Imagerie de la dynamique du calcium dans les sous-populations de cellules d'islet pancréatique de souris

Alexander Hamilton; Elisa Vergari; Caroline Miranda; Andrei I. Tarasov

doi:10.3791/59491

Article de méthode

Imagerie de la dynamique du calcium dans les sous-populations de cellules d'islet pancréatique de souris

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DOI :

10.3791/59491

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26 novembre 2019

Alexander Hamilton¹^,² , Elisa Vergari¹ , Caroline Miranda³ , Andrei I. Tarasov¹^,⁴^,⁵

¹Oxford Centre for Diabetes, Endocrinology and Metabolism, University of Oxford, ²Lund University Diabetes Centre, Unit of Molecular Metabolism, Clinical Research Centre, Malmö University HospitalMalmö, ³Institute of Neuroscience of Physiology, Department of Physiology, Metabolic Research Unit, University of Göteborg, ⁴Oxford National Institute for Health Research, Biomedical Research Centre, ⁵Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour la formation image et la quantification de la dynamique du calcium dans les populations cellulaires hétérogènes, telles que les cellules des isfètes pancréatiques. Les reporters fluorescents sont livrés dans la couche périphérique des cellules dans l'înet, qui est alors immobilisé et image, et l'analyse par cellule de la dynamique de l'intensité de fluorescence est effectuée.

Résumé

Les hormones pancréatiques d'istique règlent l'homéostasie de glucose sanguin. Les changements dans la glycémie induisent des oscillations du calcium cytosolique dans les cellules des îcles pancréatiques qui déclenchent la sécrétion de trois hormones principales : l'insuline (à partir des cellules de l'A), le glucagon (cellules de l'A) et la somatostatine (cellules). Les cellules, qui constituent la majorité des cellules des îcaux et sont couplées électriquement les unes aux autres, répondent au stimulus de glucose en tant qu'entité unique. L'excitabilité des sous-populations mineures, des cellules et des cellules (qui représentent environ 20 % (30 %) et 4% (10%) du nombre total total de cellules d'înce de rongeur¹ (humain²) est moins prévisible et est donc d'un intérêt particulier.

Les capteurs de calcium sont livrés dans la couche périphérique des cellules dans l'înisolé. L'îlots ou un groupe d'îlots est ensuite immobilisé et photographié à l'aide d'un microscope à fluorescence. Le choix du mode d'imagerie se situe entre un débit plus élevé (champ large) et une meilleure résolution spatiale (confocale). Traditionnellement, la microscopie confocale de balayage laser est employée pour le tissu d'imagerie, car elle fournit la meilleure séparation du signal entre les cellules voisines. Un système à champ large peut également être utilisé, si le signal contaminant de la population dominante de cellules de l'A est réduit au minimum.

Une fois que la dynamique calcique en réponse à des stimuli spécifiques a été enregistrée, les données sont exprimées sous forme numérique comme intensité de fluorescence par rapport au temps, normalisée à la fluorescence initiale et corrigée de base, afin d'éliminer les effets liés au blanchiment de la Fluorophore. Les changements dans la fréquence de pointe ou la zone partielle sous la courbe (pAUC) sont calculés par rapport au temps, pour quantifier les effets observés. pAUC est plus sensible et assez robuste tandis que la fréquence de pointe fournit plus d'informations sur le mécanisme de l'augmentation du calcium.

Des sous-populations cellulaires mineures peuvent être identifiées à l'aide de réponses fonctionnelles à des composés marqueurs, comme l'adrénaline et la ghréline, qui induisent des changements dans le calcium cytosolique dans une population spécifique de cellules d'éclet.

Introduction

Le but de la méthode est d'imager les changements en temps réel de la concentration cytosolique de calcium ([Ca^2']_cyt) dans les sous-populations mineures des cellules pancréatiques d'îcle. Cela permet de découvrir les mécanismes régissant la sécrétion hormonale dans ces cellules, révélant des détails sur le cross-talk entre les différents types de cellules et, potentiellement, l'introduction d'une dimension populationdans l'image plus large de la signalisation des îîaux.

Les îlots se composent de plusieurs types de cellules. Outre les cellules plus connues de sécrétion d'insuline, il existe au moins deux sous-populatio....