les études précliniques, il peut être possible de développer de nouvelles thérapies pour surmonter la résistance. Les thérapies optimales de séquence qui maximisent l'avantage clinique aux patients doivent considérer les mécanismes de résistance et la cible thérapeutique.

Il est impératif de choisir la bonne lignée cellulaire parentale, car c'est la base de toutes les expériences ultérieures. Les stratégies de sélection commencent par une pertinence clinique; il est nécessaire de choisir une ligne cellulaire naïve de chimiothérapie et de rayonnement. Le traitement chimiothérapeutique et/ou radiatif antérieur peut induire l'altération des voies de résistance et les changements de l'expression des marqueurs de résistance aux médicaments. Dans cette étude, les cellules PC-9, portant des suppressions de 15 bp dans egFR exon 19, sont employées pour l'établissement de la résistance acquise à l'afatinib. Cette lignée cellulaire a été dérivée d'un patient japonais de NSCLC, qui n'a pas reçu la chimiothérapie et le rayonnement antérieurs.

Parce que l'afatinib est administré par voie orale sur une base quotidienne, le traitement in vitro continu, où les cellules sont cultivées en permanence en présence d'afatinib serait cliniquement pertinent. La dose de médicaments utilisés dans les différentes étapes de l'expérience doit être optimisée pour la lignée cellulaire parentale sélectionnée. Un test de cytotoxicité peut être utilisé pour déterminer une gamme de médicaments approprié, qui devrait être comparable à l'information pharmacocinétique du médicament.

Tout au long du processus de sélection, toute la population de cellules est maintenue en un seul groupe; le clonage ou d'autres méthodes de séparation ne sont pas utilisés. Les cellules sont d'abord continuellement exposées à un faible niveau de la drogue. Par la suite, après que les cellules s'adaptent pour se développer en présence du médicament, la dose du médicament est lentement augmentée à la dose optimale finale du médicament10,11. Alternativement, une administration de drogue de pouls ou mutagénèse peut être employée pour sélectionner des cellules de résistance, qui sont également exécutées avant le traitement de drogue 12,13. Malheureusement, les cas où la résistance aux médicaments ne se développe pas ne sont généralement pas signalés. Les stratégies de sélection sont développées dans le but d'essayer d'imiter les conditions des patients cancéreux pour reconstruire la résistance médicalement pertinente. Parfois, pour identifier les changements moléculaires associés aux mécanismes de résistance aux médicaments, une forte concentration de médicaments est utilisée. Ce modèle devient moins pertinent sur le plan clinique.

Ici, nous décrivons une méthode pour établir trois lignées cellulaires indépendantes afatinib-résistantes des cellules DE PC-9 abritant 15 suppressions de bp dans l'exon 19 d'EGFR aussi bien que la caractérisation initiale des lignes cellulaires afatinib-résistantes.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Création de trois lignes cellulaires PC-9 indépendantes résistantes à l'Afatinib

  1. Détermination de la concentration initiale d'exposition d'afatinib pour des cellules de PC-9 utilisant le 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- du bromure de diphenyltetrazolium (MTT) d'assay
    1. Cellules PC-9 de culture dans le milieu de croissance contenant le sérum bovin foetal (10%), la pénicilline (100 U/mL), et la streptomycine (100 g/mL) dans un plat de 10 cm traité par culture cellulaire dans un incubateur de CO2 de 5 % à 37 oC.
    2. Resuspendre les cellules PC-9 à 4 x 104 cellules/mL dans le milieu de croissance, puis les graines à 50 l/puits dans une microplaque de 96 puits. La concentration finale des cellules est de 2,0 x 103 cellules/50 l/puits. Incuber toute la nuit dans un incubateur de CO2 à 37oC.
    3. Ajouter 50 l de solution afatinib à différentes concentrations : 0, 0,002, 0,006, 0,02, 0,06, 0,2, 0,6, 2, 6 et 20 M aux puits contenant le milieu de croissance (50 l). Le volume final et les concentrations d'afatinib sont de 100 L et 0, 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 et 10 M, respectivement.
    4. Incuber la plaque de 96 puits pendant 96 h dans un incubateur de CO2 de 5 % à 37 oC.
    5. Ajouter 15 l de la solution de teinture (voir Tableau des matériaux) à chaque puits et incuber pendant 4 h dans un incubateur de CO2 de 5 % à 37 oC, puis ajouter 100 l de solubilisation/stop-solution (voir Tableau des matériaux)à chaque puits et incuber pendant la nuit dans un CO de 5 % c10-2 incubateur à 37 oC.
    6. Mesurer la densité optique à 570 nm (OD570) à l'aide d'un lecteur de microplaques (voir Tableau des matériaux). Préparer 6-12 répliques et répéter les expériences au moins trois fois.
    7. Utiliser un logiciel statistique (voir Tableau des matériaux) pour tracer graphiquement ces données sous forme de graphique semi-log et calculer la valeur de l'IC50, c'est-à-dire la concentration de médicaments qui réduit la réponse à 50 % de son maximum (voir tableau des matériaux ).
  2. Exposition continue des cellules PC-9 à l'irréversible EGFR-TKI, afatinib, par escalade progressive de dose dans trois plats indépendants de 10 cm
    1. Culture PC-9 cellules dans p100 plats contenant 10 ml de milieu de croissance. Lorsque les cellules PC-9 atteignent le stade sous-confluent, transférez 1 ml de suspension cellulaire dans trois nouveaux plats p100, avec 9 ml de milieu de croissance. Les cellules PC-9 diluées 1:10 deviennent sous-confluentes en 3-4 jours, avec un nombre cellulaire d'environ 4-5 x 105 cellules/mL.
    2. Le lendemain, ajouter 1/10 de la valeur IC50 d'afatinib dans chacun des trois plats p100.
      REMARQUE: L'afatinib est reconstitué en DMSO à des concentrations de stocks de 1 M, 10 M, 100 M, 1 mm et 5 mM. 1 à 10 L de solution afatinib est ajouté dans 10 ml de milieu de croissance dans la culture, selon les concentrations finales requises.
    3. Lorsque les cellules des plats p100 contenant de l'afatinib deviennent sous-confluentes, mélangez bien par aspiration avec une pipette de 1 ml et ajoutez 1 ml de suspension cellulaire à 9 ml de milieu de croissance frais dans un nouveau plat p100. Ensuite, ajoutez 10-20% plus de concentrations d'afatinib à la nouvelle culture.
    4. Augmenter la concentration d'afatinib de 0,1 nM à 1 M à moyen par l'escalade de la dose progressive avec la concentration d'afatinib a augmenté de 10-20% à chaque étape au cours de la période de 10-12 mois.
      REMARQUE: Lorsque la concentration d'afatinib s'approche de la valeur IC50, la croissance cellulaire devient assez lente. Si les cellules sont divisées 1:9, elles peuvent ne pas se développer, car ces cellules sont tuées par des concentrations plus élevées d'afatinib. Par conséquent, à des concentrations plus élevées d'afanitib, les cellules peuvent être divisées à un rapport de 1:2. Les cellules les plus résistantes ont été cultivées dans un milieu contenu en afatinib pendant 3-14 jours, et le milieu n'a pas été changé jusqu'à ce que les cellules résistantes aient besoin d'être passages.
    5. Culture des cellules résistantes à l'afatinib pendant 2-3 mois dans un milieu de croissance contenant de l'afatinib de 1 m. À une concentration d'afatinib de 1 M, 10-12 mois sont nécessaires pour développer une résistance à l'afatinib dans ce modèle. Effectuez l'essai de MTT pour confirmer que les cellules sont résistantes à l'afatinib. Les trois lignées cellulaires de résistance à l'afatinib établies indépendamment ont été nommées AFR1, AFR2 et AFR3.

2. Caractérisation de trois cellules indépendantes résistantes à l'Afatinib

  1. Détermination de la courbe de croissance des cellules PC-9 parentales et établissement de cellules résistantes à l'afatinib
    1. Culture les cellules PC-9, AFR1, AFR2 et AFR3 dans le milieu de croissance dans un incubateur de CO2 de 5% à 37 oC.
    2. Resuspendre les cellules à 5 x 103 cellules/mL avec milieu de croissance, et la graine 100 L/puits dans une microplaque de 96 puits, de sorte que la concentration finale des cellules est de 500 cellules/100 l/puits.
      REMARQUE: L'évaluation MTT est effectuée pour mesurer les valeurs OD570 à 0, 1, 2, 3, 5 et 7 jours. Six microplaques de 96 puits sont nécessaires pour chaque jour.
    3. Effectuer l'assay MTT tous les 24 h, puis les jours 0, 1, 2, 3, 5 et 7. Mesurer les valeurs OD570 et préparer 6-12 répliques; répéter les expériences au moins trois fois, et tracer graphiquement les résultats à l'aide d'un logiciel statistique (voir tableau des matériaux).
  2. Identification des altérations de l'ADN génomique dans l'EGFR par PCR en temps réel
    REMARQUE: L'afatinib est un inhibiteur de petite molécule qui cible la tyrosine kinase EGFR. Le statut d'expression DE l'EGFR est déterminé au niveau de l'ADN et des protéines.
    1. L'ADN génomique est isolé à l'aide d'un kit de purification de l'ADN (voir Tableau des matériaux) suivant les instructions du fabricant. Mesurer la concentration de l'ADN génomique isolé à l'aide d'un spectrophotomètre (voir Tableau des matériaux)et ajuster tous les échantillons d'ADN génomique à 25 ng/L.
    2. Amplifier 50 ng d'ADN génomique, ce qui équivaut à 2 oL des stocks de 25 ng/L, à l'aide d'un mix maître SYBR Green (voir Tableau des matériaux)et analyser les résultats à l'aide d'un système de détection RT-PCR à base de fluorescence (voir Tableau des matériaux).
      REMARQUE: Les conditions de cycle de PCR ont commencé par une étape initiale de dénaturation à 95 oC pour 20 s, suivie de 40 cycles de dénaturation de 95 oC pour 3 s, 60 oC d'annealing pour 30 s. Les ensembles d'amorces spécifiques sont les suivants: EGFR F: 5-CAAGGCCATGGAATCTGTCA-3, R: 5-CTGGAATGAGGGAGGAACA-3. Gène de normalisation LINE-1 F: 5-AAGCCGCTCAACTACATGG-3, R: 5'-TGCTTTGAATGCGTCCCAGAG-3'
  3. Évaluation de l'effet des altérations des protéines sur le niveau EGFR par analyse de tache occidentale
    1. Traiter les cellules avec de l'afatinib en continu avant les expériences pendant 24 h. Laver les cellules PC-9, AFR1, AFR2 et AFR3 deux fois avec du PBS, puis les ensemencer dans des supports de croissance sans afatinib. Laver les cellules PC-9, AFR1, AFR2 et AFR3 deux fois avec 5 ml de PBS glacé.
    2. Lyser les cellules dans le tampon RIPA contenant 1% de cocktail inhibiteur de la protéase (voir Tableau des matériaux)et le cocktail inhibiteur de la phosphatase II et III (voir Tableau des matériaux)et incuber cette solution à 4 oC pendant 30 min. Centrifuger les lysates pendant 10 min à 100 x g et 4 oC et recueillir les lysates défrichés.
    3. Déterminer les concentrations protéiques à l'aide de l'analyse de l'acide bicinchoninique (voir Tableau des matériaux),ajuster tous les échantillons de protéines à 0,5 ou 1 g/L à l'aide d'un tampon d'échantillon 4x (500 mM Tris (PH 6,8), 40 % de glycérol, 8 % de SDS, 20 % H2O, 0,02 % de bromenol bleu) et faire bouillir à 96 oC pendant 5 min. Conserver ces échantillons de protéines à -80 oC jusqu'à ce que l'analyse de la tache occidentale soit effectuée.
    4. Séparez des quantités égales d'échantillons de protéines, de préférence de 20 à 30 l, par 8 % de sDS-page et transférez les protéines dans une membrane de fluorure de polyvinylide (PVDF).
      REMARQUE: L'électrophores gel de sulfate-polyacrylamide de dodecyl de sodium (SDS-PAGE) est couramment utilisé en laboratoire pour la séparation des protéines en fonction de leur poids moléculaire.
      1. Nettoyez les plaques de verre avec de l'éthanol et assemblez la plaque de verre et les espaceurs. Préparer 8% de gels poly-acrylamide contenant 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8, 40% Bis-acrylamide, 10% SDS, 10% APS, et TEMED. Polymériser pendant 30 min à température ambiante.
      2. Par la suite, préparer un gel d'empilage contenant 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 40% bis-acrylamide, 10% SDS, 10% APS, et TEMED. Ajouter la solution de gel d'empilage, insérer le peigne et polymériser le gel pendant 20-30 min à température ambiante.
      3. Placez les gels dans l'appareil d'électrophorèse et remplissez le réservoir d'un tampon de fonctionnement (0,25 M Tris, 1,92 M de glycine et 1 % de SDS). Chargez une quantité égale d'échantillons de protéines (20-30 l) et faites fonctionner le gel à 180 V. Arrêtez l'électrophorèse une fois que l'avant de teinture sort du gel, après environ 60 min.
      4. Laver le gel pendant 1-2 min avec tBST, puis transférer les protéines sur une membrane PVDF par des ballonnements semi-secs (voir Tableau des matériaux) pendant 1,5 h à un courant constant de 300 mA.
    5. Bloquer les membranes avec 5% de lait sec non gras (voir Tableau des matériaux)dilué avec la solution TBST (voir Tableau des Matériaux) pendant 1 h à température ambiante, puis sonder les membranes avec anti-EGFR, anti-phospho-EGFR (Y1068), anti-HER2, anti-HER3, anti-MET, et anti-actine (dilué 1:3,000 dans TBST) (voir tableau des matériaux) à 4 oC pendant la nuit.
    6. Laver les membranes avec du TBST trois fois pendant 10 min, puis exposer les membranes à l'anticorps secondaire (dilué 1:200 en TBST) pendant 1-1,5 h à température ambiante. Laver les membranes cinq fois avec du TBST pendant 10 min à température ambiante, les exposer à la solution ECL (voir Tableau des matériaux)et visualiser les signaux à l'aide de films.
  4. Analyse des mutations EGFR par séquençage
    1. Amplifier l'ADN génomique à l'aide d'amorces spécifiques pour les exons EGFR 19-21. Les conditions de cycle PCR commencent par une première étape de dénaturation à 94 oC pendant 1 min, suivie de 30 cycles de dénaturation à 98 oC pour 10 s, d'une annealing à 55 oC pour 30 s et d'une extension à 72 oC pour 1 min.
      REMARQUE: Les amorces spécifiques pour EGFR exon 19: F: 5'-GCAATATCAGCCTTAGGTGCCCTC-3'R: 5'-CATAGAAGTGAACATTTAGGATGTG-3', exon 20: F: 5'-CCATGAGTACGTATTTTGAAACTC-3', R: 5'-CATATCCCCATGGCAAACTCTTGC-3', et exon 21: F: 5'-ATGAACATGACCCTGAATTCGG-3', R: 5'- GCTCACCCAGAATGTCTGGAGA-3.
    2. Purifiez les produits PCR amplifiés à l'aide d'un kit de purification PCR (voir Tableau des matériaux)et séquencez les amplicons.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le schéma pour établir trois lignées cellulaires de résistance à l'afatinib à partir de cellules PC-9 à l'aide d'une procédure d'escalade de la dose progressive est montré dans la figure 1. La figure 2 montre une diminution de la prolifération cellulaire des cellules PC-9 parentales à mesure que la concentration d'afatinib augmente, ce qui indique que les cellules PC-9 sont sensibles à l'exposition à l'afatinib.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous avons décrit une méthode pour établir trois lignées cellulaires indépendantes résistantes à l'afatinib et caractérisé ces cellules par rapport aux cellules PC-9 parentales. Par l'exposition progressive d'escalade de dose, les cellules parentales de PC-9 ont acquis la résistance à l'afatinib sur une période de 10-12 mois. Cliniquement, les mécanismes de résistance aux ItNI EGFR sont hétérogènes, et donc, après le traitement initial avec l'afatinib, les cellules PC-9 ont été divisées en trois plats p100 indépenda...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le membre de l'Institut avancé de recherche translationnelle sur le cancer pour ses commentaires réfléchis et son édition pour son aide à l'édition de la langue anglaise. Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI (numéro de subvention: 16K09590 à T.Y.).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
afatinibSelleckS1011
anticorps monoclonal anti-EGFRtechnologie de signalisation cellulaire4267S
dosage de l’acide bicinchonincsigmaB9643
culture cellulaire traitée Boîte de 10 cmViolamo2-8590-03
CELL BANKER1  ;Milieu de cryoconservationTakaRaCB011
CellTiter 96Promega  ; G4100° ; Essai de prolifération cellulaire non radioactive ; Solution colorante et solution de solubilisation/arrêt
DMSOWako043-07216
Solution ECLPerkin ElmerNEL105001EA
FBSgibco26140-079
GeneAmp 5700Applied BiosystemsSystème de détection RT-PCR basé sur la fluorescence  ;
Logiciel GraphPad Prism v.7  ;GraphPad, Inc.un logiciel statistique
Spectrophotomètre NanoDrop LiteThermospectrophotomètre
de signalisation cellulairelait sec écrémé9999S
Pen Strepgibco15140-163
inhibiteur de la phosphatase 2sigmaP5726
d’inhibiteur de la phosphatase 3sigmaP0044
Lecteur de microplaques Powerscan HTBioTek
Puissance SYBR Green master mix  ;Applied BiosystemsSYBR Green master mix
inhibiteur de protéase cocktailsigmaP8340
QIAamp DNA Mini kitQiagen51306Kit de purification d’ADN
QIAquick PCR Kit de purificationQIAGENPCR kit de purification
RPMI-1640  ;Wako189-02025avec L-Glutamine et Rouge de Phénol
TBSTpoudre sigmaT9039
Trans-Blot SD Semi-Sec Cellule de transfert électrophorétiqueBio-Radsemi-sec t4ransfer appareil
96 puitsmicroplaque Thermo130188
Technologie du cocktail cocktail

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chan, B. A., Hughes, B. G. Targeted therapy for non-small cell lung cancer: current standards and the promise of the future. Translational Lung Cancer Research. 4 (1), 36-54 (2015).
  2. Mitsudomi, T., Yatabe, Y. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer. Cancer Science. 98 (12), 1817-1824 (2007).
  3. Yamaoka, T., Kusumoto, S., Ando, K., Ohba, M., Ohmori, T. Receptor tyrosine kinase-targeted cancer therapy. International Journal of Molecular Science. 19 (11), (2018).
  4. Marshall, J. Clinical implications of the mechanism of epidermal growth factor receptor inhibitors. Cancer. 107 (6), 1207-1218 (2006).
  5. Hirsh, V. Managing treatment-related adverse events associated with egfr tyrosine kinase inhibitors in advanced non-small-cell lung cancer. Current Oncology. 18 (3), 126-138 (2011).
  6. Arcila, M. E., et al. Rebiopsy of lung cancer patients with acquired resistance to EGFR inhibitors and enhanced detection of the T790M mutation using a locked nucleic acid-based assay. Clinical Cancer Research. 17 (5), 1169-1180 (2011).
  7. Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Science Translational Medicine. 3 (75), 75ra26(2011).
  8. Yang, J. C., et al. Osimertinib in pretreated T790M-positive advanced non-small-cell lung cancer: AURA study phase II extension component. Journal of Clinical Oncology. 35 (12), 1288-1296 (2017).
  9. Chong, C. R., Janne, P. A. The quest to overcome resistance to EGFR-targeted therapies in cancer. Nature Medicine. 19 (11), 1389-1400 (2013).
  10. Clynes, M., Redmond, A., Moran, E., Gilvarry, U. Multiple drug-resistance in variant of a human non-small cell lung carcinoma cell line, DLKP-A. Cytotechnology. 10 (1), 75-89 (1992).
  11. Yamaoka, T., et al. Distinct afatinib resistance mechanisms identified in lung adenocarcinoma harboring an EGFR mutation. Molecular Cancer Research. 15 (7), 915-928 (2017).
  12. Liang, X. J., Shen, D. W., Garfield, S., Gottesman, M. M. Mislocalization of membrane proteins associated with multidrug resistance in cisplatin-resistant cancer cell lines. Cancer Research. 63 (18), 5909-5916 (2003).
  13. Shen, D. W., Akiyama, S., Schoenlein, P., Pastan, I., Gottesman, M. M. Characterisation of high-level cisplatin-resistant cell lines established from a human hepatoma cell line and human KB adenocarcinoma cells: cross-resistance and protein changes. British Journal of Cancer. 71 (4), 676-683 (1995).
  14. Murakami, H., et al. Phase I study of continuous afatinib (BIBW 2992) in patients with advanced non-small cell lung cancer after prior chemotherapy/erlotinib/gefitinib (LUX-Lung 4). Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (4), 891-899 (2012).
  15. Nukaga, S., et al. Amplification of EGFR wild-type alleles in non-small cell lung cancer cells confers acquired resistance to mutation-selective EGFR tyrosine kinase inhibitors. Cancer Research. 77 (8), 2078-2089 (2017).
  16. Nakatani, K., et al. EGFR amplifications mediate resistance to rociletinib and osimertinib in acquired afatinib-resistant NSCLC harboring exon 19 deletion/T790M in EGFR. Molecualr Cancer Therapy. 18 (1), 112-126 (2019).
  17. Piotrowska, Z., et al. Heterogeneity underlies the emergence of EGFRT790 wild-type clones following treatment of T790M-positive cancers with a third-generation EGFR inhibitor. Cancer Discovery. 5 (7), 713-722 (2015).
  18. Ortiz-Cuaran, S., et al. Heterogeneous mechanisms of primary and acquired resistance to third-generation EGFR inhibitors. Clinical Cancer Research. 22 (19), 4837-4847 (2016).
  19. Kobayashi, Y., et al. Characterization of EGFR T790M, L792F, and C797S mutations as mechanisms of acquired resistance to afatinib in lung cancer. Molecular Cancer Therapy. 16 (2), 357-364 (2017).
  20. Uchibori, K., Inase, N., Nishio, M., Fujita, N., Katayama, R. Identification of mutation accumulation as resistance mechanism emerging in first-line osimertinib treatment. Journal of Thoracic Oncology. 13 (7), 915-925 (2018).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

R sistance l afatinibcellules PC 9mutations de l EGFRaugmentation progressive des dosesessai MTTanalyse par Western blots quen age de l EGFRisolation de l ADN g nomiquedosage de la concentration prot iquecourbe de croissance cellulaire

Articles connexes