Le but de ce protocole est de génotype de l'anémone de mer Nematostella vectensis pendant la gastrulation sans sacrifier l'embryon.
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Article de méthode
Génotypage de l'anémone de mer pendant le développement précoce
Dans cet article
Résumé
Résumé
Décrit ici est un protocole PCR-basé pour génotype l'embryon de stade de gastrula du vectensis cnidaire anthozoan nematostella sans sacrifier la vie de l'animal. Après la fécondation in vitro et la dégelée, les zygotes sont autorisés à se développer pendant 24 h à température ambiante pour atteindre le stade précoce à moyen-gastrula. Les embryons de gastrula sont ensuite placés sur un lit de gel d'agarose dans un plat Petri contenant de l'eau de mer. Sous le microscope disséquant, une aiguille de tungstène est utilisée pour séparer chirurgicalement un fragment de tissu aboral de chaque embryon. Les embryons post-chirurgical sont ensuite autorisés à guérir et à poursuivre leur développement. L'ADN génomique est extrait du fragment de tissu isolé et utilisé comme modèle pour le PCR spécifique au locus. Le génotype peut être déterminé en fonction de la taille des produits PCR ou de la présence ou de l'absence de produits PCR spécifiques à l'allèle. Les embryons post-chirurgical sont ensuite triés en fonction du génotype. La durée de l'ensemble du processus de génotypage dépend du nombre d'embryons à dépister, mais il faut au minimum 4 à 5 h. Cette méthode peut être utilisée pour identifier les mutants knock-out d'une population génétiquement hétérogène d'embryons et permet d'analyser les phénotypes au cours du développement.
Introduction
Les Cnidariens représentent un groupe diversifié d'animaux qui comprennent les méduses, les coraux et les anémones de mer. Ce sont des diploblastes, composés d'ectoderm et d'endoderm qui sont séparés par une matrice extracellulaire (mesoglea). Cnidaria est un groupe sœur pour spécifier Bilateria, à laquelle les modèles animaux traditionnels tels que Drosophila et Mus appartiennent1. En outre, on pense que la divergence Cnidaria-Bilateria s'est produite dans la période précambrienne2. En tant que tel, les études comparatives des cnidaires et des bilateriens sont essentielles pour obtenir des perspicacité....
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Protocole
1. Induction du frai, de la fécondation in vitro et de la dégelée
- Maintenir Nematostella vectensis dans l'eau de mer avec une salinité de 12 parties par millier (ppt) dans l'obscurité à 16 oC, alimentant Artemia tous les jours.
- La veille de l'induction du frai, placez les animaux dans un incubateur à température et à lumière. Programmez l'incubateur de sorte que les animaux soient exposés à 8 h de lumière à 25 oC. Facultatif : Nourrissez un petit morceaud'huître (1 mm 3) d'huîtres à des animaux individuels avant de les placer dans l'incubateur pour améliorer le frai.
- Laisser les animaux dans l'incubat....
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Résultats
Le génome de Nematostella a un locus unique qui code une protéine précurseur pour le gLWamide neuropeptide. Trois alleles mutants knock-out à ce locus (glw-a, glw-b, et glw-c) ont été précédemment signalés5. Quatre mâles hétérozygotes portant un allèle de type sauvage (en) et allèle à élimination bée-c-cau locus gLWamide (génotype : ' ' ''' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' .......
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Discussion
Décrit ici un protocole basé sur PCR pour génotyper un seul embryon d'anémone de mer sans sacrifier l'animal. Après le frai et la dégelée, les œufs fécondés sont autorisés à se développer en gastrulae. La région aboral de chaque embryon de gastrula est enlevée chirurgicalement, et le tissu aboral isolé est employé pour l'extraction génomique suivante d'ADN, tandis que les embryons post-chirurgicaux restants guérissent et continuent le développement. Les extraits de gDNA sont ensuite utilisés pour un test PCR pour détermi.......
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Déclarations de divulgation
L'auteur n'a rien à révéler.
Remerciements
Nous remercions les critiques anonymes pour les commentaires sur la version antérieure du manuscrit, qui a amélioré le manuscrit. Ce travail a été soutenu par des fonds de l'Université de l'Arkansas.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Drosophila Peltier Incubateur réfrigéré | Shellab | SRI6PF | Utilisé pour l’induction du frai |
| Sel de mer de mer | instantané Océan instantané | 138510 | |
| Kystes de crevettes de saumure | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| Chlorhydrate de L-cystéine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Agitateur orbital standard, modèle 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITÉ BIOLOGIQUE | 351-007-01 | |
| Chlorure de potassium | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitut | US Biological | N3500 | |
| Protéinase K solution (20 mg/mL), grade ARN | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Porte-aiguille de dissection | Roboz | RS-6060 | |
| Aiguille de dissection en tungstène | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermocyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion ADN polymérase haute fidélité | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5'- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3' | ||
| Amorce inversée spécifique à glw-a | 5'-CCAGATGCCTGGTGATAC-3' | ||
| Amorce inversée spécifique à glw-c | 5'- CGGCCGGCGCATATATAG-3' |
Références
- Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
- Erwin, D. H., et al.
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Réimpressions et autorisations
