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Article de méthode

Culture cellulaire bactérienne au niveau unicellulaire à l'intérieur des vésicules géantes

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DOI :

10.3791/59555

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30 avril 2019

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1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2Department of Life Science and Medical Bioscience, Waseda University

Dans cet article

Résumé

Nous démontrons la culture unicellulaire des bactéries à l'intérieur des vésicules géantes (GM). Les GV contenant des cellules bactériennes ont été préparés par la méthode de transfert de gouttelettes et ont été immobilisés sur une membrane soutenue sur un substrat en verre pour l'observation directe de la croissance bactérienne. Cette approche peut également être adaptable à d'autres cellules.

Résumé

Nous avons mis au point une méthode de culture des cellules bactériennes au niveau unicellulaire à l'intérieur des vésicules géantes (GV). La culture cellulaire bactérienne est importante pour comprendre la fonction des cellules bactériennes dans l'environnement naturel. En raison des progrès technologiques, diverses fonctions de cellules bactériennes peuvent être révélées au niveau d'une seule cellule à l'intérieur d'un espace confiné. Les VÉHICULES sont des compartiments sphériques de microtaille composée de molécules lipidiques amphiphiles et peuvent contenir divers matériaux, y compris des cellules. Dans cette étude, une seule cellule bactérienne a été encapsulée en 10 à 30 millions de véhicules par la méthode de transfert de gouttelettes et les GV contenant des cellules bactériennes ont été immobilisés sur une membrane supportée sur un substrat de verre. Notre méthode est utile pour observer la croissance en temps réel des bactéries simples à l'intérieur des VÉHICULES lourds. Nous avons cultivé des cellules Escherichia coli (E. coli) comme modèle à l'intérieur des GV, mais cette méthode peut être adaptée à d'autres types de cellules. Notre méthode peut être utilisée dans les domaines scientifiques et industriels de la microbiologie, de la biologie, de la biotechnologie et de la biologie synthétique.

Introduction

La culture des cellules bactériennes au niveau unicellulaire a reçu une attention croissante. Cultiver des cellules bactériennes au niveau unicellulaire à l'intérieur d'un espace confiné peut élucider des fonctions bactériennes telles que la variabilité phénotypique1,2,3,4, comportement cellulaire5, 6 Annonces , 7 Annonces , 8 Annonces , 9, et résistance aux antibiotiques10,11. En raison des progrès récents dans les techniques de culture, la culture des bactéries simples peut être réalisée à l'intérieur d'un espace confiné, comme dans un puits-puce4,7,8, gouttelette de gel12,13 , et gouttelette d'eau dans l'huile (W/O)5,11. Pour promouvoir la compréhension ou l'utilisation de cellules bactériennes uniques, d'autres développements techniques des techniques de culture sont nécessaires.

Les vésicules qui imitent la membrane cellulaire biologique sont des compartiments sphériques composés de molécules amphiphiles et peuvent contenir divers matériaux. Les vésicules sont classées en fonction de leur taille et comprennent les petites vésicules (SVs, diamètre et 100 nm), les grandes vésicules (LV, 'lt;1 'm) et les vésicules géantes (GV, 'gt;1 'm). Les SV ou LVs sont couramment utilisés comme porteurs de médicaments en raison de leur affinité avec la membrane cellulaire biologique14. Les GV ont également été utilisés comme système de réacteur pour la construction de protocellules15 ou de cellules artificielles16. L'encapsulation des cellules biologiques dans les GV a été rapportée17,18, et donc les GV montrent le potentiel comme un système de culture cellulaire lorsqu'il est combiné avec le système de réacteur.

Ici, avec une vidéo des procédures expérimentales, nous décrivons comment les GV peuvent être utilisés comme nouveaux navires de culture cellulaire19. Les GV contenant des bactéries ont été fabriqués par la méthode de transfert de gouttelettes20 et ont ensuite été immobilisés sur une membrane supportée sur un verre de couverture. Nous avons utilisé ce système pour observer la croissance bactérienne au niveau unicellulaire à l'intérieur des VÉHICULES électriques en temps réel.

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Protocole

1. Préparation de véhicules uvraux contenant des cellules bactériennes par la méthode de transfert de gouttelettes

  1. Préparer des solutions de stock lipidique de 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC, 10 mM, 1 mL) et 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] (biotine-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) en chloroforme/ solution de méthanol (2/1, v/v) et stocker le bouillon à -20 oC.
  2. Préparation d'une solution d'huile contenant des lipides
    1. Verser 20 l de la solution POPC et 4 l de la solution biotine-PEG-DSPE dans un tube en verre (figure1b (i)).
    2. Évaporer le solvant organique par le flux d'air pour former un film lipidique et placer le film dans un dessiccateur pendant 1 h pour évaporer complètement le solvant organique (Figure 1b (ii)).
      REMARQUE: Il est nécessaire d'évaporer le solvant organique dans une hotte de fumée.
    3. Ajouter 200 l d'huile minérale (0,84 g/mL, Table of Materials) au flacon de verre ( figure1b (iii)).
    4. Enveloppez la partie d'ouverture du flacon de verre avec du film et sonicatez-la dans un bain à ultrasons (120 W) pendant au moins 1 h (Figure 1b (iii)). Les concentrations finales de POPC et de biotine-PEG-DSPE sont respectivement de 1 mM et 0,002 mM.
  3. Pré-culture des cellules bactériennes
    1. Inoculer E. coli dans 1x LB moyen (1 g d'extrait de levure, 2 g de bacto tryptone, et 2 g de chlorure de sodium dans 200 ml d'eau déionisée) à partir d'une plaque LB et incuber à 37 oC pendant 12 à 14 h (nuit).
    2. Après l'incubation, recueillir 20 L de la solution de culture et transférer à 1,98 ml de milieu frais de 1x LB, et la culture des cellules à nouveau pendant 2 h.
    3. Vérifiez la densité optique à 600 nm (OD600) valeur de la solution pré-culture (préparée à l'étape 1.3.2). Une solution pré-culture de l'OD600 à 1,0 à 1,5 doit être utilisée.
  4. Préparation des solutions aqueuses extérieures et intérieures des GV
    1. Dissoudre le glucose dans un milieu de 1x LB pour préparer une solution aqueuse externe de VS. Préparer 20 ml d'une solution de glucose de stock (500 mM).
    2. Diluer la solution de glucose de stock avec 1x LB moyen à 200 mm (tableau 1).
    3. Dissoudre le saccharose dans un milieu de 1x LB pour préparer une solution intérieure aqueuse de GV. Préparer 20 mL d'une solution de saccharose en stock (500 mM).
    4. Mélanger la solution pré-culture (OD600 à 1,0 à 1,5), la solution de saccharose (500 mM) et le milieu 1x LB (tableau1). La valeur finale OD600 de la solution de culture devrait être 0.01-0.015 et la concentration finale de saccharose devrait être 200 mM.
      REMARQUE: Prenez soin d'éviter la pression osmotique. Il est nécessaire d'équilibrer la concentration entre la solution intérieure et extérieure aqueuse.
  5. Préparation de gouttelettes d'eau dans l'huile (W/O) contenant des cellules bactériennes
    1. Ajouter 2 ll de la solution aqueuse intérieure des GV (préparéeà l'étape 1,4,4) à 50 oL de la solution d'huile contenant des lipides (huile minérale contenant du POPC et de la biotine-PEG-DSPE) dans un tube en plastique couvercle de 0,6 mL (figure1b (iv)).
    2. Émulsionner les deux composants du tube en plastique en tapant le tube à la main (Figure 1b (v)).
  6. Formation de VÉHICULES uvraux contenant des cellules bactériennes
    1. Ajouter 50 l de la solution extérieure aqueuse des GV (préparée à l'étape 1.4.2) dans un tube en plastique couvercle de 1,5 ml (figure1b (vi)) et superposer doucement 150 'L de la solution d'huile contenant des lipides (huile minérale avec POPC et biotine-PEG-DSPE) à la surface de l'aquous extérieur solution(figure 1b (vii)). Incuber cet échantillon à température ambiante (RT, 25 oC) pendant 10 à 15 min. Vérifiez que l'interface de l'huile et des solutions aqueuses est plate.
    2. Ajouter 50 oL de la solution de gouttelettes W/O (préparée à l'étape 1.5.2) sur l'interface de l'huile et de la solution aqueuse à l'aide d'une pipette (Figure 1b (viii)).
    3. Centrifugelement du tube en plastique couvercle de 1,5 mL (à partir de l'étape 1.6.2) pendant 10 min à 1600 x g à RT dans une centrifugeuse de bureau (Figure 1b (ix)). Après centrifugation, aspirez l'huile (couche supérieure) du tube en plastique à couvercle de 1,5 mL à l'aide d'une pipette, et collectez les GV contenant des cellules bactériennes (Figure 1b (x)).

2. Préparation d'un système d'observation GV (Système de culture cellulaire bactérienne)

  1. Préparation de petites vésicules (SVs) pour constructi ng a membrane bicouche soutenue
    1. Verser 20 l l de la solution POPC et 4 l de la solution biotine-PEG-DSPE dans un tube en verre (en utilisant la même composition lipidique que pour la préparation du GV à l'étape 1.1).
    2. Évaporez le solvant organique par flux d'air pour former un film lipidique et placez cet échantillon dans un dessiccateur pendant 1 h pour évaporer complètement le solvant organique.
    3. Ajouter 200 l de glucose de 200 ml dans un milieu de 1 x LB (la solution aqueuse extérieure des GV) au flacon de verre.
    4. Enveloppez la partie d'ouverture du flacon de verre avec du film et sonicatez-la dans un bain à ultrasons (120 W) pendant au moins 1 h.
    5. Préparer les SVs par la méthode d'extrusion21 à l'aide d'un mini-extrudeur et d'une membrane en polycarbonate de taille de 100 nm.
  2. Préparation d'une chambre faite à la main
    1. Percer un trou de 7 mm avec un poinçon creux sur un joint à double face (10 mm x 10 mm x 1 mm).
    2. Coller le joint à double face avec le trou sur un verre de couverture (30 mm x 40 mm, épaisseur 0,25 à 0,35 mm).
  3. Préparation d'une membrane bicouche soutenue sur le verre de couverture dans le trou de la chambre
    1. Ajouter 30 l de la solution SV au trou de la chambre (préparé à la section 2.2) et incuber à RT pendant 30 min.
    2. Lavez doucement le trou deux fois avec 20 l de 1x LB moyen contenant 200 mM de glucose (la solution aqueuse externe des GV) par pipetting.
  4. L'immobilisation des GV sur le membrane bicouche soutenue sur le verre de couverture dans le trou de la chambre
    1. Introduire 10 L de neutravidin avec la solution aqueuse extérieure de GV (1 mg/mL) dans le trou et couver à RT pendant 15 min.
    2. Lavez doucement le trou deux fois avec 20 l de 1x LB moyen contenant 200 mM de glucose (la solution aqueuse externe des GV) par pipetting.
    3. Ajouter toutes les solutions contenant des GV (préparés à l'étape 1.6.3) dans le trou de la chambre et sceller avec un verre de couverture (18 mm x 18 mm, épaisseur 0,13 à 0,17 mm) (Figure 2b).
  5. Observation microscopique de la croissance des cellules bactériennes à l'intérieur des UV
    1. Définir un système de phase de chauffage microscopique avec un microscope inversé équipé d'une lentille objective d'ouverture numérique (NA) 40x/0.6 avec une longue distance de travail (figure 2b).
    2. Placez la chambre sur le système microscopique de phase de chauffage (figure 2b). Incuber les GV contenant des cellules bactériennes dans la chambre à un état statique de 6 h à 37 oC.
    3. Capturez et enregistrez des images au microscope de la croissance des cellules bactériennes à l'intérieur des véhicules uvraux toutes les 30 min à l'aide d'une caméra scientifique complémentaire de semi-conducteur d'oxyde métallique (sCMOS).

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Résultats

Nous présentons une méthode simple pour générer des GV contenant des cellules bactériennes uniques en utilisant la méthode de transfert de gouttelettes (Figure 1). La figure 1a montre une image schématique des précipitations des VÉHICULES uvraux contenant des bactéries. Les gouttelettes W/O contenant des bactéries sont transférées à travers l'interface eau-huile (monocouche lipidique) par centrifugation pour former des GV. La dif...

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Discussion

Ici, nous décrivons une méthode pour cultiver des cellules bactériennes au niveau unicellulaire à l'intérieur des VÉHICULES lourds. Cette méthode simple consiste à former des GV contenant des cellules bactériennes au niveau unicellulaire en utilisant la méthode de transfert de gouttelettes. Par rapport à d'autres approches pour l'obtention de VÉHICULES uvrifs contenant des cellules bactériennes, cette méthode présente deux avantages : (i) elle est facile à développer, et (ii) un petit volume (2 l) de la solution d'échant...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une initiative de premier plan pour d'excellents jeunes chercheurs (LEADER, no 16812285) du ministère de l'Éducation, de la Culture, des Sports, des Sports et de la Technologie (MEXT) du Japon, une subvention d'aide pour la recherche sur les jeunes scientifiques (No. 18K18157, 16K21034) de la Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) à M.M., et Grant-in-Aid de MEXT à K.K. (No. 17H06417, 17H06413).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BactotryptoneBD Biosciences211705
ChloroformeWako Pure Chemicals032-21921
Verre de couverture (18 × ; 18 mm)Matsunami Glass Ind.C018181épaisseur 0,13&ndash ; Verre de couverture de 0,17 mm
(30 & fois ; 40 mm)Matsunami Glass Ind.Épaisseur sur commande0,25&ndash ; Centrifugeuse de bureau 0,35 mm
Hi-Tech Co.ATT101type rotor pivotant
Joint double face (10 × ; 10 × ; 1 mm)NitomsT4613
Flacon en verreAS ONE6-306-01Tube de fermentation Durham
GlucoseWako Pure Chemicals049-31165
Microscope inverséOlympusIX-73
MéthanolWako Pure Chemicals133-16771
Système de mise en scène de chauffage microscopiqueTOKAI HITTP-110R-100
Huile minéraleNacalai Tesque23334-85
Mini-extrudeuseAvanti Polar Lipids610000
NeutravidinThermo Fisher Scientific31000
ObjectifOlympusLUCPLFLN 40× ;/0.6 NA
Membranes en polycarbonateAvanti Polar Lipids610005taille des pores 100 nm
caméra sCMOSAndorZyla 4.2 plus
Chlorure de sodiumWako Pure Chemicals191-01665
SaccharoseWako Pure Chemicals196-00015
Bain à ultrasonsAS ONEASU-3D
Extrait de levureBD Biosciences212750
Tube en plastique à couvercle de 0,6 mLWatson130-806C
Tube en plastique à couvercle de 1,5 mLSumitomo Bakelite Co.MS4265-M
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocolineAvanti Polar Lipids850457PPOPC
1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]Avanti Polar Lipids880129PBiotine-PEG-DSPE

Références

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