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Article de méthode

Génération d’Organoïdes des voies biliaires extrahépatiques souris

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DOI :

10.3791/59544

⸱

23 avril 2019

 ,  ,  ,  , 
1Departments of Internal Medicine, The University of Michigan, 2Molecular & Integrative Physiology, The University of Michigan

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la production d’une souris biliaires extrahépatiques organoïde 3-dimensions. Ces organoïdes biliaires peuvent être maintenues en culture pour étudier la biologie cholangiocyte. Organoïdes biliaires expriment des marqueurs des cellules biliaires et géniteur et sont composées de cellules épithéliales polarisées.

Résumé

Cholangiopathies, d’affecter des canaux biliaires extrahépatiques (EHBDs), incluent l’atrésie des voies biliaires, la cholangite sclérosante primitive et cholangiocarcinome. Ils n’ont aucune option thérapeutique efficace. Outils pour étudier les EHBD sont très limitées. Notre but était d’élaborer un modèle de certains organes, polyvalent, adulte cholangiocyte de cellules souches dérivées, précliniques qui peut être facilement généré de type sauvage et des souris génétiquement modifiées. Ainsi, nous présentons la nouvelle technique de mettre au point un système de culture organoïde (EHBDO) EHBD de EHBDs de souris adulte. Le modèle est rentable, capable de doser facilement, et a de multiples applications en aval. Plus précisément, nous décrivons la méthodologie d’isolement EHBD souris et dissociation cellulaire unique, initiation de culture organoïde, propagation et maintenance à long terme et stockage. Ce manuscrit a aussi décrit EHBDO traitement pour immunohistochimie, microscopie fluorescente et quantification d’abondance ARNm en chaîne par polymérase quantitative en temps réel de la transcription inverse (qRT-PCR). Ce protocole a des avantages significatifs en plus de produire EHBD spécifique organoïdes. L’utilisation d’un milieu conditionné de cellules L-AVT réduit significativement le coût de ce modèle. L’utilisation de souris EHBDs fournit presque illimitée de tissus pour la production de la culture, à la différence des tissus humains. EHBDOs souris générés contiennent une population pure de cellules épithéliales avec des marqueurs de progéniteurs endodermiques et différencient de cellules biliaires. Organoïdes cultivées maintiennent morphologie homogène à travers les passages multiples et peuvent être récupérés après une longue période de stockage dans l’azote liquide. Le modèle permet l’étude de la prolifération des cellules progénitrices biliaire, peut être manipulé sur le plan pharmacologique et peut être généré à partir des souris génétiquement modifiées. Les études à venir sont nécessaires pour optimiser les conditions de culture afin d’accroître l’efficacité de l’électrodéposition, d’évaluer la maturité fonctionnelle cellulaire et la différenciation cellulaire directe. Développement de modèles de culture mixte et une matrice extracellulaire plus biologiquement neutre sont également souhaitables.

Introduction

Cholangiopathies sont incurables chroniques progressive des troubles qui affectent les cellules biliaires situés intra - et les canaux biliaires extrahépatiques (EHBDs)1. Certains cholangiopathies, tels que la cholangite sclérosante primitive, cholangiocarcinome, atrésie des voies biliaires et kystes cholédocien, affectent principalement EHBDs. Mise au point de thérapies pour les cholangiopathies est limitée par la disponibilité limitée des modèles précliniques. En outre, des études antérieures concentrent cholangiopathies regroupés : foie, intra- et EHBDs. Cependant, intra - et EHBDs ont une origine embryonnaire distinct et devraient donc être considérés comme des pathologies moléculaires distinctes. Voies biliaires intrahépatiques se développent à partir des plaques canalaires intrahépatiques et la partie crâniale du diverticule hépatique, EHBDs ensemble se développent à partir de la partie caudale du diverticule hépatique2. Ils comptent également sur les compartiments cellulaires différentes souches pour l’homéostasie adulte, y compris les canaux de Hering dans les voies biliaires intrahépatiques et glandes péribiliaires EHBDs2,3. Utilisation de modèles animaux pour des études précliniques est limitée par la dépense et devrait être réduite au minimum pour des raisons éthiques. Réductionniste, reproductible, temps et coût-efficace modèles in vitro sont donc hautement souhaitables.

La plupart des études préalables de cholangiopathies utilisé des souris normales ou modèles de cancer de rat ou lignées de cellules de cholangiocarcinome humain dérivées intra - et EHBDs4,5,6,7. Cependant, ceux-ci sont des modèles de cellules transformées et récapituler pas normal cholangiocyte biologie à l’homéostasie, ou dans un état sain. Les progrès récents dans l’élaboration de modèles de culture organotypique a permis le développement de structures 3D de types de tissus différents, y compris les tissus hépato-biliaire, bien que les souris normale non EHBDs8,9, 10. Ces structures en « orgue » visant à imitant le tissu principal et sont cultivés dans une niche artificielle soutenant l’auto-renouvellement des cellules de certains organes souches/progénitrices11.

« Organoïde » est un large mandat qui est plus communément décrit les modèles de tissus 3 dimensions dérivées de cellules souches. Organoïdes peut être généré de reprogrammé pluripotentes cellules souches représentée par des cellules souches embryonnaires et induit des cellules souches pluripotentes. Ils peuvent également être générés d’organe-spécifiques des cellules souches adultes12. Certains modèles d’organoïde cholangiocyte ont été proposées dans les études précédentes. Ainsi, organoïdes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines ont été déclarés7,9,13 et fournissent un outil efficace de temps précieux, qui permet la production simultanée de différents types cellulaires. Cependant, ces organoïdes de dérivés de cellules souches pluripotentes ne reflètent pas totalement la structure et les fonctionnalités de primaire adulte EHBD biliaires.

Organoïdes dérivées de cellules souches adultes de l' humain9 et féline10 du foie ont également été proposées. Féline de modèles ne sont pas largement disponibles et ont limité la panoplie d’outil à des fins d’étude. En outre, ces organoïdes de dérivés de cellules souches adultes provenant du foie ne pas poser biliaires extrahépatiques mais biliaires intrahépatiques plutôt.

Génération d’organoïde EHBD humaine normale EHBDs14 et la souris EHBD cholangiocarcinome15a été signalée. Cependant, l’accès pour les tissus humains de EHBD est extrêmement limité et organoïdes dérivés d’un modèle murin de cholangiocarcinome15 ne représentent pas de biologie cholangiocyte sain à l’homéostasie et proviennent de cellules génétiquement modifiées.

Pour pallier les lacunes des pluripotentes dérivées de cellules souches et de foie cholangiocyte organoïde modèles et l’accès limité aux tissus humains nécessaires dans les modèles précliniques, nous avons développé un modèle murin d’organoïde EHBD (Figure 1 a). Ce manuscrit décrit le développement d’une technique pour souris organoïdes EHBD dérivées de tissus adultes. Ces organoïdes EHBD nommés EHBDOs sera un outil important in vitro pour l’étude des mécanismes sous-jacents à l’EHBDs cholangiocyte l’homéostasie et maladie processus, tels que cholangiopathies.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université du Michigan.

1. préparation du matériel et matériaux pour l’Isolation EHBD souris

  1. Préparer les semis moyen et tampon de lavage (Table des matières) dans 50 mL tubes coniques et garder à 4 ° C ou sur la glace jusqu'à l’utilisation.
  2. Mettre en place une table d’opération chirurgicale (Figure 1 b). Préparer les instruments chirurgicaux stérilisés (Figure 1).
  3. Posez une plaque 24 puits stérile dans un incubateur à 37 ° C vitroplants de préchauffage il.
  4. Placer une aliquote de matrice de sous-sol sur la glace. Matrice de sous-sol utilisation uniquement lorsqu’il est complètement liquéfié.

2. EHBD isolement et biliaire Organoïde Culture

  1. Isolement et préparation d’une suspension monocellulaire de souris EHBD
    1. Euthanasier une souris adulte (plue de 2 mois) selon les directives institutionnelles. Placez votre souris en position couchée. Ouvrir la cavité abdominale à l’aide d’une approche de la ligne médiane et rétracter le foie au repos sur le diaphragme.
    2. Identifier le canal cholédoque situé immédiatement au-dessous du hile du foie en tirant doucement sur le duodénum proximal avec une pince hémostatique. Séparer les EHBD les tissus environnants à l’aide d’une lame de bistouri. Avec une pince en tenant l’extrémité proximale de la voie biliaire principale, il disséquer distalement juste au-dessus de sa jonction avec le duodénum, puis disséquer l’extrémité proximale de la gaine du foie (Figure 1). Placer immédiatement isolé EHBD (Figure 1E) dans cold tampon de lavage.
    3. Enlever le EHBD de la mémoire tampon de lavage et émincer en sections de 0,5 mm à l’aide d’une lame de bistouri stérile. Placer le tissu sur une plaque de verre sur la glace lors de la procédure (Figure 1 b).
    4. Placez les parties EHBD dans un tube contenant 500 µL de tampon de la dissociation. Incuber pendant 20 min à 37 ° C. Neutraliser le tampon de dissociation en ajoutant 500 µL de milieu de culture cellulaire glacée.
    5. Triturer la suspension cellulaire et descendre la progression à travers les aiguilles 18 G et 20 G, 20 fois chacun. Filtrer la suspension cellulaire à travers un tamis de cellule 70 µm et recueillir le cheminement dans un tube de 50 mL.
      Remarque : Pré-conditionner la crépine avec 500 µL de stérile saline tamponnée au phosphate (PBS) avant le filtrage pour faciliter le passage de la suspension cellulaire.
  2. Création d’EHBD organoïdes
    1. Centrifuger le cheminement de l’étape 2.1.5 à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C.
    2. Retirer délicatement le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de PBS stérile glacée. Transvaser la remise en suspension dans un nouveau tube de 1,5 mL. Répétez l’étape 2.2.1.
    3. Après centrifugation, retirez soigneusement le surnageant de cellules lavées recueillies dans le bas du tube. Resuspendre le culot de cellules dans 120 µL de matrice liquéfié sous-sol glacée de pipetage et descendre à l’aide de conseils P200.
      Remarque : Resuspension culot cellulaire dans la matrice de sous-sol doit être exécuté sur bain de glace.
    4. Plaque de 40 µL de la remise en suspension des cellules dans la matrice de sous-sol dans le centre d’un puits dans une plaque de 24 puits préchauffé.
      Remarque : Éviter l’aspiration d’air tout en manipulant la matrice du sous-sol pour éviter la formation de bulles.
    5. Retourner la plaque avec les cellules resuspendues dans la matrice du sous-sol à l’incubateur de vitroplants de 37 ° C pendant 15 min ou jusqu'à ce que la matrice de sous-sol est solidifiée. Ajouter 600 µL de milieu semi chauffé à 37 ° C dans chaque cupule (Table des matières). Remettez la plaque dans l’incubateur de vitroplants de 37 ° C.
    6. Remplacer le milieu d’ensemencement avec 600 µL de milieu de culture fraîche organoïde en 3 jours et ensuite tous les 3 jours. Surveiller la croissance organoïde avec un microscope inversé. Utilisation organoïdes pour une application en aval ou l’intermédiaire tous les 7 à 9 jours avant l’accumulation de la chute de débris et organoïde intraluminal sont observés (Figure 2 a).

3. EHBD Organoïde Passage et stockage

  1. Passage de EHBD organoïdes 1:3 à 1:4 tous les 7 à 9 jours
    1. Retirez le support du puits et ajouter 400 µL de PBS glacée. Resuspendre l’organoïdes de pipetage doucement le mélange de haut en bas 10 fois dans le puits. Transférer le mélange dans un tube de 1,5 mL.
    2. Passage le mélange à travers une aiguille 25 G 4 fois à se dissocier de l’organoids. Centrifuger le mélange à 400 x g pendant 4 min à 4 ° C.
    3. Retirer délicatement le surnageant et remettre en suspension les cellules dans la matrice de sous-sol (1:3 à 1:4) pour cultiver davantage (étape 2.2.4.) ou laver les cellules avec du PBS froid glace pour un traitement ultérieur.
      Remarque : En règle générale, les cellules de 250-300 sont plaqués dans la plaque 24 puits pour applications en aval. Efficacité de placage peut être évaluée par microscopie en champ clair à l’aide d’un microscope inversé du jour 3-5 après passage en comptant le nombre d’organoïdes et en calculant leurs pour cent du nombre de cellules initiales. ARNm peut être isolés des EHBDOs lavées dans du PBS en utilisant le protocole standard à l’aide de guanidinium extraction de thiocyanate-phénol-chloroforme.
  2. Entreposage à long terme des EHBD organoïdes
    1. Retirez le support du puits et laver l’organoïdes avec température ambiante PBS. Supprimer les PBS du puits sans déranger la goutte de matrice de sous-sol.
    2. Ajouter 500 µL de cellule glacée congélation moyen dans le puits. Resuspendre l’organoïdes dans la matrice de sous-sol liquéfié et cellule de congélation moyen doucement et transférer le mélange dans deux flacons cryogéniques.
    3. Conserver les flacons à-80 ° C pendant 48 h. transfert les flacons dans un réservoir d’azote pour le stockage à long terme dans une phase de vapeur.

4. EHBD Organoïde Pprocessing pour l’enrobage de paraffine

  1. Resuspendre les EHBDOs dans 500 µL de PBS glacée (4 ° C) en pipettant également, haut et bas de 5 à 10 fois. Recueillir des EHBDO remises en suspension dans la matrice de sous-sol liquéfié dans un tube de 1,5 mL.
    Remarque : Pour éviter de casser organoïdes, couper le fond de 2 à 3 mm d’une pointe de P1000 et éliminer le surnageant avec beaucoup d’attention.
  2. Centrifugeuse EHBD organoïdes à 350 x g pendant 5 min. Retirez soigneusement le surnageant sans déranger le culot organoïde.
  3. Ajouter 1 mL de paraformaldéhyde glacée de 4 % (PFA) pour l’organoïdes et incuber l’organoïdes chez 4 % PFA pour la nuit à 4° C. Enlever les 4 % PFA de l’organoïdes en utilisant un embout P1000 après incubation pendant la nuit.
  4. Ajouter 1000 µL de PBS de la température ambiante dans le tube avec l’organoïdes et incuber pendant 5 min à température ambiante (RT). Centrifuger le tube avec organoïdes dans du PBS à 350 x g pendant 5 min. répéter ce processus deux fois plus.
  5. Retirez les PBS et ajouter 1 mL d’éthanol à 30 % dans l’organoïdes. Incuber 5 min à température ambiante.
  6. Centrifuger le tube à 350 x g pendant 5 min à RT. enlever 30 % éthanol. Ajouter 1 mL d’éthanol à 70 % et incuber pendant 5 min à température ambiante.
  7. Centrifuger à 350 x g pendant 5 min. retirer éthanol à 70 %. Ajouter 1 mL d’éthanol à 100 % et incuber pendant 5 min à température ambiante.
    Remarque : Organoïdes peuvent être conservés dans de l’éthanol 100 % à la température ambiante jusqu'à 48 h avant traitement ultérieur.
  8. Chauffer l’échantillon gel de traitement dans un four à micro-ondes pendant 20 s ou jusqu'à ce que liquéfié. Ajouter 50 µL de gel dans le tube avec organoïdes de traitement des échantillons. Placer le tube sur la glace jusqu'à ce que le traitement gel des échantillons sont solidifié.
  9. Retirez la goutte de gel avec organoïdes du tube de traitement des échantillons et entre les coussinets éponge bleue dans une cassette pour un traitement ultérieur dans le processeur de tissu. Utilisez 15 min pour chaque étape de l’embedder paraffine pendant la poursuite de la procédure...
  10. Section organoïdes de paraffine dans le traitement des échantillons de gel à 4 µm. Procédez avec immunohistochemical souillant comme précédemment décrit16.

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Résultats

Notre protocole décrit la génération de souris EHBD organoïdes qui sont spécifiques des tissus et cellules souches dérivées d’adulte. Après que les organoïdes sont cultivées, une formation des structures kystiques peut être observée dès 1 jour après l’isolement du EHBD. Contamination par les fibroblastes n’est pas typiquement observée pendant la génération de la culture. EHBDO efficacité de placage est environ 2 % lorsqu’il est isolé depuis néonatale ou adulte (plus de 2 mois) souris (

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Discussion

Cet ouvrage décrit la génération d’un modèle 3-dimensional organotypique de souris EHBD biliaires. Des étapes importantes dans la production de la culture EHBDO incluent la dissection méticuleuse de EHBD pour éviter la contamination de cellules de pancréas, maintien des conditions stériles pour prévenir la contamination bactérienne et fongique et manipulation prudente après centrifugation afin d’éviter la perte du matériel cellulaire. Il faut une étroite adhésion aux conditions de température décrites. Il y a certaines l...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas des intérêts concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par l’Association américaine pour l’étude du foie, maladies Pinnacle prix (N.R.) et le National Institutes of Health, National Institute of Diabetes et Digestive and Kidney Diseases (prix DK34933 P30 à N.R., P01 DK062041 à J.L.M.). Nous remercions le Dr Ramon Ocadiz-Ruiz (Université du Michigan) pour son aide au développement de cette méthodologie.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Milieu de culture cellulaire L-WRN
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-010
Sérum fœtal bovin (FBS)1 %Life Technologies10437-028
Pénicilline-Streptomycine100 U/mLLife Technologies15140-122
Tampon de lavage
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)50 mLLife Technologies10010-023
Pénicilline-streptomycine125 U/mLLife Technologies15140-122
Amphotéricine B  ;6,25 et micro ; g/mLLife Technologies15290-018
L-WRN Milieu conditionné  ;1:1ATCCCRL-3276
Advanced DMEM/F121:1Life Technologies12634-010
Pénicilline-Streptomycine100 U/mLLife Technologies15140-122
N-Glutamine10 & micro ; l/mLLife Technologies35050-061
Acide sulfonique N-2-hydroxyéthylpipérazine-N-2-éthane, HEPES10 mMLife Technologies15630-080
B2710 µ ; l/mLGibco17504-044
N210 & micro ; l/mLGibco17502-048
Milieu de culture organoïde
Milieu de culture organoïde  ;
Facteur de croissance épidermique (EGF)50 ng/mLInvitrogenPMG8041
Facteur de croissance des fibroblastes-10 (FGF10)100 ng/mLPeproTech100-26
Anticorps primaires
Anti-Cytokeratin 19 (CK19), Rabbit1:250Abcamab53119
Région déterminant le sexe Anticorps Y-Box 9 (SOX9), Lapin1:200Santa Cruzsc-20095
Anticorps anti-homeobox 1 (PDX1) du duodénal pancréatique, Lapin1:2000DSRBF109-D12
Anticorps E-cadhérine, Chèvre1:500Santa Cruzsc-31020
Anticorps acétylé &alpha ;-tubuline, souris1:500Sigma-AldrichT6793
Anticorps
488 étiqueté anti-lapin, Donkey IgG1:1000InvitrogenA-21206
594 étiqueté anti-chèvre, Donkey IgG1:1000InvitrogenA-11058
568 étiqueté anti-souris, Chèvre IgG2b1:500InvitrogenA-21144
TopFlash Wnt reporter assay
TopFlash HEK293 cell lineATCCCRL-1573
de dosage de la luciféraseBiotium30003-2
0,05 % Trypsine-EDTALife Technologies25300054
0,4 % Trypan Blue SolutionLife Technologies15250061
Matériaux et réactifs supplémentaires
Matrice de base, sans phénol MatrigelCORNING356237
Tampon de dissociation, AccutaseGibcoA1110501
Milieu de congélation pour culture cellulaire, RecoveryLife Technologies12648010
Passoire cellulaire (70 & micro ; m, stérilisé)Fisherbrand22363548
Extraction de l’ARN du thiocyanate-phénol de guanidinium, TRIzolInvitrogen15596026
Gel de traitement des échantillons, HistoGelThermo Fisher ScientificHG-4000-012
Kit universel de détection de mycoplasmesATCC30-1012K
05-408-129
24 puitsUSA ScientificCC7682-7524
Tube à centrifuger conique de 50 mLFisher scientific14-432-22
secondairesKit Tube de microcentrifugation de 1,5 mL Fisherbrand Plaque àMicroscope à fluorescence Nikon Eclipse E800 Microscope inversé Biotium 30003-2 Plateau de nécropsie Fisherbrand 13-814-61

Références

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