Diffraction de rayon X du muscle squelettique intact de Murine comme outil pour étudier la base structurale de la maladie de muscle

Résumé

Nous présentons des protocoles détaillés pour effectuer des expériences de diffraction de rayon X de petit angle utilisant les muscles squelettiques intacts de souris. Avec la grande disponibilité de modèles de souris transgéniques pour les maladies humaines, cette plate-forme expérimentale peut former un banc d'essai utile pour élucider la base structurelle des maladies musculaires génétiques

Résumé

Les modèles transgéniques de souris ont été des outils importants pour étudier la relation du génotype au phénotype pour les maladies humaines, y compris celles du muscle squelettique. Il a été démontré que le muscle squelettique de la souris produit des modèles de diffraction de rayons X de haute qualité sur les faisceaux synchrotron de troisième génération, ce qui donne l'occasion de lier les changements au niveau du génotype aux phénotypes fonctionnels en santé et en maladie en déterminant les conséquences structurelles des changements génétiques. Nous présentons des protocoles détaillés pour la préparation des spécimens, la collecte des modèles de rayons X et l'extraction des paramètres structurels pertinents à partir des modèles de rayons X qui peuvent aider à guider les expérimentateurs qui souhaitent effectuer de telles expériences pour eux-mêmes.

Introduction

La diffraction des rayons X à petit angle synchrotron est la méthode de choix pour étudier la structure à l'échelle nm des préparations musculaires qui contractent activement dans des conditions physiologiques. Fait important, l'information structurale provenant de préparations musculaires vivantes ou écorchées peut être obtenue en synchronie avec des données physiologiques, telles que la force musculaire et les changements de longueur. Il y a eu un intérêt croissant dans l'application de cette technique pour étudier la base structurale des maladies musculaires héritées qui ont leur base dans les mutations de point dans les protéines sarcomeric. La communauté de la biophysique musculaire a été très active dans la production de modèles de souris transgéniques pour ces maladies humaines qui pourraient fournir des bancs d'essai idéaux pour les études structurelles. Des publications récentes de notre groupe^1,2,3 et d'autres^4,5 ont indiqué que les modèles de rayons X de la souris extensor digitus longus (EDL) et les muscles soleus peuvent fournir tous les informations de diffraction disponibles à partir d'organismes modèles plus traditionnels tels que la grenouille et le lapin psoas muscle squelettique. Un avantage de la préparation de muscle squelettique de souris est la facilité de la dissection et d'effectuer la membrane-intacte de base, des expériences physiologiques entières de muscle. Les dimensions du muscle disséqué ont une masse suffisante pour produire des modèles musculaires très détaillés dans des temps d'exposition aux rayons X très courts (milliseconde par image) sur les faisceaux de rayons X de troisième génération.

Les modèles de diffraction de rayon X de muscle se composent des réflexions équatoriales, des réflexions meridional aussi bien que des réflexions de ligne de couche. Le rapport d'intensité équatoriale (rapport de l'intensité des réflexions équatoriales de 1,1 et 1,0, I₁₁/I₁₀), est étroitement corrélé au nombre de ponts croisés attachés, qui est proportionnel à la force générée dans le muscle squelettique de la souris ². Les réflexions métrisales qui signalent des périodicités dans les filaments épais et minces peuvent être utilisées pour estimer l'extensibilité du filament^1,3,6,7. Des caractéristiques de diffraction pas sur le méridien et l'équateur sont appelées lignes de couche qui résultent des têtes de myosine approximativement heliquement commandées sur la surface de l'épine dorsale épaisse de filament ainsi que les filaments minces environ helically ordonnés. L'intensité des lignes de couche de myosine est étroitement liée au degré de commande des têtes de myosine dans diverses conditions^2,8. Toutes ces informations peuvent être utilisées étudier les comportements des protéines sarcomériques in situ dans la santé et la maladie.

La diffraction des rayons X synchrotron du muscle a été historiquement effectuée par des équipes d'experts hautement spécialisés, mais les progrès technologiques et la disponibilité de nouveaux outils de réduction des données indiquent que cela ne doit pas toujours être le cas. Le BioCAT Beamline 18ID à l'Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory dispose d'un personnel et d'installations de soutien dédiés pour effectuer des expériences de diffraction des rayons X musculaires qui peuvent aider les nouveaux arrivants sur le terrain à commencer à utiliser ces techniques. De nombreux utilisateurs choisissent de collaborer officiellement avec le personnel de BioCAT, mais un nombre croissant d'utilisateurs trouvent qu'ils peuvent faire les expériences et l'analyse eux-mêmes réduire le fardeau sur le personnel de beamline. L'objectif principal de ce document est de fournir une formation qui fournit aux expérimentateurs potentiels l'information dont ils ont besoin pour planifier et exécuter des expériences sur le système musculaire squelettique de la souris, soit à la ligne de faisceau BioCAT ou à d'autres lignes de faisceaux de flux élevés autour de la monde où ces expériences seraient possibles.

Protocole

Tous les protocoles d'expérimentation animale ont été approuvés par l'Illinois Institute of Technology Institutional Animal Care and Use Committee (Protocol 2015-001, date d'approbation : 3 novembre 2015) et ont suivi le « Guide for the Care and Use of Laboratory Animals » des NIH⁹ .

1. Préparation pré-expérimentale

1. Préparer 500 ml de la solution de Ringer (contient : 145 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,0 mM MgSO₄, 1,0 mM CaCl₂, 10,0 mM HEPES, 11 mM de glucose, pH 7,4) fraîchement pour chaque jour de l'expérience.
2. Remplir 200 ml de la solution de Ringer dans une bouteille de pulvérisation et conserver au réfrigérateur à 4 oC. Remplissez un plat Petri (10 cm de diamètre) avec la solution de Ringer et perfssez-vous avec 100% d'oxygène en connectant le tube d'un cylindre d'oxygène à une pierre d'air d'aquarium. Les plats Petri (« plats disséquants ») étaient préalablement recouverts d'un composé d'élastomère pour permettre l'insertion de goupilles pendant la dissection.
3. Préparer les crochets de montage en métal. Couper deux morceaux de fil en acier inoxydable, de 0,5 mm de diamètre, à la longueur appropriée et plier le fil aux deux extrémités pour former des crochets. Disposez tous les outils de dissection, ciseaux, tontede de suture, micro-ciseaux à portée de main pour une utilisation.
   REMARQUE: La partie du crochet doit être d'environ 3 mm de long. Le fil plus long (se terminant dans un crochet) doit être d'environ 5 cm de long, et le fil plus court (se terminant également dans un crochet) doit être d'environ 1 cm de long afin d'adapter les chambres personnalisées utilisées à BioCAT et permettre une portée suffisante de mouvement pour le bras transducteur.
4. Connectez-vous et allumez tout l'équipement. Cela comprend un transducteur combiné moteur/force, un contrôleur de transducteur moteur/force, un stimulateur de courant biphasique de grande puissance et un système d'acquisition/contrôle de données contrôlé par ordinateur.
   1. Activez le système d'acquisition de données et étalonnez-le avant de commencer l'expérience¹⁰. En bref, étalonner la force en ajoutant un ensemble de poids connus, couvrant jusqu'à 50% de la force maximale mesurée par le transducteur de force dans une progression linéaire, sur le transducteur de force et l'enregistrement des changements de tension de sortie. Calibrer la longueur en appliquant un ensemble de tension de sortie connue sur le bras de levier et mesurer le changement de longueur du bras.
   2. Connectez les tuyaux du bloc thermique du support de l'échantillon à un bain circulant réfrigéré et fixez la température pour maintenir la température désirée dans la chambre entre 10 et 40 oC. Déterminez cela empiriquement à l'avance en réglant le bain circulant à une gamme de températures et en mesurant la température dans la chambre avec un thermocouple.

2. Préparation musculaire

1. Euthanasier la souris
   1. Euthanasier la souris par inhalation de dioxyde de carbone suivie d'une luxation cervicale.
   2. Vaporiser la peau sur le membre postérieur avec la solution de Ringer froid pour empêcher les cheveux de souffler dans la préparation. Retirez la peau en la coupant autour de la cuisse à l'aide de ciseaux de dissection fine et tirez rapidement la peau vers le bas à l'aide de #5 forceps pour exposer les muscles.
   3. Amputer le membre postérieur et le transférer dans un plat disséquant qui a été rempli de la solution de Ringer oxygénée, puis placer sous un microscope à dissection binoculaire.
2. Préparation d'un muscle soleus
   1. Épingler le membre postérieur vers le bas dans le plat de dissection avec le muscle gastrocnemius tourné vers le haut. Couper le tendon distal du groupe musculaire gastrocnemius/soleus et soulever les muscles doucement et lentement en coupant le fascia de chaque côté du muscle gastrocnemius à l'aide de ciseaux fins. Isoler le groupe musculaire gastrocnemius/soleus du membre après avoir libéré le tendon proximal du muscle soleus.
   2. Épingler le groupe musculaire contenant le muscle gastrocnemius et le tendon distal vers le bas dans le plat de dissection. Soulevez doucement le muscle soleus par le tendon proximal et séparez-le du muscle gastrocnemius en laissant autant de tendon distal soleus intact que possible.
3. Préparation d'un muscle extensor digitorium longus (EDL)
   1. Épinglez le membre postérieur vers le bas dans le plat disséquant avec le muscle antérieur de tibialis faisant face vers le haut. Couper le fascia le long du muscle antérieur de tibialis (TA) et le tirer clairement à l'aide de forceps. Identifiez et coupez le tendon distal du muscle de TA. Soulevez le muscle TA et coupez-le soigneusement sans tirer sur le muscle EDL.
   2. Coupez le côté latéral du genou et exposez les deux tendons. Couper le tendon proximal, en laissant autant de tendon que possible encore attaché au muscle, et soulever le muscle EDL (muscle médial) en tirant doucement le tendon. Couper le tendon distal une fois qu'il est exposé.
4. Montage du muscle
   1. Épinglez le muscle par les tendons, et couper toute la graisse supplémentaire, le fascia et le tendon loin autant que possible. Insérez un tendon dans un noeud pré-lié et attachez la suture étroitement avec des forceps de liaison de suture. Attachez le deuxième noeud autour du crochet métallique.
   2. Répétez la même procédure avec le long crochet à l'autre extrémité du tendon. Assurez-vous qu'aucun des corps du muscle n'est contacté par les sutures. Cela endommagera la préparation.
   3. Fixez le crochet court au fond de la chambre expérimentale et le long crochet au transducteur/moteur à double mode. Bulle la solution dans la chambre expérimentale avec 100% d'oxygène.
5. Optimiser les protocoles de stimulation et la longueur musculaire
   1. Étirez le muscle en ajustant les micromanipulateurs attachés au transducteur/moteur pour générer une tension de base entre 15 et 20 mN avant de trouver les meilleurs paramètres de stimulus. Définir la tension de stimulation à 40 V. Le courant de stimulation est systématiquement augmenté jusqu'à ce qu'il n'y ait pas d'augmentation supplémentaire de la force de secousse. Le courant le plus élevé trouvé est augmenté d'environ 50% pour assurer l'activation supra-maximale.
   2. Trouver la longueur optimale, L₀, défini comme la longueur musculaire qui donnent une force de secousse maximale, en augmentant la longueur musculaire et en activant le muscle avec une seule secousse jusqu'à ce que la force active (force de pointe moins la force de base) cesse d'augmenter.
   3. Effectuer une courte contraction tétanique (1 s activation) pour tester le montage et étirer le muscle à la force de base optimale si nécessaire. Enregistrez la longueur musculaire en mm avec un étrier numérique.

3. Diffraction aux rayons X

REMARQUE: La description suivante concerne les expériences de diffraction des rayons X effectuées à l'aide de l'instrument de diffraction à rayons X à petit angle sur la ligne de faisceau BioCAT 18ID à l'Advanced Photon Source, Laboratoire national d'Argonne, mais des méthodes similaires pourraient être utilisées sur d'autres lignes de faisceau comme ID 02 à l'ESRF (France) et BL40XU à SPring8 (Japon). Beamline 18ID est actionné à une énergie fixe de faisceau x-ray de 12 keV (0.1033 nm longueur d'onde) avec un flux incident de 10¹³ photons par seconde dans le faisceau complet.

1. Choisissez un spécimen à la distance du détecteur (longueur de la caméra). Utilisez une longueur de caméra de 1,8 m pour des expériences examinant l'actine de 2,7 nm et des reflets de myosine de haut ordre tels que 2,8 nm réflexions méridionnelles. Utilisez un appareil photo de 4-6 m pour d'autres expériences, où l'on est principalement intéressé par les détails sur le méridien et les lignes de calque
2. Optimisation de la position de l'échantillon dans le faisceau
   1. Déterminer la position du faisceau à l'aide d'un morceau de papier sensible aux rayons X qui produit une tache sombre en réponse aux rayons X (« une brûlure »). Ensuite, utilisez un générateur de cheveux croisés vidéo pour créer un cross-hair aligné avec la marque de brûlure sur le papier ou tout simplement faire une marque sur l'écran vidéo avec un stylo marqueur.
   2. Utilisez l'interface utilisateur graphique fournie par BioCAT au positionneur de l'échantillon pour déplacer le muscle pour qu'il soit centré sur la position du faisceau. Osciller la chambre de l'échantillon à 10-20 mm/s en déplaçant l'étape de l'échantillon afin de répartir la dose de rayons X sur le muscle pendant l'exposition. Observez l'échantillon en se détachant pour éviter de grandes régions de fascia (contient du collagène qui polluera les motifs de diffraction) et pour s'assurer qu'il reste illuminé pendant tout le chemin de son voyage.
      REMARQUE: Les étapes exactes requises dans les sections 3.3 et 3.4 pour rendre les paramètres et les actions requis à l'aide de l'interface utilisateur graphique fournie par beamline seront spécifiques à la ligne de faisceau et au détecteur. Demandez au personnel de beamline comment effectuer ces opérations.
3. Configuration du détecteur CCD (dispositif couplé charge) pour les modèles à haute résolution du muscle dans des états statiques définis (repos, ou pendant la contraction isométrique)
   1. Configurez le temps d'exposition et la période d'exposition dans l'interface utilisateur graphique du logiciel de contrôle. Prenez une image de fond sombre avant de prendre l'exposition et répéter cette procédure toutes les 2 heures ou après avoir changé de temps d'exposition pour corriger toute dérive dans l'électronique de lecture du détecteur.
   2. Atténuez le faisceau de rayons X à la valeur désirée pour l'exposition. Ensuite, prenez une image. Il n'est pas possible de prendre des séquences d'images avec ce détecteur. Le détecteur CCD a également besoin de plusieurs secondes pour lire une image individuelle.
4. Configuration du détecteur de tableau de pixels pour une expérience résolue dans le temps
   1. Configurez le nombre d'images, le temps d'exposition, la période d'exposition dans l'interface utilisateur graphique. Le détecteur de tableau de pixels utilisé ici a besoin d'au moins 1 ms pour être lu. La fréquence maximale de trame pour le détecteur de comptage de photons est de 500 Hz. Utilisez le signal de sortie du détecteur de comptage de photons pour contrôler l'obturateur de rayons X.
   2. Atténuez le faisceau à l'intensité désirée. Armez le détecteur et attendez la gâchette du système d'acquisition de données. Synchronisez les données mécaniques et les données radiographiques en les déclenchant en même temps. Les modèles de rayons X sont recueillis en continu tout au long du protocole a avec un temps d'exposition de 1 ms et une période d'exposition de 2 ms.
      REMARQUE: Le temps d'exposition exact et la période d'exposition doivent être déterminés au cas par cas pour l'information désirée et la durée de vie observée de l'échantillon dans le faisceau. Atténuer le faisceau afin d'utiliser pas plus de faisceau x-ray que ce qui est nécessaire pour fournir des données analysables dans la période d'exposition choisie.

4. Traitement musculaire post-expérience

1. Récupérer et peser le muscle après chaque expérience mécanique et aux rayons X. Calculer la zone transversale du muscle en utilisant la longueur musculaire mesurée et la masse musculaire¹¹ en supposant une densité musculaire de 1,06 g/mL¹².
2. Étirez le muscle à la longueur expérimentale et fixer le muscle en formaline de 10% pendant 10 min. Séparer le muscle fixe en une série de faisceaux de fibres sélectionnés à partir d'emplacements dans toute la section de croisement musculaire³.
3. Mesurez la longueur des sarcomeres à l'aide d'un système de mesure de la longueur des sarques vidéo.

Résultats

Contraction tétrique isométrique. Tout type d'expérience mécanique musculaire classique, comme les contractions isométriques ou isotoniques, peut être effectué avec l'acquisition simultanée de modèles de rayons X. Figure 1 A montre la configuration expérimentale pour les expériences mécaniques et radiographiques. Une trace de force d'exemple pour une contraction tetanique isométrique est montrée dans la figure 1B. Le muscle a été maintenu au repos pendant 0.5 s avant activé pendant 1 s. L'enregistrement mécanique s'arrête 1 s après le stimulus. Les modèles de rayon X ont été rassemblés sans interruption tout au long du protocole à 1 ms temps d'exposition à 500 Hz.

Modèles de diffraction de rayon X. Le modèle de diffraction de rayon X de muscle peut donner l'information structurale de résolution de nanomètre des structures à l'intérieur du sarcore. Les modèles de diffraction des rayons X musculaires sont composés de quatre quadrants équivalents divisés par l'équateur et le méridien. Le modèle équatorial provient de l'emballage myofilament dans le sarcome perpendiculaire à l'axe de fibre, tandis que les modèles méridional s'édulvent des informations structurales des myofilaments le long de l'axe de muscle. Les réflexions restantes non sur l'équateur ou le méridien sont appelées lignes de couche. Les lignes de calque (p. ex., les caractéristiques étiquetées MLL4 et ALL6 à la figure 2A) découlent de l'arrangement approximativement hélicoïl des sous-unités moléculaires à l'intérieur de la myosine contenant des filaments épais et de l'actine contenant des filaments minces. Les lignes de couche à base de myosine sont fortes et nettes dans les modèles du muscle au repos (Figure 2A), tandis que les lignes de couche à base d'actine sont plus importantes dans les modèles de muscle contractant (Figure 2B). Les modèles de différence obtenus en soustrayant le modèle de repos du modèle de contraction (figure 2C) peuvent faire la lumière sur les changements structurels pendant le développement de la force dans les muscles sains et malades. En suivant ces changements structurels à l'échelle temporelle milliseconde des événements moléculaires pendant la contraction musculaire, les modèles de diffraction des rayons X peuvent révéler des informations structurelles substantielles (figure2D).

Analyse de données à l'aide de MuscleX. Voici un exemple d'analyse des réflexions équatoriales à l'aide de la routine « équateur » dans le paquet MuscleX (figure 3). MuscleX est un logiciel d'analyse open-source développé chez BioCAT¹³. Le rapport d'intensité équatoriale (I_1,1/I_1,0) est un indicateur de la proximité de la myosine à l'actine dans le muscle au repos (Figure 3A), alors qu'il est étroitement corrélé au nombre de ponts croisés attachés dans la passation de marchés ( Figure 3B) muscle squelettique murine². Le rapport d'intensité, I_1,1/I_1,0, est d'environ 0,47 dans le muscle au repos et d'environ 1,2 dans le muscle contractant. La distance entre les deux 1,0 réflexion (2-S_1,0) est inversement liée à l'espacement inter-filament. Des documents détaillés et des manuels pour MuscleX sont disponibles en ligne¹³.

Figure 1 : Configuration et protocole d'expérience mécanique et de rayons X. (A) Le muscle est monté à une extrémité d'un crochet à l'intérieur de la chambre expérimentale et l'autre extrémité à un moteur à double mode / transducteur de force. Il se tient entre deux fenêtres de film Kapton pour permettre aux rayons X de passer à travers. La chambre est remplie de la solution de Ringer perfused avec 100% d'oxygène tout au long de l'expérience. (B) Le protocole mécanique pour les expériences de rayons X sur un muscle pendant la contraction tetanique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : modèles de diffraction des rayons X EDL. EDL muscle X-ray diffraction modèle de repos (A) et la contraction (B) muscle. (C) Le modèle de différence entre le repos et le modèle de contraction. La région bleue indique une intensité élevée dans le modèle de repos, tandis que la région jaune représente une intensité élevée dans le modèle de contraction. (D) Modèle de diffraction de rayon X d'une exposition de 1 ms avec le muscle d'EDL. MLL1 - Ligne de couche de myosine de premier ordre; MLL4 - Ligne de couche de myosine de quatrième ordre; ALL1 - Ligne de couche d'actine de premier ordre ALL6 - Sixième ligne de couche d'actine d'ordre ; ALL7 - Ligne de couche actine septième ordre ; Réflexion de tm et de tropomyosine (indiquée par une boîte blanche); M3 - réflexion médique de troisième ordre; M6 - sixième ordre réflexion méridionnelle. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Analyse des données des modèles équatorials à l'aide de MuscleX. L'arrière-plan soustrait le profil du rapport d'intensité équatoriale (alors que la zone) et les cinq premières commandes (lignes vertes) étaient aptes à calculer l'intensité de chaque pic. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Des publications récentes de notre groupe ont montré que les modèles de rayons X du muscle squelettique de souris peuvent être employés pour jeter la lumière sur l'information structurale sarcomeric du muscle dans la santé et la maladie^1,2,3 particulièrement avec la disponibilité accrue de modèles génétiques modifiés de souris pour diverses myopathies. Les études mécaniques à haute résolution sur des fibres simples ou de petits faisceaux combinés à la diffraction des rayons X sont mieux faites par des experts. Si, cependant, des informations mécaniques plus modestes suffiront à vos fins, toute la préparation musculaire permet la collecte de modèles de rayons X détaillés à partir d'une simple préparation.

Une dissection propre est la clé d'une expérience mécanique combinée réussie et de rayon X. Il est très important de ne pas tirer sur le muscle cible ainsi que d'autres muscles associés aux muscles du soleus ou de l'EDL pendant la dissection, car cela pourrait déchirer des parties du muscle et conduire à une force réduite. Il peut également conduire à la structure interne endommagée qui dégradera les modèles de rayon X. Puisque tout se dispersera dans le faisceau de rayon X, il est important de nettoyer n'importe quelle graisse supplémentaire, le collagène dans le fascia aussi bien que tous les poils ou morceaux lâches de tissu tout en faisant le protocole suivant. Pour réduire la conformité supplémentaire dans la préparation musculaire, il est également important de lier solidement les tendons aux crochets, aussi près que possible du corps musculaire sans l'endommager.

Différents temps d'exposition aux rayons X peuvent fournir différents types d'informations à partir du même muscle. À l'aide du faisceau complet sur 18ID, un modèle équatorial analysable peut être obtenu dans une exposition de 1 ms (voir figure 2D). Pour une première réflexion de ligne de couche de myosine analysable, un temps d'exposition total de 10 ms est généralement nécessaire. Pour recueillir des réflexions méridionnels d'ordre plus élevé telles que le M15 (2,8 nm myosin emérique réflexion) et le 2,7 nm actin réflexion méridionnelle, généralement au moins 1 s exposition totale est nécessaire, mais plus de 2 s exposition totale est recommandée pour une grande précision Mesures.

Le choix du détecteur de rayons X optimal pour l'expérience est important. Pour les modèles de rayons X les plus détaillés, un détecteur CCD personnalisé, tel que celui de BioCAT avec environ 40 pixels de m et des fonctions de propagation de points de 65 m dans le phosphore, peut fournir des modèles avec une plage dynamique élevée et une bonne résolution spatiale, mais ne peut prendre qu'une image à la fois. Pour les expériences résolues par le temps, le détecteur de tableau de pixels de comptage de photons chez BioCAT peut collecter des modèles de rayons X à 500 Hz. La taille de 172 pixels avec ce détecteur, cependant, ne fournit pas une résolution spatiale suffisante pour des études détaillées de la partie intérieure du méridien, mais est adéquate pour la plupart des autres fins. BioCAT a fait l'acquisition d'un détecteur de comptage de photons haute résolution fournissant une résolution réelle de 75 millions de m à un taux d'images maximum de 9 000 Hz. On s'attend à ce que des détecteurs similaires de ce type supplantent les détecteurs actuels pour les études musculaires au cours des prochaines années.

Avec les flux très élevés de rayons X aux synchrotrons de troisième génération, les dommages causés par les radiations sont une grave préoccupation. C'est toujours un bon choix pour atténuer le faisceau pour ne pas fournir plus de faisceau que ce qui est nécessaire pour observer les caractéristiques de diffraction désirées. La même exposition totale aux rayons X peut être obtenue en prolongeant le temps d'exposition d'un faisceau atténué. Un avantage de comptage de photon s'appelle à ce que les images individuelles puissent être résumées sans pénalité de bruit. Même alors, des dommages de rayonnement sont possibles. Les signes de dommages de rayonnement incluent la baisse de la force maximale de contraction, le frottis des reflets de ligne de couche, même le changement de couleur de muscle.

Une des limites de la préparation intacte de muscle squelettique de souris est la difficulté en obtenant la longueur de sarcome du muscle intact pendant les expériences. Les muscles sont trop épais pour la microscopie vidéo et la diffraction laser. Tandis qu'avec des développements futurs il peut être possible d'estimer la longueur de sarcomere directement des modèles de diffraction¹⁴, à court terme la seule option est de la mesurer après l'expérience comme décrit ici.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
#5 pince	WPI	500342
4/0 suture chirurgicale	Braintree Sci	SUT-S 108
Pierre d’air d’aquarium	uxcell		une pierre à air ordinaire d’une animalerie conviendrait bien
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
Détecteur CCD	Rayonix Inc	MAR 165 Données CCD
système d’acquisition	Aurora Scientific Inc	610A
Composé élastomère	Dow Corning	Sylgard 184
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
	HEPES Sigma-Aldrich	H3375
Détecteur de comptage de photons haute résolution	Dectris Inc	EIGER X 500K
Stimulateur de courant biphasique haute puissance	Aurora Scientific Inc	701
Ciseaux à iris	WPI	501263-G
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Micro ciseaux	WPI	503365
Capteur moteur/force	Aurora Scientific Inc	300C-LR
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Boîte de Pétri	Sigma-Aldrich	CLS430167
Détecteur de comptage de photons	Dectris Inc	Pilatus 3 1M
Fil d’acier inoxydable	McMaster-carr	8908K21
Pince à suture	WPI	504498
Système de mesure de longueur de sarcomère	vidéo Aurora Scientific Inc	900B