Culture cellulaire bactérienne au niveau unicellulaire à l'intérieur des vésicules géantes

Résumé

Nous démontrons la culture unicellulaire des bactéries à l'intérieur des vésicules géantes (GM). Les GV contenant des cellules bactériennes ont été préparés par la méthode de transfert de gouttelettes et ont été immobilisés sur une membrane soutenue sur un substrat en verre pour l'observation directe de la croissance bactérienne. Cette approche peut également être adaptable à d'autres cellules.

Résumé

Nous avons mis au point une méthode de culture des cellules bactériennes au niveau unicellulaire à l'intérieur des vésicules géantes (GV). La culture cellulaire bactérienne est importante pour comprendre la fonction des cellules bactériennes dans l'environnement naturel. En raison des progrès technologiques, diverses fonctions de cellules bactériennes peuvent être révélées au niveau d'une seule cellule à l'intérieur d'un espace confiné. Les VÉHICULES sont des compartiments sphériques de microtaille composée de molécules lipidiques amphiphiles et peuvent contenir divers matériaux, y compris des cellules. Dans cette étude, une seule cellule bactérienne a été encapsulée en 10 à 30 millions de véhicules par la méthode de transfert de gouttelettes et les GV contenant des cellules bactériennes ont été immobilisés sur une membrane supportée sur un substrat de verre. Notre méthode est utile pour observer la croissance en temps réel des bactéries simples à l'intérieur des VÉHICULES lourds. Nous avons cultivé des cellules Escherichia coli (E. coli) comme modèle à l'intérieur des GV, mais cette méthode peut être adaptée à d'autres types de cellules. Notre méthode peut être utilisée dans les domaines scientifiques et industriels de la microbiologie, de la biologie, de la biotechnologie et de la biologie synthétique.

Introduction

La culture des cellules bactériennes au niveau unicellulaire a reçu une attention croissante. Cultiver des cellules bactériennes au niveau unicellulaire à l'intérieur d'un espace confiné peut élucider des fonctions bactériennes telles que la variabilité phénotypique^1,2,3,4, comportement cellulaire^{5, 6} Annonces ^{, 7 Annonces , 8 Annonces , 9}, et résistance aux antibiotiques

Protocole

1. Préparation de véhicules uvraux contenant des cellules bactériennes par la méthode de transfert de gouttelettes

1. Préparer des solutions de stock lipidique de 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC, 10 mM, 1 mL) et 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] (biotine-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) en chloroforme/ solution de méthanol (2/1, v/v) et stocker le bouillon à -20 oC.
2. Préparation d'une solution d'huile contenant des lipides
   1. Verser 20 l de la solution POPC et 4 l de la solution biotine-PEG-DSPE dans un tube en verre (figure1b (i)).

Résultats

Nous présentons une méthode simple pour générer des GV contenant des cellules bactériennes uniques en utilisant la méthode de transfert de gouttelettes (Figure 1). La figure 1a montre une image schématique des précipitations des VÉHICULES uvraux contenant des bactéries. Les gouttelettes W/O contenant des bactéries sont transférées à travers l'interface eau-huile (monocouche lipidique) par centrifugation pour former des GV. La dif.......

Discussion

Ici, nous décrivons une méthode pour cultiver des cellules bactériennes au niveau unicellulaire à l'intérieur des VÉHICULES lourds. Cette méthode simple consiste à former des GV contenant des cellules bactériennes au niveau unicellulaire en utilisant la méthode de transfert de gouttelettes. Par rapport à d'autres approches pour l'obtention de VÉHICULES uvrifs contenant des cellules bactériennes, cette méthode présente deux avantages : (i) elle est facile à développer, et (ii) un petit volume (2 l) de la solution d'échant.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bactotryptone	BD Biosciences	211705
Chloroforme	Wako Pure Chemicals	032-21921
Verre de couverture (18 × ; 18 mm)	Matsunami Glass Ind.	C018181	épaisseur 0,13&ndash ; Verre de couverture de 0,17 mm
(30 & fois ; 40 mm)	Matsunami Glass Ind.	Épaisseur sur commande	0,25&ndash ; Centrifugeuse de bureau 0,35 mm
	Hi-Tech Co.	ATT101	type rotor pivotant
Joint double face (10 × ; 10 × ; 1 mm)	Nitoms	T4613
Flacon en verre	AS ONE	6-306-01	Tube de fermentation Durham
Glucose	Wako Pure Chemicals	049-31165
Microscope inversé	Olympus	IX-73
Méthanol	Wako Pure Chemicals	133-16771
Système de mise en scène de chauffage microscopique	TOKAI HIT	TP-110R-100
Huile minérale	Nacalai Tesque	23334-85
Mini-extrudeuse	Avanti Polar Lipids	610000
Neutravidin	Thermo Fisher Scientific	31000
Objectif	Olympus	LUCPLFLN 40× ;/0.6 NA
Membranes en polycarbonate	Avanti Polar Lipids	610005	taille des pores 100 nm
caméra sCMOS	Andor	Zyla 4.2 plus
Chlorure de sodium	Wako Pure Chemicals	191-01665
Saccharose	Wako Pure Chemicals	196-00015
Bain à ultrasons	AS ONE	ASU-3D
Extrait de levure	BD Biosciences	212750
Tube en plastique à couvercle de 0,6 mL	Watson	130-806C
Tube en plastique à couvercle de 1,5 mL	Sumitomo Bakelite Co.	MS4265-M
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline	Avanti Polar Lipids	850457P	POPC
1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]	Avanti Polar Lipids	880129P	Biotine-PEG-DSPE