Imagerie à haute résolution de la dynamique nucléaire dans les cellules vivantes sous contrainte de traction uniaxiale

Résumé

À l’aide d’un dispositif conçu antérieurement pour appliquer une déformation mécanique aux cellules adhérentes, cet article décrit une géométrie de substrat redessinée et un appareil personnalisé pour l’imagerie à une seule cellule à haute résolution de cellules tendues avec un objectif d’immersion en huile de 100 x.

Résumé

La souche mécanique extracellulaire est connue pour susciter des réponses phénotypiques cellulaires et a une pertinence physiologique dans plusieurs systèmes tissulaires. Pour capter l’effet de la déformation extracellulaire appliquée sur les populations cellulaires in vitro via des dosages biochimiques, un dispositif a déjà été conçu qui peut être fabriqué simplement et est assez petit pour s’adapter à l’intérieur des incubateurs de culture tissulaire, ainsi que sur le dessus de étapes du microscope. Cependant, la conception antérieure du substrat de polydiméthylsiloxane n’autorisait pas l’imagerie subcellulaire à haute résolution par des objectifs d’immersion en huile. Ce travail décrit une géométrie redessinée du substrat de polydiméthylsiloxane et une configuration d’imagerie personnalisée qui, ensemble, peut faciliter l’imagerie sous-cellulaire à haute résolution des cellules vivantes pendant la déformation appliquée. Ce substrat peut être utilisé avec le même appareil conçu précédemment et, par conséquent, a les mêmes avantages que énumérés ci-dessus, en plus d’autoriser l’imagerie optique haute résolution. La conception du substrat de polydiméthylsiloxane peut être améliorée en incorporant une grille qui facilitera le suivi de la même cellule avant et après l’application de la souche. Les résultats représentatifs démontrent une imagerie en accéléré à haute résolution des noyaux marqués fluorescemment dans les cellules tendues capturées à l’aide de la méthode décrite ici. Ces données sur la dynamique nucléaire donnent un aperçu du mécanisme par lequel la souche de traction appliquée favorise la différenciation des cellules progénitrices des oligodendrocytes.

Introduction

Les cellules et les tissus dans le corps sont soumis à divers indices mécaniques, y compris les souches de traction. Cependant, les effets de ces indices sur la biologie des cellules neuronales n’ont pas encore été étudiés de manière exhaustive et pleinement compris. Dans le système nerveux central, les sources de déformation mécanique comprennent la croissance du développement^1,2,3,4, les processus physiologiques tels que la flexion de la moelle épinière, le sang et le liquide céphalo-rachidien pulsations, et pathologies telles que traumatisme, gonflement Axon, cicatrices gliales, ou croissance tumorale^5,6,7,8. Il est intéressant d’étudier comment la déformation de la traction affecte la différenciation des oligodendrocytes et la myélination subséquente des axones, qui est un processus critique dans le système nerveux central des vertébrés. À l’aide d’un dispositif de déformation conçu sur mesure et de plaques multipuits en élastomère, les travaux antérieurs^9,10 ont montré que la souche uniaxiale statique peut augmenter la différenciation des oligodendrocytes par des changements globaux dans l’expression ^{des gènes 10}. pour mieux comprendre les mécanismes de la mécanotransduction de la souche dans ces cellules, l’appareil expérimental précédent doit être redessiné comme décrit ici, pour permettre l’imagerie par fluorescence à haute résolution de la dynamique nucléaire dans les conditions de vie cellules sous tension. Plus précisément, une plaque de polydiméthylsiloxane à un seul puits est développée et la configuration d’imagerie est redessinée pour permettre l’imagerie en accéléré des cellules vivantes sous contrainte à l’aide d’une lentille d’immersion à l’huile de 100 x. Pour éliminer les effets optiques négatifs du polydiméthylsiloxane dans la voie de la lumière, les cellules sont imagées non pas par la plaque de polydiméthylsiloxane, mais dans la position inversée, à travers le verre de couverture couvrant le compartiment cellulaire. Grâce à cette nouvelle conception d’imagerie, des centaines de films en accéléré à haute résolution sont enregistrés, de noyaux cellulaires individuels dans des cellules adhérentes intactes, où la chromatine est étiquetée par le marquage de l’histone H2B à la protéine fluorescente verte. Ces films démontrent que la déformation par traction induit des changements dans la structure et la dynamique de la chromatine qui sont compatibles avec la progression de la différenciation des oligodendrocytes.

L’imagerie cellulaire en direct sous contrainte appliquée est techniquement difficile et nécessite une conception d’appareil compatible avec le système de microscope. La conception personnalisée décrite ici présente une alternative peu coûteuse aux solutions commerciales. Ses dimensions permettent son installation sur les stades du microscope et l’imagerie cellulaire en direct à haute résolution spatiale pendant la déformation appliquée. La configuration d’imagerie est conçue pour faciliter l’imagerie cellulaire en direct à l’aide d’une lentille d’immersion à l’huile de 100 x avec la plus grande clarté, à travers le verre de couverture, pas par la couche de la plaque de polydiméthylsiloxane qui, autrement, diminue la qualité de l’image et est commune dans la plupart configurations d’imagerie sous tension. L’appareil, avec une plaque montée contenant des cellules, peut également être stocké facilement dans l’incubateur. Cet appareil est conçu pour appliquer une souche uniaxiale à des substrats qui facilitent la culture de cellules adhérentes et maintiennent une souche stable et uniforme sur plusieurs jours. La configuration décrite ici peut être utilisée pour l’imagerie haute résolution de divers types de cellules adhérentes sous contrainte, ce qui le rend applicable aux études de mécanotransduction dans de nombreux domaines de la mécanobiologie cellulaire.

Protocole

1. conception du moule de polydiméthylsiloxane à un seul puits pour l’imagerie haute résolution

Remarque: le moule pour la fabrication de plaques de polydiméthylsiloxane est conçu avec les caractéristiques suivantes pour permettre l’imagerie avec une lentille d’immersion de l’huile 100X et un ajustement correct dans le dispositif de contrainte de construction sur mesure (figure 1a, B).

1. Conservez les dimensions globales de la plaque de façon à ce qu’elle s’insère dans les pinces du dispositif de déformation.
   NOTE: ici, ils sont 60 mm x 73 mm.
2. Faire un compartiment cellulaire ou bien qui est significativement plus petit que les dimensions latérales de la plaque entière, pour éviter les effets d’arc (flexion hors plan) qui se produisent aux bords non serrés de la plaque de polydiméthylsiloxane pendant la souche appliquée.
   Remarque: ici, le compartiment a été conçu comme un carré de 23 mm x 23 mm.
3. Garder la profondeur du compartiment cellulaire aussi minime que possible (pas plus de 80 μm), pour permettre la mise au point avec la lentille d’immersion de l’huile 100X à travers le couvercle en verre placé sur le dessus du compartiment, mais le rendre suffisamment suffisant pour contenir les médias et pour éviter de contacter ou serrant les cellules.
4. Soulever le compartiment à cellules sur un carré d’une hauteur de 3 mm, pour rapprocher les cellules de la lentille dans la configuration du microscope inversé pour permettre une mise au point facile.
   Remarque: les moules avec les caractéristiques ci-dessus peuvent être fabriqués par de nombreuses techniques, y compris, par exemple, l’aluminium fraisé. Alternativement, les moules maîtres peuvent également être assemblés en utilisant des feuilles acryliques coupées avec un cutter laser, couvercle en verre #0 pour le compartiment de la cellule, et super colle. Ce moule maître est utilisé pour faire une empreinte de polydiméthylsiloxane, qui est ensuite utilisé pour faire des moules de travail à l’aide d’une résine de coulée.

2. fabrication de plaques de polydiméthylsiloxane à puits unique et de compartiments carrés

1. Mélanger la base de polydiméthylsiloxane et l’agent de durcissement dans un rapport de 20:1 (en poids) dans une tasse jetable. Peser un total de 20 g de polydiméthylsiloxane par moule (pour la fabrication d’une plaque de polydiméthylsiloxane) et 150 g de polydiméthylsiloxane par 150 mm de diamètre dans un plat en plastique (pour faire un lot de compartiments carrés).
2. Laisser le mélange de polydiméthylsiloxane dans un dégazeur à vide à-0,8 bar pendant 30 min (ou jusqu’à ce que toutes les bulles soient enlevées).
3. Versez le mélange de polydiméthylsiloxane dans les moules (pour les assiettes) ou dans des plats en plastique de 150 mm (pour les compartiments carrés).
4. Enlevez les bulles additionnelles à ce stade, soit en soufflant de l’air (par la bouche) ou en dégazant les moules/plats remplis de polydiméthylsiloxane à nouveau à-0,8 bar vide pendant 30 min.
5. Laisser les moules/plats dans un four à 80 ° c sur une table de nivellement pendant 2 h.
6. Retirez délicatement les moules/plats du four et laissez-les refroidir à température ambiante. Peler délicatement le polydiméthylsiloxane durci après avoir soigneusement coupé les bords avec une lame (figure 1c).
7. Sur le polydiméthylsiloxane de diamètre 150 mm, dessinez une grille de 2 cm x 2 cm avec un marqueur. Dans chaque carré, dessinez un carré de 1 cm x 1 cm, laissant une marge de 0,5 cm de chaque côté. À l’aide d’une lame, coupez soigneusement le long des lignes pour obtenir des compartiments carrés (figure 2a).
8. Nettoyer les plaques de polydiméthylsiloxane/compartiments carrés en les incubant en 100% d’acétone pendant 4 h, suivie de 100% d’éthanol pendant 4 h, puis d’eau autoclavée pendant 4 h.
9. Placer les plaques/compartiments carrés sur du papier de support de film de paraffine (pas le film de paraffine mais le papier) à l’intérieur d’un plat en plastique de diamètre 150 mm (Figure 2c).
10. Laisser sécher la plaque de polydiméthylsiloxane dans le four 80 ° c pendant 4 h.
11. Sceller les plats de 150 mm de diamètre contenant des plaques de polydiméthylsiloxane et des carrés contenant du film de paraffine, et les ranger dans une chambre froide jusqu’à utilisation ultérieure.

3. fonctionnalisation des plaques de polydiméthylsiloxane

1. Enlevez le film de paraffine, enlevez le couvercle du plat en plastique, et placez les plaques de polydiméthylsiloxane et les compartiments carrés sous la lumière ultraviolette pendant 30 min.
2. Traiter le plasma (à 150 W pendant 5 min) les plaques de polydiméthylsiloxane (avec le compartiment de cellules vers le haut) sans les compartiments carrés, pour rendre la surface de culture hydrophile.
3. Placez immédiatement les compartiments carrés sur la surface traitée au plasma (figure 2b) et appuyez manuellement pour coller temporairement les deux ensemble.
   Remarque: ne traitez pas le plasma des compartiments carrés, sinon ils colleront fortement à la plaque de polydiméthylsiloxane et ne se décolleront pas facilement lorsqu’ils doivent être décollés pendant l’imagerie.
4. Ajouter 200 μL de 100 mM (3-Aminopropyl) triéthoxysilane au puits pendant 2 h pour introduire – NH₂ groupes à la surface du polydiméthylsiloxane. Pour faire une solution de 100 mM, dissoudre 234 μL de triéthoxysilane pur (3-aminopropyle) dans 10 mL d’eau. Après une incubation de 2 h, lavez les puits 3x avec de l’eau désionisée.
5. Peser 2 mg du réticulation moléculaire bissulfosuccinimidyl subberate et le dissoudre dans 700 μL de 1 M (4-(2-hydroxyethyl) -1-pipérazineéthane sulfonique tampon d’acide (pH 8,0) et 2,8 mL d’eau.
   NOTE: Ceci donnera une solution de 1 mM de bissulfosuccinimidyl subérate dans un tampon d’acide sulfonique de 200 mM (4-(2-hydroxyethyl) -1-pipérazineethane. Notez qu’un tampon de concentration de 50 mM fonctionne également bien.
   1. Ajouter 135 μL de cette solution et 15 μL de fibronectine à 1 mg/mL au puits dans chaque plaque de polydiméthylsiloxane pendant 4 h à température ambiante.
6. Laver 3x avec une solution saline tamponnée au phosphate. Ajouter 500 μL de solution saline tamponnée au phosphate au puits. Recouvrir le plat de 150 mm de diamètre contenant le polydiméthylsiloxane avec du film de paraffine et le ranger dans une chambre froide, jusqu’à utilisation ultérieure.

4. fonctionnalisation des plats et flacons en plastique

1. Incuber les plats et flacons en plastique avec une solution de 5 μg/mL de poly-D-lysine (PDL, dans l’eau stérile) pendant 1 h. Ajouter 1,5 mL de cette solution (ligand) par 35 mm de diamètre, 3 mL par plat de 60 mm de diamètre et 10 mL par 75 cm² flacon de culture.
2. Lavez la vaisselle et les flacons 2x avec de l’eau stérile.
3. Laissez-les sécher dans l’armoire de biosécurité pendant 1 h (ou jusqu’à ce qu’ils soient secs) et rangez-les dans la chambre froide à 4 ° c jusqu’à utilisation ultérieure.

5. prolifération et milieu de différenciation des cellules progénitrices des oligodendrocytes murins

1. Préparer 50 mL de solutions 100X du milieu de prolifération et de différenciation, faire des aliquotes de 2,5 mL et les entreposer à-80 ° c.
   NOTE: la composition du milieu de prolifération est de 0,1 mg/mL de sérum albumine bovine, 62 ng/mL de progestérone, 16 μg/mL de putrescine, 5 μg/mL d’insuline, 50 μg/mL de Holo-transferrine, 5 ng/mL de sélénite de sodium, 1x pénicilline-streptomycine, 10 ng/mL de croissance facteur de croissance des fibroblastes de 10 ng/mL dans le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec un taux élevé de glucose et de pyruvate. Alors que l’albumine sérique bovine, la progestérone, la putrescine et la sélénite de sodium peuvent être constituées et entreposées à 100X, l’insuline, l’Holo-transferrine et la pénicilline-streptomycine doivent être ajoutées fraîches tout en préparant la solution 1x. Les facteurs de croissance doivent être constitués à 10 μg/mL et doivent être ajoutés chaque jour aux cellules (1 μL/mL de milieu). La composition du milieu de différenciation est de 0,1 mg/mL d’albumine sérique bovine, 62 ng/mL de progestérone, 16 μg/mL de putrescine, 5 μg/mL d’insuline, 50 μg/mL de Holo-transferrine, 5 ng/mL de sélénite de sodium, 1x pénicilline-streptomycine, 400 ng/mL de triiodothyronine, 400 ng/mL L-thyroxine, et 0,5% de sérum bovin fœtal dans le DMEM avec un taux élevé de glucose et de pyruvate. La triiodothyronine et la L-thyroxine peuvent être constituées avec d’autres réactifs et stockées à 100X. L’insuline, la Holo-transférrine et la pénicilline-streptomycine doivent être ajoutées fraîches tout en préparant la solution 1x.
2. Pour préparer 50 mL de milieu de prolifération 100X, dissoudre 510 mg d’albumine sérique bovine dans 17 mL du milieu de Dulbecco, 310 μg de progestérone dans 31 μL d’éthanol, 80 mg de putrescine dans 500 μL de milieu de Dulbecco, 25 μg de sélénite de sodium dans 10 μL de milieu de Dulbecco et DMEM complet jusqu’à 50 mL
3. Pour préparer 50 mL de solution 100X de milieu de différenciation, dissoudre également 2 mg de triiodothyronine dans 40 μL d’hydroxyde de sodium et 2 mg de L-thyroxine dans 40 μL d’hydroxyde de sodium, puis remplir la solution à 50 mL avec le milieu de Dulbecco. Filtrer la solution à l’aide d’une unité de filtration jetable stérile, aliquote, et stocker les aliquotes à-80 ° c.
4. Pour préparer 250 mL de 1x milieu de prolifération/différenciation, mélanger 2,5 mL de solution 100X de milieu de prolifération/différenciation avec 12,5 mg de Holo-transferrine, 125 μL de 10 mg/mL d’insuline et 2,5 mL de 100X de pénicilline-streptomycine. Remplissez la solution à 250 mL avec le support de Dulbecco et filtrez-la à l’aide d’une unité de filtration jetable stérile.
   NOTE: les facteurs de croissance doivent être ajoutés frais et directement à la culture cellulaire, pas à l’ensemble du lot de milieu reconstitué.

6. culture cellulaire

1. Commencer par des cellules progénitrices d’oligodendrocytes suspendues dans le milieu de prolifération. Ensemencer ces cellules à une densité de 35 000 cellules/cm² sur des surfaces plastiques revêtues de PDL (plats ou flacons, voir rubrique 4). Ajuster le volume du milieu de prolifération à 3 mL par 10 cm² de la surface du substrat en plastique; un volume inférieur de milieu peut entraîner une agglutination cellulaire résultant de forces de tension superficielle, tandis qu’un volume plus élevé de milieu dans les plats peut provoquer des déversements.
2. Ajouter tous les jours des facteurs de croissance (facteur de croissance dérivé des plaquettes et facteur de croissance de la fibronectine), en maintenant leur concentration à 10 ng/mL et en changeant la moitié du milieu de prolifération sur des jours alternatifs.
3. Le troisième jour, détachez les cellules de la surface en plastique à l’aide d’une solution de détachement cellulaire douce (p. ex., accutase): retirer le milieu, laver 1x avec une solution saline tamponnée au phosphate, ajouter 1 mL de solution de détachement par zone de 20 cm² , laisser le plat/flacon dans un incubateur à 37 ° c pendant 10 min, et Tapotez doucement jusqu’à ce que toutes les cellules se soient détachées (Regardez sous un microscope).
4. Pipetter à l’aide d’une pointe de 200 μL pour briser les touffes dans des cellules individuelles, les transférer dans un tube de 50 mL, les diluer dans un milieu de prolifération, tourner à 0,2 x g pendant 10 min, jeter le surnageant, et Resuspendre le culot en milieu de prolifération pour obtenir un volume total de 1 ml. Comptez les cellules à l’aide d’un cytomètre.
5. Laver les plaques de polydiméthylsiloxane fonctionnalisées par la fibronectine 2x, 15 min par lavage, avec un milieu de prolifération.
6. Semences 35 000 cellules par plaque de polydiméthylsiloxane dans 700 μL de milieu de prolifération.
7. Ajouter une construction de plasmide de H2B-GFP pour étiqueter l’histone H2B avec la protéine fluorescente verte.
   NOTE: ici, 1,4 μL de mélange de transfection de CellLight H2B-GFP BacMam2 a été ajouté à chaque plaque (2 μL par 50 000 cellules).
8. Après 24 h, montez les échantillons de polydiméthylsiloxane avec des cellules à étirer sur le dispositif de déformation uniaxiale (comme illustré à la figure 2D). Changez le milieu dans tous les échantillons en milieu de différenciation.
9. Pour filtrer les échantillons, mesurez la longueur du compartiment cellulaire non tendu (figure 3A) et tournez la vis du micromètre de scène pour augmenter la longueur du compartiment cellulaire de la quantité désirée (p. ex., 10%, voir la figure 3b). Laisser les échantillons de polydiméthylsiloxane étirés et non étirés dans l’incubateur à 37 ° c jusqu’à l’imagerie.

7. l’imagerie

1. Allumez le microscope. Réglez la température de l’incubateur de microscope à 37 ° c.
2. Amenez l’objectif à utiliser (immersion de l’huile 100X) à la position centrale car la tourelle objective ne sera pas accessible ultérieurement. Dévissez l’objectif et revissez-le ensemble avec un anneau objectif (figure 4a) afin que l’objectif puisse être rapproché des cellules. Si un objectif d’huile est utilisé ici, ajoutez une goutte d’huile à cette étape.
3. Synthétiser à l’avance (via l’impression 3D ou l’usinage) un support en plastique ou en métal qui a deux caractéristiques importantes — une fenêtre inclinée et une étape (figure 4b).
   Remarque: la fenêtre prend en charge une épaisseur #0 un rebord en verre qui tiendra le support tandis que le dispositif de déformation est dans un État inversé. La coupe angulaire aux bords de la fenêtre (figure 4D) permet à l’objectif de se rapprocher du rebord en verre. L’étape dans le support nous permet d’amener le polydiméthylsiloxane étiré plus bas, plus près de l’objectif.
4. Placer une bavette en verre (épaisseur #0, avec des dimensions de 25 mm x 25 mm ou 35 mm de diamètre) sur la surface supérieure du support en étalant la graisse sous vide à la périphérie de la fenêtre (figure 4C), et collez la fenêtre en plastique sur l’étape du microscope ( Figure 4D et figure 5A).
5. Visser une étape de translation zsur l’étape du microscope et la déplacer vers la position zla plus haute (figure 5A).
6. Retirer 500 μL du milieu de la plaque de polydiméthylsiloxane étirée à imagé et ajouter ce milieu sur le rebord en verre dans la fenêtre en plastique blanc.
7. Détachez délicatement le compartiment carré de la plaque de polydiméthylsiloxane avec des pinces stériles.
8. Tenez le dispositif de déformation en position verticale (cellules orientées vers le haut) au-dessus de la fenêtre en plastique blanc et inversez prudemment le dispositif de déformation de façon à laisser tomber tout support supplémentaire directement au milieu de la bavette en verre (figure 5B) (les cellules orientées vers le bas).
9. Placez la partie inférieure du dispositif de déformation sur la phase z-translation avec le ruban adhésif double face (Figure 5C, D).
10. Tout en regardant à travers l’oculaire sous fond clair, amenez lentement le dispositif de déformation vers le bas (figure 5e) (en abaissant la phase de traduction z) et déplacez l’objectif jusqu’à se concentrer sur les cellules.
    1. Effectuez cette étape très lentement, étape par étape. Si le dispositif de déformation presse trop sur la bavette, les cellules peuvent être compressées (provoquant leur mort) et si l’objectif presse trop sur la bavette, la lamelle peut se briser (causant le moyen de fuite et de déversement sur l’objectif).
11. Scannez la plaque de polydiméthylsiloxane dans les directions xet ypour trouver une cellule qui a un noyau fluorescent (sous épifluorescence avec 488 nm d’excitation de longueur d’onde) et une morphologie cellulaire appropriée (sous fond clair).
12. Si le déplacement latéral de l’étape du microscope n’affecte pas trop la focalisation verticale, sélectionnez plusieurs régions d’intérêts en utilisant une fonction multipoint sur le logiciel. Parfois, la focalisation est très sensible à tout déplacement latéral de la scène. Dans de tels cas, l’image d’une cellule à la fois. Marquez les positions x, yet zpour chaque cellule d’intérêt.
13. Enregistrer des images à champ large (ou à trou ouvert) du noyau avec 488 nm d’excitation de longueur d’onde et de la cellule avec excitation de champ clair à des intervalles de 30 s par trame pour une durée totale d’au moins 30 min.

8. analyse des données

1. Fluctuations nucléaires
   1. Ouvrez la séquence des images de noyau (figure 6A) dans un logiciel d’analyse d’image et le seuil des images de temps-lapse de noyau (par exemple, employez la commande de seuil dans ImageJ ou la commande de GRAYTHRESH dans le logiciel Matlab).
   2. Obtenez la zone du noyau (en pixels) en fonction du temps, tracez-la dans un logiciel de traçage de données (figure 6B) et adaptez un polynôme de troisième ordre aux données (figure 6C) (par exemple, utilisez l' analyse | Raccord | Polynomial fit dans Origin ou la commande polyfit dans le logiciel Matlab).
   3. Soustrayez la valeur du polynôme ajusté de la zone réelle (en pixels) pour chaque point de temps. Cette zone corrigée est connue sous le nom de zone résiduelle.
      Remarque: ce processus élimine toute tendance croissante ou décroissante dans les données provenant des erreurs instrumentales et est appelée detendance.
      1. Calculez le pourcentage de la zone résiduelle en divisant la zone résiduelle à chaque point de temps avec la valeur du polynôme ajusté à ce point de temps (Figure 6d).
   4. Calculez l’écart type de la série temporelle de la zone résiduelle. Cet écart-type indique l’amplitude des fluctuations nucléaires.
2. Traçage de données et analyse statistique
   1. Calculer l’amplitude des fluctuations nucléaires comme une moyenne d’au moins 20 noyaux par condition.
   2. Effectuer un test statistique d’analyse de variance à sens unique avec la correction Bonferroni pour déterminer s’il existe une différence significative dans l’amplitude des fluctuations en fonction des conditions d’intérêt (par exemple, avec et sans souche appliquée).

Résultats

Des travaux récents visant à étudier l’effet de la contrainte de traction sur les oligodendrocytes¹⁰ ont montré qu’une souche de traction uniaxiale de 10% favorise la différenciation des cellules progénitrices d’oligodendrocytes par des changements globaux dans l’expression des gènes. Le mécanisme derrière ces changements dans l’expression génique peut être sondé par l’imagerie des paramètres subcellulaires, tels que la structure du cytosquelette, la localisation d...

Discussion

Un dispositif a déjà été conçu pour l’application de souches de traction extracellulaires sur les cellules adhérentes. La conception du substrat du polydiméthylsiloxane dans ce travail était suffisante pour les dosages biochimiques, ainsi que pour l’imagerie à basse résolution des cellules étirées. Dans ce travail, le substrat a été remanié, et une nouvelle configuration d’imagerie qui facilite l’imagerie cellulaire sous-cellulaire à haute résolution a été introduite. Les avantages de ce système s...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
fortes			Cellules progénitrices primaires d’oligodendrocytes isolées de rats nouveau-nés ont été fournies par le laboratoire du Dr S. Y. Chew à l’Université technologique de Nanyang
Media
DMEM high  ; glucose	Gibco	11996-065-500ml
Pen/Strep	Gibco	15070-063-100ml
FGF	Prospec	CYT-608-50ug
PDGF	Prospec	CYT-776-10ug
Media Stock components
BSA	Sigma	A9418-10G
Progestérone	Sigma	P8783-1G
Putrescine	Sigma	P5780-5G
Sélénite de sodium	Sigma	S5261-10G
Tri-iodothyronine	Sigma	T6397-100MG
Thyroxine	Sigma	T1775-100MG
Holo-Transferrine	Sigma	T0665-500MG
Insuline	Sigma	I9278
Moule et plaque
PDMS - Dow Corning Sylgard 184	Ellsworth	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Moule - Plastique liquide	Smooth-On	Smooth Cast 310 - Trail Size
Substrate Coatings
poly-D-lysine	Sigma	P6407-5MG
Fibronectin	Sigma	F1141-2MG
strong>Histone staining
CellLigt H2B-GFP BacMam	Sondes moléculaires	C10594
Fonctionnalisation de surface
APTES	Sigma	A3648-100ml
BS3	Covachem	13306-100mg
HEPES buffer pH 8.0	Alfa Aesar	J63578-AK-250ml
Décollement cellulaire
Accutase	Invitrogen	A1110501-100ml