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Article de méthode

Mesure des taux potentiels de réduction du nitrate dissimilatoire à l’ammonium sur la base de 14NH4+/15NH4+ Analyses via conversion séquentielle en N2O

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DOI :

10.3791/59562

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7 octobre 2020

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1Department of Biological Sciences, Faculty of Science and Engineering, Chuo University, 2Faculty & Graduate School of Urban Environmental Sciences, Tokyo Metropolitan University, 3Center for Ecological Research, Kyoto University, 4Department of Chemistry, Faculty of Science, Toho University, 5Graduate School of Integrated Arts and Sciences, Hiroshima University

Dans cet article

Résumé

Une série de méthodes pour déterminer le taux potentiel de DNRA sur la base de 14NH4+/15NH4+ analyses est fournie en détail. NH4+ est converti en N2O par plusieurs étapes et analysé à l’aide de la chromatographie au gaz quadrupole– spectrométrie de masse.

Résumé

L’importance de comprendre le sort du nitrate (NO3−), qui est l’espèce dominante de N transférée des écosystèmes terrestres aux écosystèmes aquatiques, a augmenté parce que les charges mondiales d’azote ont considérablement augmenté à la suite de l’industrialisation. La réduction du nitrate dissimilatoire à l’ammonium (DNRA) et la dénitrification sont deux processus microbiens qui utilisent no3− pour la respiration. Par rapport à la dénitrification, les déterminations quantitatives de l’activité de la DNRA n’ont été effectuées que dans une mesure limitée. Cela a conduit à une compréhension insuffisante de l’importance de la DNRA dans les transformations no3− et des facteurs régulateurs de ce processus. L’objectif du présent document est de fournir une procédure détaillée pour la mesure du taux potentiel de DNRA dans les échantillons environnementaux. En bref, le taux potentiel de DNRA peut être calculé à partir du taux d’accumulation d’ammonium étiqueté 15N (15NH4+) dans 15NO3− incubation ajoutée. La détermination des 14concentrations de NH4+ et 15NH4+ décrites dans le présent document comprend les étapes suivantes. Tout d’abord, le NH4+ dans l’échantillon est extrait et piégé sur un filtre en verre acidifié comme sel d’ammonium. Deuxièmement, l’ammonium piégé est éluturé et oxydé à NO3− par oxydation du persulfate. Troisièmement, le NO3− est converti en N2O via un dénitrificateur déficient en réductase N2O. Enfin, le N2O converti est analysé à l’aide d’un système quadripolaire de spectrométrie par spectrométrie de masse précédemment développé. Nous avons appliqué cette méthode aux sédiments des marais salés et calculé leurs taux potentiels de DNRA, démontrant que les procédures proposées permettent une détermination simple et plus rapide par rapport aux méthodes décrites précédemment.

Introduction

La synthèse artificielle de l’engrais azoté et son application généralisée ont grandement perturbé le cycle mondial de l’azote. On estime que le transfert d’azote réactif des systèmes terrestres vers les systèmes côtiers a doublé depuis l’époque préindustrielle1. Une partie importante des engrais appliqués à un champ donné est emportée du sol vers les rivières ou les eaux souterraines, principalement sous le nomde NO 3− 2. Cela peut causer des problèmes environnementaux tels que la pollution de l’eau potable, l’eutrophisation et la formation d’hypoxie. NO3− dans les milieux aquatiques est retiré ou conservé dans l’écosystème par l’assimilation biologique et divers processus dissimilatoires microbiens. La dénitrification et l’anammox sont connus pour être des processus d’ablation microbienne majeurs pour no3−. La dénitrification est la réduction microbienne du NO3− aux produits gazeux N (NO, N2O et N2)couplée à l’oxydation d’un donneur d’électrons, tels que les substances organiques, réduisant ainsi le risque des problèmes susmentionnés. Anammox produit également N2 à partir de NO2− et NH4+; par conséquent, il élimine le N inorganique d’un écosystème. Inversement, la DNRA travaille à conserver le N dans un écosystème; il est généralement admis que la DNRA est effectuée principalement par des bactéries fermentatives ou des bactéries chimiolithoautotrophiques et qu’elles réduisent le N°3dissimilatoire− à la biodisponibilité et moins mobile NH4+.

Des études sur la DNRA ont été principalement réalisées dans des écosystèmes marins ou estuariens, tels que les sédiments océaniques ou estuariens et l’eau, le sol des marais salés ou saumâtres et le sol des mangroves. Les écosystèmes côtiers ou marins sont importants en tant que réservoirs pour enlever no3− des écosystèmes terrestres, et dans des études précédentes, DNRA a été montré pour contribuer sur un très large éventail de NO3− enlèvement (0–99%)3,4,5,6,7,,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. En outre, l’existence de la DNRA a été démontrée dans un large éventail d’environnements, y compris les milieux d’eau douce19, les sols paddy de riz20, et les sols forestiers21. Bien que ces études aient montré que la DNRA est potentiellement comparable à la dénitrification pour l’élimination du NO3− , les études mesurant l’activité du DNRA sont encore très limitées par rapport à celles mesurant la dénitrification.

Le taux de DNRA a été évalué à l’aide de 15techniques d’étiquetage N en conjonction avec l’analyse des données au moyen de modèles analytiques ou numériques. Une solution analytique pour calculer le taux de DNRA est basée sur l’augmentation de l’enrichissement de 15N du pool NH4+ après l’ajout de 15NO3− comme traceur. 15 N-étiqueté NO3− est ajouté à un échantillon et incubé, et le taux de DNRA peut alors être calculé à partir des variations de concentration et de rapport isotopique dans NH4+ avant et après une certaine période de temps. Dans cet article, une méthode de quantification de la concentration de NH4+ et du rapport isotopique, qui sont nécessaires pour calculer le taux de DNRA, est décrite en détail. Fondamentalement, la méthode rapportée ici est une combinaison de plusieurs techniques précédemment rapportées22,23,24,25,26 avec des modifications ajoutées à certaines procédures. La méthode est composée d’une série de cinq procédures composantes : (1) incubation d’un échantillon environnemental avec modification d’un traceur d’isotopes stables, 15NO3−, (2) extraction et récupération de NH4+ à l’aide d’une « rocédeur de diffusion » avec modifications, (3) oxydation du persulfate de NH4+ dans l’échantillon, composé de NH indigènes4+ et 15NH4+ dérivés de 15NO3− via l’activité DNRA, en N°3− et 15NO3−, (4) transformation microbienne ultérieure de NO3− et 15NO3− à N2O isotopomères par la méthode de dénitrification modifiée, et (5) quantification des isotopomères N2O utilisant la chromatographie gazeuse–spectrométrie de masse (GC/MS). Dans la section suivante, d’abord, la préparation des procédures (2) et (4) est décrite, puis, par la suite, les cinq procédures des composantes sont décrites en détail.

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Protocole

1. Préparation d’une enveloppe PTFE pour la capture quantitative de NH3 gazeux

  1. Placer un morceau de ruban de polytétrafluoroéthylène (PTFE) de 60 mm (25 mm de largeur) sur une petite feuille de papier d’aluminium (environ 300 mm x 450 mm de taille, essuyé avec de l’éthanol).
  2. Cendres un filtre en fibre de verre (10 mm de diamètre avec une taille de pore de 2,7 μm) à 450 °C pour 4 h dans un four à silencieux. Placez le filtre en fibre de verre un peu au-dessus du point médian de l’axe plus long de la bande (Figure 1a).
  3. Placez 20 μL de 0,9 mol/L H2SO4 au centre d’un filtre GF/D, et pliez immédiatement la bande PTFE à l’aide de deux pinces à épiler : une pince à timbre à fin plate et une pince à épiler à fin droite. Les étapes suivantes, les étapes 1.4 à 1.7, sont indiquées à la figure 1 et doivent être effectuées rapidement.
  4. Retournez la bande PTFE sur le filtre GF/D à la ligne pointillée indiquée à la figure 1a pour former la forme indiquée à la figure 1b.
  5. Sceller les deux côtés en pliant puis en appuyant étroitement sur le bord avec la pince à épiler (Figure 1c). N’appuyez pas trop fort et ne grattez pas la bande PTFE.
  6. Pliez l’extrémité ouverte avec la pince à épiler, puis appuyez sur le bord avec la pince à épiler (Figure 1d).
  7. Sceller l’extrémité ouverte en appuyant étroitement sur le bord avec la pince à épiler (Figure 1e). Le filtre GF/D ne doit pas être appuyé pendant cette procédure.

2. Préparation de la biomasse d’un dénitrificateur déficient en oxyde nitreux, Pseudomonas chlororaphis subsp. auréofaciens ATCC13985, pour la méthode de dénotrificateur

  1. Streak a 20% glycérol stock of Pseudomonas chlororaphis subsp. auréofaciens ATCC13985 on 1/4 strength tryptone soy broth (TSB) agar plates. Incuber les plaques à 25 °C pendant 2 à 3 jours.
  2. Transférer une colonie de P. chlororaphis dans un petit tube à essai contenant 5 ml de milieu et de culture du BST autoclavés (sans trembler) pendant une journée à 25 °C dans l’obscurité jusqu’à ce qu’il obtienne une croissance maximale; cela sera utilisé comme la préculture.
  3. Transférer 3 ml de la préculture dans une bouteille de 1 L avec un bouchon en caoutchouc de silicium contenant 1 L de TSB modifié autoclavé fraîchement préparé complété par 10 mmol/L KNO323. Incuber la bouteille tout en agitant à l’aide d’un agitateur dans des conditions sombres à 25 °C. Après avoir cultivé pendant 8 h, remplacer le bouchon en caoutchouc de silicium par un bouchon à vis et fermer hermétiquement. Continuer la culture en anoxie pendant la nuit.
  4. Centrifuge la culture à 18 800 x g pendant 15 min à 4 °C pour obtenir des granulés de biomasse.
  5. Laver la biomasse emballée trois fois avec 30 mL de saline tamponnée de phosphate (D-PBS(-), pH 7.5 de Dulbecco), pour éliminer complètement le NO3−. Les conditions de la centrifuge sont les mêmes que dans l’étape 2.3.
  6. Après le lavage, re-suspendre la biomasse emballée avec 30 mL de D-PBS(-). Utilisez 1 mL de la suspension pour déterminer la densité cellulaire en mesurant OD600. Pipette 1 mL aliquots de la suspension restante en cryocials stériles contenant 0,8 mL de glycérol à 45%. Conserver les stocks de glycérol préparés à −80 °C jusqu’à l’utilisation (voir la section 6).

3. Élimination de l’oxygène, du nitrite et du nitrate des sédiments échantillonnés

  1. Peser 3,0 g (poids humide) de sédiments dans un flacon de verre de 20 m L et ajouter 9,0 mL d’eau de surface pour le suspendre (25 % w/w de lisier).
  2. Sceller le flacon avec un bouchon en caoutchouc butyle noir (lavé à l’eau échangée par ions et stérilisé par autoclavage) et un bouchon en aluminium.
  3. Purger la suspension et remplacer l’air de l’espace de tête par Ar (>99.99%) à 0,6 L/min pendant 20 min à l’aide d’un collecteur.
  4. Remplacer le gaz d’espace de tête Ar par ultra-pur (>99.99995%) Il en passant l’aspirateur pendant 90 s et en lui facturant 30 s. Répétez cette procédure quatre fois. Réglez la pression de gaz de l’espace de tête à 1,5 atm.
  5. Incuber les flacons à 20 °C pendant la nuit en secouant à 150 tr/min dans des conditions sombres à l’aide d’un shaker à température constante pour éliminer le reste de l’oxygène, du nitrate et du nitrite dans la suspension des sédiments et le gaz de l’espace de tête.

4. Expérience de cours de temps pour déterminer le taux de DNRA

  1. Remplacer le gaz d’espace de tête par un air frais ultra-pur Il utilise la même procédure qu’à l’étape 3.5 mais sans les quatre répétitions.
  2. Ajouter des substrats étiquetés et non étiquetés à chaque flacon selon le tableau 1 à l’aide d’une seringue étanche au gaz. Purger les solutions de substrat préalablement préparées dans des flacons de verre de taille adéquate à l’aide d’un lui ultra-pur avec la pression de l’espace de tête réglé à 1,5 atm pour éviter la contamination de l’air. Évitez l’injection involontaire de toute quantité d’air pendant les procédures d’injection.
  3. Incuber les flacons à 20 °C avec secousse à 150 tr/min. Ajouter les substrats à chaque flacon selon le tableau 1 et incuber pendant 1 h, 3 h et 5 h. Après l’arrêt de l’incubation, soumettre la suspension des sédiments dans les flacons aux procédures suivantes : étapes 4.4–4.9.
  4. Retirez le bouchon en aluminium et le bouchon en caoutchouc butyle de chaque flacon. Ensuite, ajouter le KCl (cendré à 450 °C pendant 4 h) jusqu’à une concentration finale d’environ 2 mol/L pour assurer la récupération du NH4+ des sédiments. Fermer les flacons à l’aide d’un bouchon en caoutchouc butyle et d’une fermeture en aluminium.
  5. Agiter les sédiments à 150 tr/min pendant 1 h à 4 °C dans des conditions sombres pour extraire le NH4+.
  6. Transférer l’ensemble de la suspension sédimentaire dans le flacon dans un tube de centrifugeuse en plastique de 50 mL et la centrifugeuse à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
  7. Rincez la paroi interne d’une seringue jetable de 10 mL fraîchement ouverte et attachez-la à un filtre à membrane d’acétate jetable fraîchement ouvert (taille des pores 0,22 μm, 25 mm de diamètre). Ensuite, rincez le filtre membranal avec 1 mL de supernatant. Placez l’unité de filtre à seringues rincées sur une bouteille de polypropylène à grande bouche (PP) de 20 m L.
  8. Filtrer le surnatant restant à travers un filtre à membrane d’acétate dans la bouteille pp de 20 mL. Conserver les extraits à −20 °C jusqu’à une analyse plus poussée.

5. Capture diffuse NH4+ en 2M H2SO4 absorbé au filtre GF/D dans l’enveloppe PTFE et l’oxydation du persulfate de NH4+ à NO3−

  1. Préparer des solutions standard de 14NH4Cl avec des gradients de concentration de 0 μmol/L, 10 μmol/L, 40 μmol/L, 100 μmol/L, 200 μmol/L, 400 μmol/L et 500 μmol/L. Pour l’analyse du ratio 15N, fixer la concentration totale de NH4+ à 200 μmol/L et préparer des rapports isotopiques de 100:0, 99,5:0,5, 99:1, 93:7, 90:10, 50:50 et 10:90 avec des solutions standard pures 14NH4Cl et 15NH4Cl.
  2. Transférer 30 mg de MgO (cendré à 450 °C pendant 4 h) dans un flacon en verre de 20 mL et placer l’enveloppe PTFE dans le flacon.
  3. Transférer 5 mL d’un échantillon ou d’une norme dans le flacon contenant le MgO et l’enveloppe PTFE, et fermer immédiatement avec un bouchon en caoutchouc butyle gris. Sceller avec un bouchon en aluminium. Si la concentration de NH4+ devrait dépasser 500 μmol/L, diluer l’échantillon à moins de 500 μmol/L.
  4. Agiter les flacons à 150 tr/min pendant 3 h à 4 °C dans des conditions sombres.
  5. Retirez le bouchon en aluminium et le bouchon en caoutchouc butyle. Retirez l’enveloppe de PTFE de la fiole à l’aide de pinces à pointes, rincez soigneusement l’enveloppe et les pinces à épiler avec de l’eau échangée par ions, essuyez-les avec un papier d’essuyage, puis placez l’enveloppe sur un papier d’essuyage frais.
  6. Ouvrez l’enveloppe PTFE avec quelques pinces (l’utilisation des pinces à bout plat et à bout de point est recommandée) dans l’ordre inverse exact du pliage effectué aux étapes 1.4–1.7.
  7. Tenez la zone périphérique du filtre GF/D, où le H2SO4 est censé être non absorbé, avec les pinces à épiler à plat, et transférez-la dans un tube à vis de 11 mL avec un bouchon doublé PTFE. Rincer les pinces à épiler avec de l’eau échangée par ions et les essuyer avec du papier d’essuyage.
  8. Répétez les étapes 5.5–5.7 pour les enveloppes restantes.
  9. Ajouter 1 mL d’eau échangée par ions à chacun des tubes à essai, fermer le bouchon à vis et le maintenir sans trembler pendant au moins 30 min à température ambiante pour éliminer complètement le NH4+ du filtre GF/D. Au cours de cette étape, effectuez l’étape suivante (étape 5.10) en parallèle.
  10. Préparer le réactif de la solution d’oxydation du persulfate (POR)25,26.
    1. Parce qu’il ne peut pas être stocké, préparer la quantité exacte de POR nécessaire pour le traitement d’une seule journée d’échantillons.
    2. Pour préparer le POR pour traiter 50 échantillons, versez 100 ml d’eau échangée par ions dans une bouteille à vis de 200 mL et ajoutez 1,52 g de NaOH (catégorie d’analyse des composés azotés), 3 g d’acide borique et 5 g de K2S2O8 (catégorie d’analyse de l’azote et du phosphore) dans cet ordre. Immédiatement après l’ajout de chaque réactif, secouer la solution jusqu’à ce qu’elle soit complètement dissoute.
    3. Si nécessaire, tremper la bouteille dans de l’eau chaude pour aider à la dissolution des produits chimiques; toutefois, il convient d’accorder une attention particulière à la contamination du no3− parce que l’eau du robinet contient normalement le no3−.
  11. Après l’étape 5.8, ouvrez le bouchon à vis, ajoutez 2 ml du réactif POR au tube à essai et fermez le tube hermétiquement à l’aide d’un bouchon à vis pour éviter toute perte ou contamination pendant les étapes suivantes.
  12. Tenez les tubes à essai sur une grille, enveloppez-les dans du papier d’aluminium à double couche et autoclavez-les pendant 1 h à 121 °C. Gardez les tubes en position verticale pendant cette étape et évitez les changements rapides de température après avoir terminé l’autoclaving.

6. Détermination du NO3− converti à partir de NH4+ par la méthode de dnitrifier à l’aide de quadrupole GC/MS

  1. Mélanger 100 mL de tampon stérile de phosphate de 40 mmol/L (pH 7,2) et 100 mL de glucose stérile de 30 mmol/L aseptiquement (phosphate de 20 mmol/L et 15 mmol/L glucose; finale).
  2. Ajouter un volume de 1/7,2 de glycérol de P. chlororaphis à 200 ml de la solution de glucose tamponnée par phosphate dans une fiole Erlenmeyer de 300 mL, et purger avec un He ultra-pur (>99.995%) flux pendant 1 h.
  3. Distribuer 2,0 mL de la suspension de denitrifier dans chaque flacon de 5 mL. Plafonnez les flacons d’un bouchon en caoutchouc butyle gris et d’une fermeture en aluminium.
  4. Remplacez l’air de l’espace-tête par un Ultra-pur He en passant l’aspirateur pendant 3 min et en chargeant le He pendant 1 min. Réglez la pression positive au gaz de l’espace de tête à 1,3 atm pour éviter une contamination involontaire de l’air.
  5. Injecter 1 mL d’un échantillon ou d’une norme à l’aide d’une seringue jetable de 1 mL. Notez la quantité exacte de l’échantillon effectivement injecté.
  6. Incuber les flacons pendant la nuit à 25 °C dans des conditions sombres.
  7. Injecter 0,3 mL de 6 mol/LL NaOH pour arrêter la dénitrification et absorber l’espace de tête CO2, ce qui perturbera par ailleurs sérieusement l’analyse N2O par GC/MS parce que le CO2 et le N2O ont le même poids moléculaire.
  8. Déterminer les quantités de 44N2O, 45N2O et 46N2O dans le gaz de l’espace de tête à l’aide du quadrupole GC/MS avec un port d’injection modifié25. Les conditions d’exploitation utilisées pour l’analyse GC/MS sont indiquées au tableau 2.

7. Analyse des données

  1. Dérivez la courbe d’étalonnage du NH4+ concentration de la relation linéaire entre la concentration connue de 14NH4+ et les intensités mesurées du signal du total produit 44N2O + 45N2O + 46N2O. Dérivez la courbe d’étalonnage pour le contenu de 15N de la relation linéaire entre l’atome connu %(c.-à-d.. 15N/14N+15N) et l’atome calculé% à l’aide d’une équation précédemment fournie27. Calculer la concentration de 15NH4+ en multipliant le total NH4+ par le rapport de 15N de NH4+.
  2. Calculer le taux potentiel de DNRA à l’aide d’équations fournies ailleurs28,29,30.

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Résultats

Les résultats représentatifs présentés dans cet article ont été tirés de 15expériences de traçage de N sur les sédiments des marais salés. Le marais salé échantillonné a été récemment créé à la suite du tremblement de terre de 2011 dans la région de Moune de la ville de Kesen-numa dans la préfecture de Miyagi, au Japon. En septembre 2017, des sédiments de surface (0 à 3 cm) ont été collectés à deux sites dans les zones subtidales et intertidales. Tout d’abord, immédiatement apr...

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Discussion

Le rapport concentration et isotope du NH4+ pour l’analyse DNRA a été quantifié à l’aide de plusieurs méthodes. Les concentrations et les rapports isotopiques de NH4+ sont généralement mesurés séparément. La concentration de NH4+ est généralement mesurée à l’aide de méthodes colorimétriques, y compris un autoanalyseur4,10,15,16

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Remerciements

Nous remercions Naoto Tanaka d’avoir aidé à la collecte de données et d’avoir développé le protocole. La collecte d’échantillons a été appuyée par le numéro de subvention 17K15286 de JSPS KAKENHI.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
15N-KNO3SHOKO SCIENCEN15-0197
15N-NH4ClSHOKO SCIENCEN15-0034
Bouteille PP de 20 mLSANPLATEC61-3210-18
Bouchon en aluminiumMaruemu1307-13n° 20, avec trou
AcideboriqueWako021-02195
CentrifugeuseHITACHIHimac CR21G II
Pression de gaz désoxygénée & Remplacer InjecteurSANSIN INDUSTRIALIP-12
Filtre à membrane jetable en acétate de celluloseADVANTEC25CS020ASTaille des pores 0.22 µ ; m, 25 mm de diamètre
Seringue jetableTermoSS-10SZ10 mL
Seringue jetableTermoSS-01T1 mL
Dulbecco' s Phosphate Tamponné Saline (-)NISSUI PHARMACEUTICAL5913
Seringue étanche au gazVICI Valco Instruments4075-15010Série A-2, 100 µ ; L
GC/MSshimadzuGCMS-QP2010ultra
GF/DWhatman1823-01010 mm de diamètre
Flacon en verreMaruemu0501-0620 mL
Bouchon en caoutchouc butyle grisMaruemu1306-03No.20-S
H2SO4Wako192-04696Réactif garanti
K2S2O8Wako169-11891Analyse de l’azote et du phosphore
grade KClWako163-03545Réactif garanti
KNO3Wako160-04035Réactif garanti
NaOHWako191-08625Analyse des composés azotés grade
NH4ClWako017-02995Réactif garanti
Tube à centrifuger en plastiqueASONE1-3500-2250 mL, VIO-50BN
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciensAmerican Type Culture Collection (ATCC)ATCC 13985Lyophilisé, la souche type de Pseudomonas aureofaciens Ruban d’étanchéité
PTFESigma-AldrichZ22188025 mm de largeur
Agitateur alternatifTAITEC0000207-000NR-10
Tube à essai à bouchon à visIWAKI84-025211 mL
Bouchon doublé de PTFE pour tube à essaiIWAKI84-0262
Bouillon de soja tryptiqueDifco Laboratories211825
à large ouverture

Références

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