Présenté ici est un protocole pour l’édition efficace de gène de ribonucleoprotein-mediated de CRISPR/Cas9 dans les cellules mammifères utilisant l’électroporation de tube.
Les nucléases d’édition génique, représentées par la protéine 9 associée au CRISPR (Cas9), deviennent des outils courants dans la recherche biomédicale. La livraison réussie d’éléments CRISPR/Cas9 dans les cellules cibles par transfection est une condition préalable à une édition efficace des gènes. Ce protocole démontre que l’électroporation par tube (TE) de la livraison par machine de CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), ainsi que des modèles de donneurs d’oligodeoxynucleotide (ssODN) à un seul brin, mènent à des modèles de donneurs robustes événements précis d’édition de gènes. Tout d’abord, TE a été appliqué pour délivrer CRISPR/Cas9 RNP et ssODNs pour induire des mutations pathogènes dans le gène gamma de sous-unité de récepteur d’interleukine 2 (IL2RG) et le gène de réductase de sépiapterin (SPR) dans les cellules de fibroblaste de lapin. Des taux précis de mutation de 3.57%-20% ont été réalisés comme déterminé par le séquençage bactérien de clonage de TA. La même stratégie a ensuite été utilisée dans les iPSC humains sur plusieurs gènes cliniquement pertinents, y compris le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), la protéine de liaison de la myosine C, cardiaque (Mybpc3), et l’hémoglobine subunit bêta (HBB). Des taux de mutation constants et très précis ont été atteints (11,65 % à 37,92 %) déterminé séquençage profond (DeepSeq). Les travaux actuels démontrent que l’électroporation de tube de CRISPR/Cas9 RNP représente un protocole efficace de transfection pour l’édition de gène dans les cellules mammifères.
CRISPR/Cas9 est la nucléase programmable la plus couramment utilisée pour l’édition de gènes. Il fonctionne à travers la reconnaissance à l’ARN (sgRNA) à guide unique des deux séquences cibles et d’une séquence adjacente de motif adjacent de motif de protospacer (PAM) dans le génome. La nucléase Cas9 génère une rupture d’ADN à double brin (DSB) située trois nucléotides en amont de la séquence PAM1. Les ORD sont réparés soit par des voies de jointure non homologue (NHEJ) sujettes aux erreurs, soit par des voies de réparation dirigées par homologie (HDR). Pour obtenir une modification précise des gènes par la voie HDR, les modèles de donneurs sont souvent fournis sous forme d’ADN plasmide (pDNA) ou d’oligodeoxynucléotide à brin unique (ssODN).
CRISPR/Cas9 et le sgRNA peuvent être livrés aux cellules en trois formats : le complexe de ribonucléoprotéines (RNP) de protéines Cas9 et de gRNA2,3; Cas9 ARNm et sgRNA4,5; ou plasmide ADN (pDNA) qui contient les promoteurs nécessaires, conduit sgRNA, et Cas9 région de codage6,7,8. De nombreux groupes ont démontré que lorsque CRISPR/Cas9 est livré en tant que RNP, l’efficacité d’édition de gènes surpasse souvent ceux obtenus dans les formats pDNA ou ARNm, attribuable s’il est beaucoup plus petit que les acides nucléiques9. En outre, il a été précédemment démontré qu’une nouvelle machine d’électroporationde tube (TE) est particulièrement efficace dans les applications d’édition de gène dans plusieurs types de cellules 9.
Présenté dans le présent travail est un protocole étape par étape dans l’utilisation de TE pour la livraison de CRISPR/Cas9 RNP aux cellules mammifères de différentes espèces à plusieurs loci cliniquement pertinents. Cette nouvelle technique de transfection TE et phénomène de taux élevé de HDR peuvent trouver de larges applications dans la recherche biomédicale.
La méthode d’électroporation de tube a été efficace en fournissant LE RNP de CRISPR/Cas9 et les ssODNs au lapin et aux cellules humaines, menant à l’édition précise précise de gène (PGE). La principale différence entre TE et d’autres dispositifs d’électroporation conventionnels est l’utilisation d’un tube, dans lequel deux électrodes sont sur le dessus et le bas du tube et l’échantillon est chargé en entier puis scellé lors de l’électroporation (Figure 1). En revanche, dans une cuvette conventionnelle, les électrodes sont sur les côtés et l’échantillon n’est pas entièrement scellé lors de l’électroporation. Cette nouvelle conception réduit la génération de bulles d’air et comprime la taille des bulles d’air, ce qui améliore par conséquent même la distribution de la tension électrique, et conduit ainsi à la mort cellulaire réduite et l’efficacité de transfection élevée9. Dans le présent travail, des taux élevés de PGE (15%-37%) ont été atteints en ciblant les gènes EGFR, Mybpc3 et HBB dans les iPSC humains. Ces résultats sont compatibles avec un rapport antérieur dans lequel des taux élevés de PGE ont été atteints dans les cellules souches humaines9.
Des mutations pathogènes ont été ciblées dans les gènes IL2RG et SPR dans les cellules de lapin. Récemment, les lapins IL2RG-knockout ont été produits comme modèles pour l’immunodéficience combinée grave X-liée humaine (SCID-X1)16,17. Les travaux actuels montrent que les mutations DU patient IL2RG (p. ex. C231Y et Q235X) peuvent être générées efficacement dans les cellules de lapin, démontrant ainsi la faisabilité de créer des modèles de lapins SCID-X1 porteurs de mutations patientes. Il a également été démontré que les mutations SPR R150G peuvent être efficacement créées dans les cellules de lapin. Cette mutation provoque des déficits moteurs et cognitifs chez les enfants12. Ces modèles de lapin mutation IL2RG et SPR, une fois générés, peuvent servir de modèles précliniques précieux pour les études translationnelles. Ils peuvent également être utilisés pour établir des thérapies basées sur l’édition génétique pour ces maladies monogéniques.
L’une des préoccupations concernant les applications d’édition de gènes à médiation CRISPR/Cas9 est les événements d’édition hors cible. Les taux d’indel ont été analysés dans les sites hors cible prévus pour les sgARN utilisés dans cette étude (tableau S1), en utilisant des méthodes précédemment décrites9. Au total, sept loci potentiels hors cible ont été analysés pour sg-rb-IL2RG-01, cinq pour sg-rb-SPR, sept pour sg-hEGFR, cinq pour sg-hMybpc3, et sept pour sg-hHB), en utilisant les amorces énumérées dans le tableau S2. Aucun indel hors cible n’a été révélé par les essais T7E1 (Figure S1), indiquant des risques minimes hors cible pour l’édition génétique à médiation CRISPR/Cas9 à l’aide de ces sgRNAs. Il indique également que la méthode d’électroporation du tube elle-même ne provoque pas ou n’augmente pas les modifications hors cible. Néanmoins, des efforts devraient être consacrés à la réduction ou à l’élimination des modifications indésirables hors cible. Le séquençage du génome entier peut être nécessaire pour exclure de tels événements pour les cellules qui sont destinées à être utilisées dans des applications cliniques.
Au niveau technique, les facteurs suivants sont considérés comme des facteurs clés pour atteindre l’édition efficace et précise du génome par l’électroporation du tube CRISPR/Cas9 RNP. Tout d’abord, il est conseillé de sélectionner un sgRNA efficace avec un faible potentiel hors cible prévu. Il est important de valider l’efficacité indel de l’ARSS sélectionné avant de l’utiliser pour les applications PEG. Il n’est pas rare qu’un logiciel prédit bon sgRNA échoue à l’étape de validation.
Deuxièmement, pour atteindre le PGE élevé, il est recommandé d’induire une mutation de PAM au donateur de ssODN chaque fois que possible. La raison en est que, ce faisant, CRISPR/Cas9 recoupe après l’intégration des modèles de donneurs est empêchée. Dans certains cas, le PGE lui-même introduit des mutations PAM. Dans d’autres cas, il est possible d’introduire des mutations silencieuses dans la séquence PAM. Dans le cas où une mutation PAM n’est pas possible, il est conseillé d’essayer d’inclure plusieurs mutations silencieuses dans le donneur qui correspond à la séquence sgRNA.
Troisièmement, particulièrement pertinent pour TE, il est important d’éviter la formation de bulles d’air lors du transfert des cellules et du mélange RNP au tube d’électroporation. Tandis que la conception d’un tube de TE minimise déjà la formation de bulle d’air, la manipulation soigneuse réduira davantage et peut même accomplir éviter la formation de bulle d’air. Un guide de prise de vue de difficulté pour des problèmes fréquents qui peuvent être rencontrés dans l’application de l’électroporation de tube pour CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein négocié l’édition précise de gène est fourni dans le tableau 2.
En conclusion, il est démontré ici que l’électroporation de tube est un moyen efficace pour la livraison de CRISPR/Cas9 RNP et de ssODNs aux cellules mammifères pour atteindre des taux élevés de PGE. Cette nouvelle technique de transfection TE et son taux d’édition génétique précis et robuste peuvent faciliter le développement d’applications d’édition de gènes.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (R21OD023194 à JX). Ce travail a utilisé les services de base soutenus par center for Advanced Models for Translational Sciences and Therapeutics (CAMTraST) au Centre médical de l’Université du Michigan.
Accutase | STEMCELL Technologies | 792 | Cell detachment solution for human iPSCs, first used in Step 1.1.2. |
Cas9 Nuclease 3NLS | IDT | 1074182 | Cas9 protein, first used in Step 3.3. |
DMEM | Thermo Fisher | 11965092 | For cell culture, first used in Step 1.2.3. |
DPBS | Thermo Fisher | 1708075 | For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2. |
EDTA | Lonza | 51201 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
Electroporation buffer | Celetrix | 13–0104 | The electroporation buffer, first used in Step 3.2. |
Electroporation tubes | Celetrix | 20 μL: 12–0107; 120 μL: 12–0104 | The electroporation tube, first used in Step 3.4. |
Electroporator | Celetrix | CTX-1500A LE | The tube electroporation machine, first used in Step 3.5 |
Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | For cell culture, first used in Step 1.2.2. |
Forma CO2 Incubators | Thermo Fisher | Model 370 | For cell culture, first used in Step 1.1. |
Gel Extraction Kit | Qiagen | 28115 | For gel purification, first used in Step 4.3. |
Human induced pluripotent stem cells | American Type Culture Collection | ACS-1030 | Human iPSCs, first used in Step 1.1. |
Matrigel | Corning | 354277 | Artificial extracellular matrix; for precoating cell culture plate, first used in Step 1.1. |
mTeSR 1 medium | STEMCELL Technologies | 85850 | Feeder-free cell culture medium for human iPSCs, first used in Step 1.1. |
PCR SV mini | GeneAll | 103-102 | For PCR product purification, first used in Step 4.3. |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2. |
Phenol-chloroform | Thermo Fisher | 15593031 | For DNA extraction, first used in Step 4.2. |
Precision gRNA Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For the generation of full length gRNA (guide RNA), first used in Step 2.4. |
Proteinase K Solution | Thermo Fisher | AM2548 | For DNA extraction, first used in Step 4.1. |
Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491 | For PCR amplification, first used in Step 4.3. |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
TA Cloning Kit | Thermo Fisher | K457502 | For TA clone sequencing, first used in Step 4.4. |
Tissue Culture Dish (10 cm) | FALCON | 353003 | For cell culture, first used in Step 1.2.3. |
Tissue Culture Dish (12 well) | FALCON | 353043 | For cell culture, first used in Step 3.7. |
Tissue Culture Dish (6 cm) | FALCON | 353004 | For cell culture, first used in Step 1.2.2. |
Tris HCl | Thermo Fisher | BP1757-500 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200056 | For cell digestion, first used in Step 1.2. 4. |
Universal Fit Pipette Tips | Celetrix | 14-0101 | For electroporation, first used in Step 3.4. |
Y27632 | LC Labs | Y-5301 | The apoptosis inhibotor, first used in Step 1.1.1. |